一套適于不結(jié)球白菜核酸指紋庫(kù)構(gòu)建的ssr引物組合及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了不結(jié)球白菜SSR核心引物及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的SSR引物組，由單獨(dú)使用的如下21個(gè)引物對(duì)組成，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明開(kāi)發(fā)的不結(jié)球白菜SSR核心引物及品種檢測(cè)試劑盒，可以用來(lái)鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種鑒定，使得辨別品種真?zhèn)蔚牟僮髯兊脺?zhǔn)確便捷。
【專利說(shuō)明】一套適于不結(jié)球白菜核酸指紋庫(kù)構(gòu)建的SSR引物組合及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一套適于不結(jié)球白菜核酸指紋庫(kù)構(gòu)建的SSR引物組合及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]不結(jié)球白菜起源于我國(guó)，是我國(guó)普遍栽培的蔬菜之一。近年來(lái)，不結(jié)球白菜的育種受到極大重視，生產(chǎn)上普遍栽培的雜交種就不下100多個(gè)。一方面，頻繁使用少數(shù)骨干自交系使得新品種的遺傳基礎(chǔ)日益狹窄，加大了優(yōu)異種質(zhì)資源鑒定和突破性種質(zhì)創(chuàng)新的難度；另一方面，品種的增多以及品種的相似性越來(lái)越高，這給品種管理、保護(hù)生產(chǎn)者和育種家的權(quán)益帶來(lái)了困難。目前種質(zhì)資源鑒定、品種的真實(shí)性鑒定和品種權(quán)保護(hù)的依據(jù)仍是形態(tài)指標(biāo)，具有受環(huán)境影響較大、鑒定工作量大、周期長(zhǎng)、受季節(jié)限制等劣勢(shì)。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)建立核酸指紋庫(kù)是鑒定種質(zhì)資源和保護(hù)新品種的有力工具。不結(jié)球白菜的核酸指紋庫(kù)構(gòu)建是進(jìn)行遺傳多樣性分析、種質(zhì)創(chuàng)新、品種質(zhì)量監(jiān)控和品種保護(hù)的基礎(chǔ)。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的SSR(Simple sequence repeat)分子標(biāo)記技術(shù)顯示了獨(dú)特的優(yōu)越性:SSR標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組、呈共顯性遺傳、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單及成本低廉等特點(diǎn)。目前公開(kāi)發(fā)表的白菜SSR引物已有2000多對(duì)，這為利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建不結(jié)球白菜核酸指紋庫(kù)提供了良好的前提條件。
[0003]至今為止，有關(guān)不結(jié)球白菜SSR核酸指紋庫(kù)構(gòu)建的報(bào)道還不多見(jiàn)，尚無(wú)用于核酸指紋庫(kù)構(gòu)建的專用試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種SSR引物組。
[0005]本發(fā)明提供的引物組，由單獨(dú)使用的如下21個(gè)引物對(duì)組成:
[0006]BRCSSRA01-1，其由序列表中序列I所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成；
[0007]BRCSSRA01-2，其由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈DNA分子組成；
[0008]BRCSSRA02-1，其由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈DNA分子組成；
[0009]BRCSSRA02-2，其由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單鏈DNA分子組成；
[0010]BRCSSRA03-1，其由序列表中序列9所示的單鏈DNA分子和序列表中序列10所示的單鏈DNA分子組成；
[0011]BRCSSRA03-2，其由序列表中序列11所示的單鏈DNA分子和序列表中序列12所示的單鏈DNA分子組成；
[0012]BRCSSRA04-1，其由序列表中序列13所示的單鏈DNA分子和序列表中序列14所示的單鏈DNA分子組成；
[0013]BRCSSRA05-1，其由序列表中序列15所示的單鏈DNA分子和序列表中序列16所示的單鏈DNA分子組成；
[0014]BRCSSRA05-2，其由序列表中序列17所示的單鏈DNA分子和序列表中序列18所示的單鏈DNA分子組成；
[0015]BRCSSRA06-1，其由序列表中序列19所示的單鏈DNA分子和序列表中序列20所示的單鏈DNA分子組成；
[0016]BRCSSRA06-2，其由序列表中序列21所示的單鏈DNA分子和序列表中序列22所示的單鏈DNA分子組成；
[0017]BRCSSRA06-3，其由序列表中序列23所示的單鏈DNA分子和序列表中序列24所示的單鏈DNA分子組成；
[0018]BRCSSRA07-1，其由序列表中序列25所示的單鏈DNA分子和序列表中序列26所示的單鏈DNA分子組成；
[0019]BRCSSRA07-2，其由序列表中序列27所示的單鏈DNA分子和序列表中序列28所示的單鏈DNA分子組成；
[0020]BRCSSRA08-1，其由序列表中序列29所示的單鏈DNA分子和序列表中序列30所示的單鏈DNA分子組成；
[0021]BRCSSRA08-2，其由序列表中序列31所示的單鏈DNA分子和序列表中序列32所示的單鏈DNA分子組成；
[0022]BRCSSRA09-1，其由序列表中序列33所示的單鏈DNA分子和序列表中序列34所示的單鏈DNA分子組成；
[0023]BRCSSRA09-2，其由序列表中序列35所示的單鏈DNA分子和序列表中序列36所示的單鏈DNA分子組成；
[0024]BRCSSRA09-3，其由序列表中序列37所示的單鏈DNA分子和序列表中序列38所示的單鏈DNA分子組成；
[0025]BRCSSRA10-1，其由序列表中序列39所示的單鏈DNA分子和序列表中序列40所示的單鏈DNA分子組成；
[0026]BRCSSRA10-2，其由序列表中序列41所示的單鏈DNA分子和序列表中序列42所示的單鏈DNA分子組成。
[0027]上述的引物組中，每個(gè)所述引物對(duì)中各條引物的摩爾比為1:1。
[0028]本發(fā)明第二個(gè)目的是提供鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的PCR試劑組。
[0029]本發(fā)明提供的PCR試劑組，由單獨(dú)使用的21個(gè)PCR試劑組成；
[0030]每個(gè)PCR試劑由權(quán)利要求1或2所述引物組中的一種引物對(duì)、PCR反應(yīng)緩沖液和水組成；
[0031]所述引物對(duì)中每條引物在其隸屬的PCR試劑中的終濃度均具體為0.5ymol/L。
[0032]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的PCR試劑盒。
[0033]本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述的PCR試劑組。
[0034]上述的引物組或上述的PCR試劑組或上述的PCR試劑盒在鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0035]上述的引物組或上述的PCR試劑組或上述的PCR試劑盒在不結(jié)球白菜品種真?zhèn)涡澡b別的應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明第四個(gè)目的是提供鑒定或輔助鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的方法。
[0037]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0038]I)構(gòu)建DNA指紋圖譜庫(kù)；
[0039]所述構(gòu)建DNA指紋圖譜庫(kù)的方法包括如下步驟:
[0040](I)利用上述的引物組中的21種引物分別46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行SSR擴(kuò)增，得到不同引物對(duì)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0041](2)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)不同引物對(duì)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種不同引物對(duì)的電泳圖譜；
[0042](3)將46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種不同引物對(duì)的電泳圖譜利用GGT2.0軟件構(gòu)建46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種DNA指紋圖譜，將46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA指紋圖譜組成DNA指紋圖譜庫(kù)；
[0043]2)重復(fù)上述I)的方法中的I) -3)，僅將46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種替換為待測(cè)樣本，其余步驟不變，得到待測(cè)樣本DNA指紋圖譜； 件的UPGMA法比對(duì)待測(cè)樣本DNA指紋圖譜和所述DNA指紋圖譜庫(kù)，若所述待測(cè)樣本DNA指紋圖譜為DNA指紋圖譜庫(kù)中哪個(gè)品種的DNA指紋圖譜，則所述待測(cè)樣本為或候選為該品種；若所述待測(cè)樣本DNA指紋圖譜不為DNA指紋圖譜庫(kù)中哪個(gè)品種的DNA指紋圖譜，則所述待測(cè)樣本不為或候選不為該品種；
[0045]所述46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種為表2所示的品種。
[0046]上述方法中，所述SSR擴(kuò)增的模板為待測(cè)不結(jié)球白菜的基因組DNA。
[0047]PCR擴(kuò)增程序采用Touchdown程序:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性35s，62 °C復(fù)性45s (每個(gè)循環(huán)降低1°C )，72°C延伸45s，共7個(gè)循環(huán)；94°C變性35s，55°C復(fù)性45s，72。。延伸45s，共27個(gè)循環(huán)；72°C延伸6min ;12°C保存。
[0048]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明開(kāi)發(fā)的不結(jié)球白菜SSR核心引物及品種檢測(cè)試劑盒，可以用來(lái)鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種鑒定，使得辨別品種真?zhèn)蔚牟僮髯兊脺?zhǔn)確便捷，其中SSR引物組合遍及白菜整個(gè)基因組且具有唯一擴(kuò)增位點(diǎn)，代表性較強(qiáng)；該試劑盒的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單快速，可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化，特別是試劑盒包含的每對(duì)SSR核心引物擴(kuò)增等位基因的梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)，它可以形成商品化產(chǎn)品，用于不結(jié)球白菜核酸指紋庫(kù)的構(gòu)建、種質(zhì)資源和育種材料遺傳多樣性分析和不結(jié)球白菜品種的真實(shí)性鑒定等。另外，SSR引物的梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)替代了參照品種，可直接作為電泳的分子量marker。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049]圖1為21對(duì)SSR核心引物擴(kuò)增等位基因的梯度分子量標(biāo)準(zhǔn)
[0050]圖2為引物BrcSSRA09_2擴(kuò)增部分自交系的檢測(cè)結(jié)果
[0051]圖3為46份不結(jié)球白菜自交系的基因分型圖
[0052]圖4為21對(duì)SSR核心引物對(duì)46份不結(jié)球白菜自交系的聚類圖

【具體實(shí)施方式】
[0053]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0054]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0055]實(shí)施例1、不結(jié)球白菜21對(duì)SSR核心引物、分子量標(biāo)準(zhǔn)及含有其試劑盒的制備
[0056]一、SSR核心引物的制備
[0057]從大白菜2000多對(duì)SSR引物中經(jīng)過(guò)大量的篩選試驗(yàn)挑選出來(lái)表1所示的21對(duì)SSR核心引物。
[0058]表1為21對(duì)SSR核心引物序列
[0059]

【權(quán)利要求】
1.鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種SSR引物組，由單獨(dú)使用的如下21個(gè)引物對(duì)組成: BRCSSRA01-1，其由序列表中序列I所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA01-2，其由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA02-1，其由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA02-2，其由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA03-1，其由序列表中序列9所示的單鏈DNA分子和序列表中序列10所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA03-2，其由序列表中序列11所示的單鏈DNA分子和序列表中序列12所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA04-1，其由序列表中序列13所示的單鏈DNA分子和序列表中序列14所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA05-1，其由序列 表中序列15所示的單鏈DNA分子和序列表中序列16所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA05-2，其由序列表中序列17所示的單鏈DNA分子和序列表中序列18所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA06-1，其由序列表中序列19所示的單鏈DNA分子和序列表中序列20所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA06-2，其由序列表中序列21所示的單鏈DNA分子和序列表中序列22所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA06-3，其由序列表中序列23所示的單鏈DNA分子和序列表中序列24所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA07-1，其由序列表中序列25所示的單鏈DNA分子和序列表中序列26所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA07-2，其由序列表中序列27所示的單鏈DNA分子和序列表中序列28所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA08-1，其由序列表中序列29所示的單鏈DNA分子和序列表中序列30所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA08-2，其由序列表中序列31所示的單鏈DNA分子和序列表中序列32所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA09-1，其由序列表中序列33所示的單鏈DNA分子和序列表中序列34所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA09-2，其由序列表中序列35所示的單鏈DNA分子和序列表中序列36所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA09-3，其由序列表中序列37所示的單鏈DNA分子和序列表中序列38所示的單鏈DNA分子組成；BRCSSRA10-1，其由序列表中序列39所示的單鏈DNA分子和序列表中序列40所示的單鏈DNA分子組成； BRCSSRA10-2，其由序列表中序列41所示的單鏈DNA分子和序列表中序列42所示的單鏈DNA分子組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于:每個(gè)所述引物對(duì)中各條引物的摩爾比為 1:1。
3.鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的PCR試劑組，由單獨(dú)使用的21個(gè)PCR試劑組成； 每個(gè)PCR試劑由權(quán)利要求1或2所述引物組中的一種引物對(duì)、PCR反應(yīng)緩沖液和水組成； 所述引物對(duì)中每條引物在其隸屬的PCR試劑中的終濃度均具體為0.5μπι01/1。
4.鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的PCR試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述的PCR試劑組。
5.權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述的PCR試劑組或權(quán)利要求4或5所述的PCR試劑盒在鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述的PCR試劑組或權(quán)利要求4或5所述的PCR試劑盒在不結(jié)球白菜品種真?zhèn)涡澡b別的應(yīng)用。
7.鑒定或輔助鑒定待測(cè)不結(jié)球白菜品種的方法，包括如下步驟: 1)構(gòu)建DNA指紋圖譜庫(kù)； 所述構(gòu)建DNA指紋圖譜庫(kù)的方法包括如下步驟: (1)利用權(quán)利要求1或2所述的引物組中的21種引物分別46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行SSR擴(kuò)增，得到不同引物對(duì)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物； (2)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)不同引物對(duì)的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種不同引物對(duì)的電泳圖譜； (3)將46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種不同引物對(duì)的電泳圖譜利用GGT2.0軟件構(gòu)建46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種DNA指紋圖譜，將46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種的DNA指紋圖譜組成DNA指紋圖譜庫(kù)； 2)重復(fù)上述I)的方法中的1)_3)，僅將46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種替換為待測(cè)樣本，其余步驟不變，得到待測(cè)樣本DNA指紋圖譜； 4)使用Mega5.0軟件的UPGMA法比對(duì)待測(cè)樣本DNA指紋圖譜和所述DNA指紋圖譜庫(kù)，若所述待測(cè)樣本DNA指紋圖譜為DNA指紋圖譜庫(kù)中哪個(gè)品種的DNA指紋圖譜，則所述待測(cè)樣本為或候選為該品種；若所述待測(cè)樣本DNA指紋圖譜不為DNA指紋圖譜庫(kù)中哪個(gè)品種的DNA指紋圖譜，則所述待測(cè)樣本不為或候選不為該品種； 所述46個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品種為表2所示的品種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于: 所述SSR擴(kuò)增的模板為待測(cè)不結(jié)球白菜的基因組DNA。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104073561SQ201410324185
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
【發(fā)明者】于拴倉(cāng), 蘇同兵, 隋光磊, 張鳳蘭, 余陽(yáng)俊, 張德雙, 趙岫云, 盧桂香, 汪維紅, 徐家炳 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院