轉(zhuǎn)錄因子DksA基因的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)錄因子DksA基因的新用途。Photorhabdus?luminescens?LN2中的dksA基因在調(diào)控P.luminescens?LN2菌落對色素吸收、P.luminescens?LN2的熒光蛋白產(chǎn)生量、P.luminescens?LN2菌落的粘性、P.luminescens?LN2對大蠟螟的毒力、P.luminescens?LN2對Heterorhabditis?bacteriophora?H06線蟲的毒力、P.luminescens?LN2對H.indica?LN2感染期線蟲的恢復(fù)中的應(yīng)用。dksA突變對共生細(xì)菌LN2的生理生化特征產(chǎn)生明顯影響。突變菌株LN2△dksA明顯延遲LN2感染期線蟲的恢復(fù)和懷卵；喪失了對非特異共生線蟲H.bacteriophora?H06的毒性，且能支持H06線蟲的生長繁殖；對大蠟螟的注射毒力顯著降低；但未顯著影響共生細(xì)菌的生長、LN2線蟲的體外培養(yǎng)產(chǎn)量。
【專利說明】轉(zhuǎn)錄因子DksA基因的新用途

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)錄因子DksA基因的新用途。

【背景技術(shù)】：
[0002] 昆蟲病原線蟲是一種高效、安全的生物殺蟲劑。昆蟲病原斯氏屬（Steinernema) 和異小桿屬（Heterorhabditis)線蟲分別與致病桿菌屬（Xenorhabdus)和發(fā)光桿狀菌 屬（Photorhabdus)細(xì)菌共生（Forst and Clarke, 2002)。該兩屬共生細(xì)菌屬于腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)，革蘭氏陰性，是致死昆蟲的毒力因子。這類線蟲規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)成 熟，被廣泛應(yīng)用于防治草坪、農(nóng)林、花舟及牧草等害蟲（Georgis et al.，2006 ;Kaya, 2006)， 在害蟲綜合治理方面發(fā)揮了顯著作用（El-Borai et al.，2012)。
[0003] 種間特異殺線蟲?；约垂采?xì)菌能夠產(chǎn)生殺線蟲毒素致死非特異性共生線蟲 的專化性（Han and Ehlers，2001)。這種種間殺蟲作用使共生菌在自然環(huán)境下具有競爭優(yōu) 勢，對線蟲之間的營養(yǎng)競爭也有重要的作用。共生細(xì)菌P. luminescens LN2產(chǎn)生的信號物 質(zhì)能夠誘導(dǎo)H. bacteriophora H06感染期線蟲恢復(fù)，但LN2細(xì)菌能夠分泌殺H06線蟲的毒 素，使非特異共生線蟲不能利用LN2細(xì)菌進(jìn)行生長和繁殖（Han and Ehler，1998)。將共生 細(xì)菌上清過濾液無菌H06感染期線蟲仍然具有毒性，且濾液經(jīng)過80°C熱處理后失去致死能 力（Han and Ehlers，1999)。預(yù)測至少有7種公認(rèn)的蛋白（包括DsbA，HlpA，RhlE，RplC, NamB)和2種推定蛋白涉及LN2細(xì)菌對H06的殺蟲作用（Qiu et al.，2012)。
[0004] P. luminescens LN2特有的殺線蟲毒性相關(guān)基因 namA已被分離和鑒定。 P. luminescens LN2的namA突變體能支持H06線蟲的生長與繁殖，喪失了對非特異共生的 H06線蟲的致死作用（Qiu et al.，2009)。在大腸桿菌中表達(dá)該蛋白時，NamA重組蛋白對 H06感染期線蟲無直接的殺蟲毒性（丘雪紅，2009)，所以namA基因?qū)€蟲的種間特異性殺 蟲的毒性的分子作用機(jī)制仍有待研究。另外，namA基因是P. luminescens LN2所特有，這 說明每個共生菌菌株對非特異共生線蟲的殺線蟲活性可能由不同的基因控制，共生菌種間 特異的殺線蟲機(jī)制仍有待深入研究。
[0005] DksA是和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域一起結(jié)合到RNA聚合酶次級通道的的轉(zhuǎn)錄因 子（Stebbins, 1995 ;Perederina, 2004)。最近的研究結(jié)果表明，DksA能夠消除本身 就存在的損傷以外的其它損傷（Tehranchi, 2010)，能夠減少DNA復(fù)制過程的損傷 (Trautinger, 2005)。DksA是轉(zhuǎn)錄起始因子，它和ppGpp -起來調(diào)節(jié)rRNA和許多其它對饑 餓應(yīng)激的基因的轉(zhuǎn)錄（Paul，2004)。另外，DksA也作用于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下， 大腸桿菌基因表達(dá)譜的改變是RNA聚合酶（RNAP)，ppGpp和DksA相互作用的結(jié)果。ppGpp 和DksA都能使轉(zhuǎn)錄起到相反的效應(yīng)，rRNA和tRNA以及細(xì)胞增殖有關(guān)的基因的表達(dá)顯著下 調(diào)，同時耐受壓力和饑餓的基因的表達(dá)上調(diào)（Kanjee，2012)。在存在DksA和提高ppGpp水 平時，轉(zhuǎn)錄既能激活也能鈍化，激活和抑制取決于啟動子的內(nèi)在特性。在嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)中，dksA 基因的過量表達(dá)能夠補(bǔ)償信號素 ppGpp的缺失。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，在昆蟲病原線蟲-共 生細(xì)菌體系中，P. luminescens LN2菌株的rpoB基因的缺失引起DksA蛋白下調(diào)，而且rpoB 基因缺失突變也引起共生細(xì)菌喪失殺線活性，所以dksA基因可能與線蟲的殺線作用有關(guān) (Qiu et al，2012)。因此研究dksA基因缺失對細(xì)菌與線蟲共生關(guān)系的影響有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0006] 本發(fā)明的目的是提供轉(zhuǎn)錄因子DksA基因的新用途。
[0007] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P. luminescens LN2中dksA基因突變的菌株具有以下性 質(zhì)：
[0008] 1.突變菌株LN2 Λ dksA在菌落形態(tài)、菌落粘性、熒光、色素分泌等特征與野生型菌 株具有明顯差異。
[0009] 野生型菌株LN2-A在NBTA板上呈現(xiàn)黃綠色，而突變株LN2 Λ dksA的菌落在NBTA 平板上呈深綠色而且突變菌株的菌落明顯比野生型大，說明dksA基因的缺失導(dǎo)致了菌落 對色素的吸收。將培養(yǎng)了 48h的野生型菌株LN2-A和突變株LN2 Λ dksA菌液置于黑暗 中觀察，發(fā)現(xiàn)兩者都產(chǎn)生了熒光。將培養(yǎng)3d的LB平板上的野生型菌株LN2-A和突變株 LN2 Λ dksA菌落，在黑暗上觀察熒光時發(fā)現(xiàn)LN2-A有強(qiáng)熒光，突變株LN2 Λ dksA的熒光很 微弱，說明dksA基因的缺失導(dǎo)致菌株熒光蛋白的產(chǎn)生量減少。野生型菌株LN-A和突變菌 株LN2 Λ dksA的菌落均具有粘性，但野生型的粘性強(qiáng)于突變菌株。而且在LB平板上培養(yǎng) 3d時野生型菌株的菌落顏色為深黃色，而突變菌株的顏色為微黃色。
[0010] 2. LN2 Λ dksA菌株對大蠟螟的注射毒力顯著降低。
[0011] 野生型的注射毒力明顯高于突變菌株。當(dāng)注射濃度為100CFU和1000CFU野生型 菌株對大蠟螟的注射死亡率均顯著高于突變菌株的注射毒力?；パa(bǔ)菌株對dksA基因的缺 失有一定的補(bǔ)償作用。
[0012] 3. dksA基因的敲除使P. luminescens LN2細(xì)菌失去對非特異共生線蟲 H. bacteriophora H06的毒性，且能支持H06線蟲繁殖。
[0013] 野生型菌株LN2-A與H06線蟲共培養(yǎng)體系中，LN2菌株能夠支持H06線蟲恢復(fù)， 但是因?yàn)長N2菌株對線蟲的毒力作用，不能產(chǎn)生大母蟲和二代小蟲。野生型菌株的死亡率 顯著高于缺失突變菌株。突變菌株LN2 Λ dksA與H06線蟲共培養(yǎng)體系的線蟲懷卵比率 和懷小蟲比率顯著高于野生型菌株，說明缺失突變菌株已經(jīng)喪失了部分殺蟲活性，能夠支 持H06線蟲產(chǎn)生二代小蟲。野生型菌株H06-H06線蟲共培養(yǎng)體系中，線蟲的懷小蟲比率分 顯著高于突變菌株的，說明突變菌株對雖然能夠支持H06線蟲的生長繁殖但是支持的效果 沒有H06菌株好，野生型菌株H06與H06線蟲共培養(yǎng)體系的線蟲發(fā)育速度明顯比突變菌株 LN2 Λ dksA快。突變菌株的互補(bǔ)菌株在IJ、RJ3、F4、AE和AJ和突變菌株均沒有明顯差異， 但是互補(bǔ)菌株的死亡率略高于突變菌株，說明互補(bǔ)菌株部分補(bǔ)償了 dksA基因的缺失。
[0014] 結(jié)果表明：敲除dksA基因后，LN2菌對H06線蟲的毒性減弱，且能產(chǎn)生二代小蟲。 這說明dksA基因?qū)采?xì)菌LN2對共生線蟲的種間殺蟲能力具有重要的調(diào)控作用。
[0015] 4. LN2 Λ dksA菌株顯著延遲H. indica LN2感染期線蟲的恢復(fù)和雌雄同體母蟲的 懷卵。
[0016] 生物測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：野生型菌株LN2和H. indica LN2線蟲組合培養(yǎng)時，LN2 線蟲的生長發(fā)育明顯比突變菌株LN2 Λ dksA和H. indica LN2線蟲組合培養(yǎng)時線蟲的生長 發(fā)育快。
[0017] 5. LN2 Λ dksA菌株不影響H. indica LN2線蟲于海綿固體培養(yǎng)基中的產(chǎn)量。
[0018] 野生型菌株LN2-A和突變菌株LN2 Λ dksA和LN2線蟲組合培養(yǎng)時，LN2線蟲的產(chǎn) 量沒有顯著差異。所以dksA基因?qū)M合培養(yǎng)時線蟲的產(chǎn)量沒有影響。
[0019] 因此，本發(fā)明提供 P. luminescens LN2 中的 dksA 基因在調(diào)控 P. luminescens LN2 菌落對色素吸收、Ρ· luminescens LN2的突光蛋白產(chǎn)生量、Ρ· luminescens LN2菌落的粘性、 P. luminescens LN2 對大錯螺的毒力、P. luminescens LN2 對 H.bacteriophora H06 線蟲毒 力、P. luminescens LN2對H. indica LN2感染期線蟲的恢復(fù)中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的P. luminescens LN2中的dksA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第 898-1353位堿基所示。
[0021] dksA突變對共生細(xì)菌LN2的生理生化特征（色素、熒光等）產(chǎn)生明顯影響。突 變菌株LN2 Λ dksA明顯延遲LN2感染期線蟲的恢復(fù)和懷卵；喪失了對非特異共生線蟲 H. bacteriophora H06的毒性，且能支持H06線蟲的生長繁殖；對大錯螟的注射毒力顯著降 低；但未顯著影響共生細(xì)菌的生長、LN2線蟲的體外培養(yǎng)產(chǎn)量。由此可見，dksA基因在昆蟲 病原線蟲-共生細(xì)菌的共生關(guān)系方面具有重要功能。這些結(jié)果為研究這一共生體的共生性 和病原性的分子機(jī)理提供參考。
[0022] 本發(fā)明的P. luminescens LN2是現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)菌，公開于非專利文獻(xiàn)： Qiu XH,Han RC,Yan X, Liu MX,Cao L,Yoshiga T,Kondo E.Identification and Characterization of a Novel Gene Involved in the trans-Specific Nematicidal Activity of Photorhabdus luminescens LN2[J]. Appl Environ Microb, 2009, 75(12):42 21-4223. 2009.該菌株 申請人:也持有，保證自申請日起20年內(nèi)向公眾提供。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0023] 圖1是融合PCR的技術(shù)圖解，其中1. P1和P2擴(kuò)增基因的上游序列；2. P5和P6擴(kuò) 增基因的下游序列；3. P3和P4擴(kuò)增抗性標(biāo)記基因 cat ;4.引物P2和P3、P4和P5分別在5' 末端有20bp的堿基反向互補(bǔ)，因而在進(jìn)行融合PCR第一步擴(kuò)增時的無引物擴(kuò)增可以將cat 基因插入到基因的上下游同源臂間，形成融合片段。此時形成的融合片段較少，需要進(jìn)行第 二步PCR反應(yīng)；
[0024] 圖2是dksA基因的上游序列和cat基因的PCR擴(kuò)增，dksA基因的上游序列和cat 基因的PCR擴(kuò)增；
[0025] 圖 3 是融合 PCR 第二步，M. DL5000DNA Marker ;L dksA: :Cm 融合片段（2657bp);
[0026] 圖4是dksA: :Cm融合片段陽性轉(zhuǎn)化子鑒定，E DL2000DNA Marker ;l-9. dksA: :Cm(2858bp左右）基因轉(zhuǎn)化子；10.為空白對照；
[0027] 圖 5 是 pEASY?-Blunt-dksA: :Cm 質(zhì)粒的 BamHI 和 spel 雙酶切圖譜，M. DL5000DNA Marker ;1 和 2pEASY?-Blunt-dksA: :Cm 雙酶切（BamH I 和 spe I);
[0028] 圖6是自殺質(zhì)粒的單酶切和雙酶切圖譜，M. XHindlllDNA Marker ;l.pKNG101質(zhì) 粒雙酶切（BamH I和spe I ;2、3.分別為BamHI單酶切和spel單酶切；4. pKNGlOl質(zhì)粒；
[0029] 圖7是轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒以及酶切鑒定圖譜，Μ. λ Hind III DNA Marker ; I. pKNGlOl-dksA: :Cm 雙酶切（BamH I 和 spe I) ;2. pKNGlOl-dksA: :Cm 質(zhì)粒；
[0030] 圖 8 是 PCR 轉(zhuǎn)化子鑒定，M. DL5000DNA Marker ;1-16 為 dksA: :Cm 陽性轉(zhuǎn)化子； 17LN2-W野生型對照；
[0031] 圖9是菌株的生長曲線，注：四個菌株分別為野生型菌株LN2_A、dksA缺失突變菌 株LN2 Λ dksA、攜帶空的pLAFR3質(zhì)?；パa(bǔ)對照菌株LN2 Λ dksA/PLA以及攜帶目的基因 dksA的pLAFR3質(zhì)粒的互補(bǔ)菌株LN2 Λ dksA/PLA-dksA。該實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個重復(fù)，圖中數(shù)值為 各個時間點(diǎn)共生菌的〇D_的平均值；
[0032] 圖10是共生細(xì)菌對H06感染期線蟲生物測定，注：IJ表示感染期幼蟲， RJ3(recovered J3)表示恢復(fù)的3齡期幼蟲、J4表示4齡期幼蟲、AE(adult with eggs)表示 懷卵成蟲、AJ(adultwith juveniles)表示體內(nèi)的卵已孵化成下一代幼蟲的成蟲、DN(dead nematodes)表示死亡的線蟲、TR(total recovery)表示恢復(fù)的線蟲（RJ3+J4+AE+AJ)。圖 中相同字母表示方差分析差異不顯著，不同字母表示差異顯著（P < 0.05%);
[0033] 圖11是共生細(xì)菌上清液誘導(dǎo)H. indica LN2感染期線蟲恢復(fù)的生物測定，注：IJ表 示感染期幼蟲、DN(dead nematodes)表示死亡的線蟲、R(total recovery)表示恢復(fù)的線 蟲。圖中相同字母表示方差分析差異不顯著，不同字母表示差異顯著（P < 0.05%);
[0034] 圖 12 是突變菌株 LN2 Λ dksA、LN2 Λ dksA/pLA 和 LN2 Λ dksA/pLA-dksA 及野 生型LN2-A與H. indica LN2線蟲共培養(yǎng)第一天時對LN2線蟲恢復(fù)的影響，注：IJ表示感 染期幼蟲，RJ3(reC〇vered J3)表示恢復(fù)的3齡期幼蟲、J4表示4齡期幼蟲、AE(adult with eggs)表示懷卵成蟲、AJ(adult with juveniles)表示體內(nèi)的卵已孵化成下一代幼 蟲的成蟲、DN(dead nematodes)表示死亡的線蟲、TR(total recovery)表示恢復(fù)的線蟲 (RJ3+J4+AE+AJ)。圖中相同字母表示方差分析差異不顯著，不同字母表示差異顯著（p < 0. 05% )；
[0035] 圖 13 是突變菌株 LN2 Λ dksA、LN2 Λ dksA/pLA 和 LN2 Λ dksA/pLA-dksA 及野 生型LN2-A與H. indica LN2線蟲共培養(yǎng)第二天時對LN2線蟲恢復(fù)的影響，注：IJ表示感 染期幼蟲，RJ3(reC〇vered J3)表示恢復(fù)的3齡期幼蟲、J4表示4齡期幼蟲、AE(adult with eggs)表示懷卵成蟲、AJ (adult with juveniles)表示體內(nèi)的卵已孵化成下一代幼 蟲的成蟲、DN(dead nematodes)表示死亡的線蟲、TR(total recovery)表示恢復(fù)的線蟲 (RJ3+J4+AE+AJ)。圖中相同字母表示方差分析差異不顯著，不同字母表示差異顯著（p < 0. 05% )；
[0036] 圖 14 是突變菌株 LN2 Λ dksA、LN2 Λ dksA/pLA 和 LN2 Λ dksA/pLA-dksA 及野 生型LN2-A與H. indica LN2線蟲共培養(yǎng)第三天時對LN2線蟲恢復(fù)的影響，注：IJ表示感 染期幼蟲，RJ3(reC〇vered J3)表示恢復(fù)的3齡期幼蟲、J4表示4齡期幼蟲、AE(adult with eggs)表示懷卵成蟲、AJ (adult with juveniles)表示體內(nèi)的卵已孵化成下一代幼 蟲的成蟲、DN(dead nematodes)表示死亡的線蟲、TR(total recovery)表示恢復(fù)的線蟲 (RJ3+J4+AE+AJ)。圖中相同字母表示方差分析差異不顯著，不同字母表示差異顯著（p < 0. 05% )；
[0037] 圖 15 是突變菌株 LN2 Λ dksA、LN2 Λ dksA/pLA 和 LN2 Λ dksA/pLA-dksA 及野 生型LN2-A與H. indica LN2線蟲共培養(yǎng)第四天時對LN2線蟲恢復(fù)的影響，注：IJ表示感 染期幼蟲，RJ3(reC〇vered J3)表示恢復(fù)的3齡期幼蟲、J4表示4齡期幼蟲、AE(adult with eggs)表示懷卵成蟲、AJ (adult with juveniles)表示體內(nèi)的卵已孵化成下一代幼 蟲的成蟲、DN(dead nematodes)表示死亡的線蟲、TR(total recovery)表示恢復(fù)的線蟲 (RJ3+J4+AE+AJ)。圖中相同字母表示方差分析差異不顯著，不同字母表示差異顯著（p < 0. 05% )；
[0038] 圖16是突變株LN2-dksA及野生型LN2-A與H. indica LN2固體培養(yǎng)感染期線蟲 產(chǎn)量，注：圖中相同字母表示方差分析差異不顯著，不同字母表示差異顯著（P < 0.05%)。

【具體實(shí)施方式】：
[0039] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0040] 實(shí)施例1 :
[0041] P. luminescens LN2細(xì)菌基因組的提?。喊凑粘Ｒ?guī)方法提取P. luminescens LN2 細(xì)菌基因組DNA。
[0042] 2. 5. 5. 1、重組克隆載體 pEASYTM-Blunt-dksA: :Cm 的構(gòu)建
[0043] 根據(jù)P. luminescens LN2的基因組測序結(jié)果中，獲得dksA基因片段及其上下游基 因的堿基序列，由此設(shè)計(jì)特異性引物，以LN2基因組為模板擴(kuò)增dksA基因上下游序列及標(biāo) 記基因 cat。再通過融合PCR獲得同源重組的融合片段dksA::Cm，該實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物序 列如表1所示，重疊 PCR的原理如圖1所示。
[0044] dskA基因序列及其上下游序列如SEQ ID NO. 1所示，其中第1-897位堿基為dskA 基因的上游序列，第898-1353位堿基為dskA基因序列，第1354-2241位堿基序列為dskA 基因的下游序列。
[0045] 表1 :片段擴(kuò)增所需要的引物
[0046]

【權(quán)利要求】
1. Photorhabdus luminescens LN2 中的 dksA 基因在調(diào)控 P. luminescens LN2 菌 落對色素吸收、P. luminescens LN2的焚光蛋白產(chǎn)生量、P. luminescens LN2菌落的 粘性、Ρ· luminescens LN2 對大錯螟的毒力、Ρ· luminescens LN2 對 Heterorhabditis bacteriophora H06 線蟲的毒力、P. luminescens LN2 對 H. indica LN2 感染期線蟲的恢復(fù) 中的應(yīng)用，所述的P. luminescens LN2中的dksA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第 898-1353位堿基所示。
【文檔編號】C12R1/01GK104195144SQ201410328197
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】丘雪紅, 胡素麗, 韓日疇 申請人:廣東省昆蟲研究所