大白菜ssr核心引物及品種檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了大白菜SSR核心引物及品種檢測試劑盒。本發(fā)明提供了鑒定待測大白菜品種的SSR引物組，由單獨使用的如下28個引物對組成，本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明開發(fā)的大白菜SSR核心引物及品種檢測試劑盒，可以用來鑒定待測大白菜品種，使得辨別品種真?zhèn)蔚牟僮髯兊脺?zhǔn)確便捷。
【專利說明】大白菜SSR核心引物及品種檢測試劑盒 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及大白菜SSR核心引物及品種檢測試劑盒。 【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著大白菜育種的發(fā)展，品種數(shù)目急劇增多，存在一品多名和一名多品等 現(xiàn)象，如何快速準(zhǔn)確地進行品種鑒定對白菜種業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。與田間小區(qū) 種植鑒定方法相比，DNA指紋圖譜技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響、實驗操作簡單和 周期短等優(yōu)勢。其中以PCR為基礎(chǔ)的第二代分子標(biāo)記技術(shù)SSR (Simple sequence repeat) 具有共顯性、多態(tài)性豐富、擴增帶型穩(wěn)定、操作簡單及成本低廉等特點，而且白菜基因組測 序已完成，使得規(guī)?；_發(fā)SSR標(biāo)記成為可能，定位于白菜分子遺傳圖譜上的SSR標(biāo)記已超 過2000個，這為SSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于大白菜品種鑒定具備了良好的前提條件。
[0003] 目前，在玉米上已經(jīng)開發(fā)了以SSR標(biāo)記為基礎(chǔ)的品種DNA指紋檢測試劑盒產(chǎn)品，可 以簡單快速地進行玉米品種的真?zhèn)舞b定。但在大白菜上相應(yīng)的研究起步較晚，尚無類似的 產(chǎn)品出現(xiàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供鑒定待測大白菜品種的SSR引物組。
[0005] 本發(fā)明提供的引物組，由單獨使用的如下28個引物對組成：
[0006] BVSSRA01-1，其由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的 單鏈DNA分子組成；
[0007] BVSSRA01-2,其由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的 單鏈DNA分子組成；
[0008] BVSSRA01-3,其由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的 單鏈DNA分子組成；
[0009] BVSSRA02-1，其由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的 單鏈DNA分子組成；
[0010] BVSSRA02-2,其由序列表中序列9所示的單鏈DNA分子和序列表中序列10所示的 單鏈DNA分子組成；
[0011] BVSSRA02-3,其由序列表中序列11所示的單鏈DNA分子和序列表中序列12所示 的單鏈DNA分子組成；
[0012] BVSSRA03-1，其由序列表中序列13所示的單鏈DNA分子和序列表中序列14所示 的單鏈DNA分子組成；
[0013] BVSSRA03-2,其由序列表中序列15所示的單鏈DNA分子和序列表中序列16所示 的單鏈DNA分子組成；
[0014] BVSSRA03-3,其由序列表中序列17所示的單鏈DNA分子和序列表中序列18所示 的單鏈DNA分子組成；
[0015] BVSSRA04-1，其由序列表中序列19所示的單鏈DNA分子和序列表中序列20所示 的單鏈DNA分子組成；
[0016] BVSSRA04-2,其由序列表中序列21所示的單鏈DNA分子和序列表中序列22所示 的單鏈DNA分子組成；
[0017] BVSSRA05-1，其由序列表中序列23所示的單鏈DNA分子和序列表中序列24所示 的單鏈DNA分子組成；
[0018] BVSSRA05-2,其由序列表中序列25所示的單鏈DNA分子和序列表中序列26所示 的單鏈DNA分子組成；
[0019] BVSSRA05-3,其由序列表中序列27所示的單鏈DNA分子和序列表中序列28所示 的單鏈DNA分子組成；
[0020] BVSSRA06-1，其由序列表中序列29所示的單鏈DNA分子和序列表中序列30所示 的單鏈DNA分子組成；
[0021] BVSSRA06-2,其由序列表中序列31所示的單鏈DNA分子和序列表中序列32所示 的單鏈DNA分子組成；
[0022] BVSSRA06-3,其由序列表中序列33所示的單鏈DNA分子和序列表中序列34所示 的單鏈DNA分子組成；
[0023] BVSSRA07-1，其由序列表中序列35所示的單鏈DNA分子和序列表中序列36所示 的單鏈DNA分子組成；
[0024] BVSSRA07-2,其由序列表中序列37所示的單鏈DNA分子和序列表中序列38所示 的單鏈DNA分子組成；
[0025] BVSSRA07-3,其由序列表中序列39所示的單鏈DNA分子和序列表中序列40所示 的單鏈DNA分子組成；
[0026] BVSSRA08-1，其由序列表中序列41所示的單鏈DNA分子和序列表中序列42所示 的單鏈DNA分子組成；
[0027] BVSSRA08-2,其由序列表中序列43所示的單鏈DNA分子和序列表中序列44所示 的單鏈DNA分子組成；
[0028] BVSSRA08-3,其由序列表中序列45所示的單鏈DNA分子和序列表中序列46所示 的單鏈DNA分子組成；
[0029] BVSSRA09-1，其由序列表中序列47所示的單鏈DNA分子和序列表中序列48所示 的單鏈DNA分子組成；
[0030] BVSSRA09-2,其由序列表中序列49所示的單鏈DNA分子和序列表中序列50所示 的單鏈DNA分子組成；
[0031] BVSSRA09-3,其由序列表中序列51所示的單鏈DNA分子和序列表中序列52所示 的單鏈DNA分子組成；
[0032] BVSSRA10-1，其由序列表中序列53所示的單鏈DNA分子和序列表中序列54所示 的單鏈DNA分子組成；
[0033] BVSSRA10-2,其由序列表中序列55所示的單鏈DNA分子和序列表中序列56所示 的單鏈DNA分子組成。
[0034] 上述的引物組中，每個所述引物對中各條引物的摩爾比為1:1。
[0035] 本發(fā)明的第二個目的是提供鑒定待測大白菜品種PCR試劑組。
[0036] 本發(fā)明提供的PCR試劑組，由單獨使用的28個PCR試劑組成；
[0037] 每個PCR試劑由上述引物組中的一種引物對、PCR反應(yīng)緩沖液和水組成；
[0038] 所述引物對中每條引物在其隸屬的PCR試劑中的終濃度均具體為0. 5 μ mol/L。
[0039] 本發(fā)明第三個目的是提供鑒定待測大白菜品種的PCR試劑盒。
[0040] 本發(fā)明提供的PCR試劑盒，包括上述的引物組或上述的PCR試劑組。
[0041] 上述的引物組或上述的PCR試劑組或上述的PCR試劑盒在鑒定待測大白菜品種中 的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0042] 上述的引物組或上述的PCR試劑組或上述的PCR試劑盒在大白菜品種真?zhèn)涡澡b別 中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[〇〇43] 本發(fā)明第三個目的是提供鑒定或輔助鑒定待測大白菜品種的方法。
[0044] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
[0045] 1)構(gòu)建DNA指紋圖譜庫；
[0046] 所述構(gòu)建DNA指紋圖譜庫的方法包括如下步驟：
[0047] (1)利用上述的引物組中的28種引物分別242個標(biāo)準(zhǔn)品種進行SSR擴增，得到不 同引物對的SSR擴增產(chǎn)物；
[0048] (2)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測不同引物對的SSR擴增產(chǎn)物，得到242個標(biāo)準(zhǔn) 品種不同引物對的電泳圖譜；
[0049] (3)將242個標(biāo)準(zhǔn)品種不同引物對的電泳圖譜利用GGT2. 0軟件構(gòu)建242個標(biāo)準(zhǔn)品 種DNA指紋圖譜，將242個標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA指紋圖譜組成DNA指紋圖譜庫；
[0050] 2)重復(fù)上述1)的方法中的1)-3)，僅將242個標(biāo)準(zhǔn)品種替換為待測樣本，其余步 驟不變，得到待測樣本DNA指紋圖譜；
[0051] 3)使用Mega5. 0軟件的UPGMA法比對待測樣本DNA指紋圖譜和所述DNA指紋圖譜 庫，若所述待測樣本DNA指紋圖譜為DNA指紋圖譜庫中哪個品種的DNA指紋圖譜，則所述待 測樣本為或候選為該品種；若所述待測樣本DNA指紋圖譜不為DNA指紋圖譜庫中哪個品種 的DNA指紋圖譜，則所述待測樣本不為或候選不為該品種；
[0052] 所述242個標(biāo)準(zhǔn)品種為表2和表3所示的品種。
[0053] 上述方法中，所述SSR擴增的模板為待測大白菜的基因組DNA。
[0054] 所述SSR擴增采用Touchdown程序：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性35s，62°C復(fù)性 45s(每個循環(huán)降低1°C )，72°C延伸45s，共10個循環(huán)；94°C變性35s，52°C復(fù)性45s，72°C延 伸45s，共23個循環(huán)；72°C延伸6min ;12°C保存。
[0055] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明開發(fā)的大白菜SSR核心引物及品種檢測試劑盒，可以 用來鑒定待測大白菜品種和新種質(zhì)，使得辨別品種真?zhèn)蔚牟僮髯兊脺?zhǔn)確便捷，利用該試劑 盒還包括大白菜譜帶標(biāo)準(zhǔn)，不僅檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠、操作便捷和成本低廉，而且有利于技術(shù) 的標(biāo)準(zhǔn)化，尤其是建立了每對引物擴增等位位點的參照標(biāo)準(zhǔn)樣品，它是本試劑盒的一個重 要組成部分，這為大白菜品種質(zhì)量監(jiān)控和品種權(quán)保護提供了技術(shù)支持。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0056] 圖1為引物BVSSRA01-3、BVSSRA05-3和BVSSRA07-1擴增等位基因的梯度分子量 標(biāo)準(zhǔn)
[0057] 圖2為242份品種的基因分型圖
[0058] 圖3為28對SSR核心引物對242份大白菜品種的聚類結(jié)果 【具體實施方式】
[0059] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0060] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061] 實施例1、大白菜28對SSR核心引物及含有其試劑盒的制備
[0062] 一、SSR核心引物的制備
[0063] 從大白菜2000多對SSR引物中經(jīng)過大量的篩選試驗挑選出來表1所示的28對 SSR核心引物。
[0064] 表1為28對SSR核心引物序列
[0065]
[0066]
【權(quán)利要求】
1.鑒定待測大白菜品種的SSR引物組，由單獨使用的如下28個引物對組成： BVSSRA01-1，其由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈 DNA分子組成； BVSSRA01-2,其由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈 DNA分子組成； BVSSRA01-3,其由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈 DNA分子組成； BVSSRA02-1，其由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單鏈 DNA分子組成； BVSSRA02-2,其由序列表中序列9所示的單鏈DNA分子和序列表中序列10所示的單鏈 DNA分子組成； BVSSRA02-3,其由序列表中序列11所示的單鏈DNA分子和序列表中序列12所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA03-1，其由序列表中序列13所示的單鏈DNA分子和序列表中序列14所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA03-2,其由序列表中序列15所示的單鏈DNA分子和序列表中序列16所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA03-3,其由序列表中序列17所示的單鏈DNA分子和序列表中序列18所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA04-1，其由序列表中序列19所示的單鏈DNA分子和序列表中序列20所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA04-2,其由序列表中序列21所示的單鏈DNA分子和序列表中序列22所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA05-1，其由序列表中序列23所示的單鏈DNA分子和序列表中序列24所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA05-2,其由序列表中序列25所示的單鏈DNA分子和序列表中序列26所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA05-3,其由序列表中序列27所示的單鏈DNA分子和序列表中序列28所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA06-1，其由序列表中序列29所示的單鏈DNA分子和序列表中序列30所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA06-2,其由序列表中序列31所示的單鏈DNA分子和序列表中序列32所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA06-3,其由序列表中序列33所示的單鏈DNA分子和序列表中序列34所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA07-1，其由序列表中序列35所示的單鏈DNA分子和序列表中序列36所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA07-2,其由序列表中序列37所示的單鏈DNA分子和序列表中序列38所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA07-3,其由序列表中序列39所示的單鏈DNA分子和序列表中序列40所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA08-1，其由序列表中序列41所示的單鏈DNA分子和序列表中序列42所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA08-2,其由序列表中序列43所示的單鏈DNA分子和序列表中序列44所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA08-3,其由序列表中序列45所示的單鏈DNA分子和序列表中序列46所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA09-1，其由序列表中序列47所示的單鏈DNA分子和序列表中序列48所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA09-2,其由序列表中序列49所示的單鏈DNA分子和序列表中序列50所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA09-3,其由序列表中序列51所示的單鏈DNA分子和序列表中序列52所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA10-1，其由序列表中序列53所示的單鏈DNA分子和序列表中序列54所示的單 鏈DNA分子組成； BVSSRA10-2,其由序列表中序列55所示的單鏈DNA分子和序列表中序列56所示的單 鏈DNA分子組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于：每個所述引物對中各條引物的摩爾比 為 1:1。
3. 鑒定待測大白菜品種PCR試劑組，由單獨使用的28個PCR試劑組成； 每個PCR試劑由權(quán)利要求1或2所述引物組中的一種引物對、PCR反應(yīng)緩沖液和水組 成； 所述引物對中每條引物在其隸屬的PCR試劑中的終濃度均具體為0. 5 μ mol/L。
4. 鑒定待測大白菜品種的PCR試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求 3所述的PCR試劑組。
5. 權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述的PCR試劑組或權(quán)利要求4或5所 述的PCR試劑盒在鑒定待測大白菜品種中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述的PCR試劑組或權(quán)利要求4或5所 述的PCR試劑盒在大白菜品種真?zhèn)涡澡b別中的應(yīng)用。
7. 鑒定或輔助鑒定待測大白菜品種的方法，包括如下步驟： 1)構(gòu)建DNA指紋圖譜庫； 所述構(gòu)建DNA指紋圖譜庫的方法包括如下步驟： (1)利用權(quán)利要求1或2所述的引物組中的28種引物分別242個標(biāo)準(zhǔn)品種進行SSR擴 增，得到不同引物對的SSR擴增產(chǎn)物； ⑵非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測不同引物對的SSR擴增產(chǎn)物，得到242個標(biāo)準(zhǔn)品種 不同引物對的電泳圖譜； (3)將242個標(biāo)準(zhǔn)品種不同引物對的電泳圖譜利用GGT2. 0軟件構(gòu)建242個標(biāo)準(zhǔn)品種 DNA指紋圖譜，將242個標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA指紋圖譜組成DNA指紋圖譜庫； 2) 重復(fù)上述1)的方法中的1)-3)，僅將242個標(biāo)準(zhǔn)品種替換為待測樣本，其余步驟不 變，得到待測樣本DNA指紋圖譜； 3) 使用Mega5. 0軟件的UPGMA法比對待測樣本DNA指紋圖譜和所述DNA指紋圖譜庫， 若所述待測樣本DNA指紋圖譜為DNA指紋圖譜庫中哪個品種的DNA指紋圖譜，則所述待測 樣本為或候選為該品種；若所述待測樣本DNA指紋圖譜不為DNA指紋圖譜庫中哪個品種的 DNA指紋圖譜，則所述待測樣本不為或候選不為該品種； 所述242個標(biāo)準(zhǔn)品種為表2和表3所不的品種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于： 所述SSR擴增的模板為待測大白菜的基因組DNA。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087668SQ201410323328
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】于拴倉, 蘇同兵, 隋光磊, 張鳳蘭, 余陽俊, 張德雙, 趙岫云, 盧桂香, 汪維紅, 徐家炳 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院