一株產(chǎn)多不飽和脂肪酸的菌株及其篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產(chǎn)多不飽和脂肪酸(PUFAs)的菌株及其篩選方法，所述菌株分類學命名為卷枝毛霉(Mucor?circinelloides)，保藏編號為：CGMCC?No.8361；所述篩選方法包括以下步驟：(1)低溫初篩；(2)蘇丹黑染色復篩；(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)和(4)氣相色譜檢測菌株胞內(nèi)脂肪酸含量。本發(fā)明得到的菌株可高產(chǎn)多不飽和脂肪酸；利用本發(fā)明的篩選方法能夠快速、重復獲得該菌株，具有成本低廉、可應用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。
【專利說明】一株產(chǎn)多不飽和脂肪酸的菌株及其篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一株菌株及其篩選方法，尤其涉及一株產(chǎn)多不 飽和脂肪酸的菌株及其篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 多不飽和脂肪酸（PUFAs)是指含有兩個或兩個以上碳-碳雙鍵且碳原子數(shù)為 16-22的直鏈脂肪酸。根據(jù)第一個雙鍵在碳鏈中所處的位置，PUFAs可分為ω-3、ω-6和 ω -9等系列，但具有重要生物學意義的是ω -3和ω -6PUFAs。ω -3PUFAs主要包括α -亞 麻酸（ALA)，十八碳四烯酸，二十碳四烯酸，二十碳五烯酸（ΕΡΑ)，二十二碳五烯酸（DPA)以 及二十二碳六烯酸（DHA)。c〇-6PUFAs主要包括亞油酸（LA)，γ -亞麻酸（GLA)，雙高γ - 亞麻酸（DGLA)以及花生四烯酸（AA)。
[0003] 研究表明PUFAs對人體有眾多保健功能：PUFAs能夠顯著改變脂蛋白代謝，從而降 低心血管疾病的發(fā)病率；具有抗炎癥、抗腫瘤及治療精神分裂等功能；PUFAs通過改變脂類 代謝而降低動脈粥樣硬化的發(fā)病率，還具有免疫調(diào)節(jié)和美容等功能。
[0004] 人和動物能自行合成所需的飽和脂肪酸及部分單不飽和脂肪酸，但無法合成 PUFAs。所以必須從膳食中攝入LA、GLA，然后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其他長鏈PUFAs。但隨著年齡的 增加，這種轉(zhuǎn)化能力急劇衰弱，因此成年人需要從膳食中補充幾乎所有的PUFAs。目前LA、 GLA主要來源于植物種子，但受氣候和地域的限制，并且植物資源易受農(nóng)藥污染的威脅，20 碳以上的長鏈PUFAs主要來自深海魚油，但是這種PUFAs風味較差，而且海洋污染、魚類資 源枯竭等問題的加重也導致魚油來源的功能油脂無法滿足市場要求。因此，成本低廉，易規(guī) ?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PUFAs有著廣闊的市場前景。獲得具有自主知識產(chǎn) 權(quán)的功能油脂生產(chǎn)用菌有著重要的應用價值和經(jīng)濟效益。
[0005] 國內(nèi)外研究者對產(chǎn)PUFAs的菌種篩選研究表明，來自高緯度土樣中的霉菌，尤其 是被孢霉屬的一些絲狀真菌，合成長鏈多不飽和脂肪酸的應用潛力比較大。
[0006] 許本波等人，以深黃被孢霉（Mortierella isabellina As3. 3410)為出發(fā)菌株，經(jīng) 微波誘變和紫外誘變，乙酰水楊酸與低溫（15°C )相結(jié)合的篩選方法，獲得1株高產(chǎn)多不飽 和脂肪酸菌株A35-4 (高產(chǎn)PUFAs深黃被孢霉菌株的篩選，許本波等，遺傳，2011，30 (10): 1147-1152)。李三暑采用二聯(lián)吡啶作為誘變劑，誘導被孢霉屬菌株L8突變，篩選高產(chǎn)不 飽和脂肪酸的突變株L83,經(jīng)過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)整，進一步提高碘值到102. 3,提高 了 27.56% (被孢霉菌株L8誘變及其發(fā)酵條件的研究，江西農(nóng)業(yè)大學學報，2000, 22(3): 434-438)。呂晴等采用氣相色譜-質(zhì)譜對采自云南白馬雪山土壤中并經(jīng)分離和發(fā)酵培養(yǎng)的 被孢霉菌株SM96的菌絲體油脂中脂肪酸組成進行了定性分析和峰面積相對含量測定，共 檢測出30種脂肪酸，其中多不飽和脂肪酸含量為62. 4% (被孢霉菌絲體脂肪酸組成的氣相 色譜-質(zhì)譜分析，呂晴等，2003, 22 (2) :22-24)。
[0007] 除了利用被孢菌屬的菌株外，還有利用工程化的含油酵母解脂耶氏酵母菌株生產(chǎn) 多不飽和脂肪酸，例如 CN101437952A、CN101437951A 和 CN102803289A。
[0008] CN101591617A公開了一種二十二碳六烯酸生產(chǎn)菌株及其誘變篩選方法和應用，其 利用紫外化學誘變篩選方法得到的菌株分類命名為隱甲藻（Cypthecodinium cohnii)。
[0009] 目前現(xiàn)有技術(shù)中通常采用誘變篩選而獲得產(chǎn)多不飽和脂肪酸的菌株，存在變異 大，無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一株菌株及其篩選方法，特別是一株高產(chǎn)多不飽和脂肪酸 的菌株及其篩選方法。
[0011] 為達到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0012] 在第一方面，本發(fā)明提供了一株產(chǎn)不飽和脂肪酸的菌株，其分類學命名為卷枝 毛霉（Mucor circinelloides)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學微生物研究所，保藏日期 為2013年10月17日，保藏編號為CGMCC No. 8361。
[0013] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)不飽和脂肪酸（PUFAs)菌株（Mucor circinelloides)的菌落 形態(tài)為：培養(yǎng)初期（1-2天）菌落呈白色，氣生菌絲生長旺盛并較長，培養(yǎng)2天后有黑色孢子 附著在氣生菌絲上，培養(yǎng)3-5天菌株菌落青黑色，蔓延至整個斜面，疏松平展。
[0014] 在第二方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的產(chǎn)不飽和脂肪酸菌株的篩選方法， 所述方法包括以下步驟：
[0015] (1)低溫初篩：將土壤樣品的稀釋液涂布于平板上，低溫下培養(yǎng)；
[0016] (2)蘇丹黑染色復篩：將低溫培養(yǎng)平板上長出的菌落挑出，用蘇丹黑染液進行染 色制片，鏡檢；
[0017] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：將復篩得到的菌株進行種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，收集并干燥菌 體；
[0018] ⑷氣相色譜檢測：提取上述干燥菌體中的胞內(nèi)脂肪酸，氣相色譜檢測其含量。
[0019] 步驟（1)所述平板培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；所述PDA培養(yǎng)基含有如下組分：馬鈴薯 200g/L ;葡萄糖20g/L ;瓊脂17g/L ;將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5. 8,115°C滅菌20min。
[0020] 優(yōu)選地，所述的低溫培養(yǎng)在3-10°C下進行，培養(yǎng)5-9天。
[0021] 本發(fā)明采用5°C低溫條件下培養(yǎng)，微生物生長很慢，而且其中大多是濕潤的細菌 菌落，少數(shù)的絲狀真菌菌落；采用該低溫條件培養(yǎng)抑制了很多微生物的生長，而能合成較高 PUFAs的菌株則生存下來。
[0022] 步驟（2)所述的篩選方法中蘇丹黑染液由蘇丹黑B保存液40mL加碳酸磷酸緩沖 液20mL混合過濾而成。
[0023] 優(yōu)選地，所述蘇丹黑B保存液的配制為：蘇丹黑B0. 15g加50mL無水乙醇混勻，放 置2天，時常搖動，使蘇丹黑B完全溶解。
[0024] 優(yōu)選地，所述的碳酸磷酸緩沖液由a、b兩種溶液混合而成；a溶液的配制為：石碳 酸結(jié)晶8g加無水乙醇15mL，混勻；b溶液的配制為：十二水合磷酸氫二鈉0. 15g加蒸餾水 50mL，混勻。
[0025] 步驟（2)所述的篩選方法中，選用光學顯微鏡進行鏡檢，物鏡為40X，目鏡為 10X。
[0026] 步驟⑶所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度30°C，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)5天。
[0027] 所述的種子培養(yǎng)為：將篩選得到的菌株接種到裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形 瓶中，30°C，150r/min搖床培養(yǎng)3天，作為發(fā)酵用菌種。
[0028] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)為：利用分散劑打散發(fā)酵用菌體后，按10%的接種量接種到裝有 1L帶擋板的錐形瓶中，30°C，150r/min搖床培養(yǎng)120h。
[0029] 優(yōu)選地，所述的種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g/L ;酵母粉1. 5g/L ;L_酒石酸銨 3. 3g/L ;磷酸二氫鉀7. Og/L ;磷酸氫二鈉2. Og/L ;七水硫酸鎂1. 5g/L ;二水氯化鈣0. lg/ L ;六水合三氯化鐵0. 008g/L ;七水硫酸鋅0. 001g/L ;五水硫酸銅0. 0001g/L ;六水硝酸鈷 0. 0001g/L ;五水硫酸錳0. 0001g/L ;并用氫氧化鉀調(diào)pH至6. 2,葡萄糖分開滅菌，115°C滅 菌 20min。
[0030] 優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖50g/L ;酵母粉1. 5g/L ;L-酒石酸銨 2. 0g/L ;磷酸二氫鉀7. 0g/L ;磷酸氫二鈉2. 0g/L ;七水硫酸鎂1. 5g/L ;二水氯化鈣0. lg/ L ;六水合三氯化鐵0. 008g/L ;七水硫酸鋅0. 001g/L ;五水硫酸銅0. 0001g/L ;六水硝酸鈷 0. 0001g/L ;五水硫酸錳0. 0001g/L，并用氫氧化鉀調(diào)pH至6. 2,葡萄糖分開滅菌，115°C滅菌 20min〇
[0031] 步驟（4)所述的氣相色譜條件為：采用GC_2010(Shimadzu Co.，Japan)色譜儀，色 譜柱為DB-WaXetr(30mX0. 32mm，0. 22μπι);氫火焰離子檢測器檢測，汽化室和檢測器溫度 分別為240°C和260°C;分流方式為進樣1L，分流比10:1，載氣為氮氣；程序升溫為初始溫度 120°C保持 3min，以 5°C /min 升到 190°C，再以 4°C /min 升到 220°C，保持 20min。
[0032] 與已有技術(shù)方案相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0033] (1)本發(fā)明篩選出了一株高產(chǎn)不飽和脂肪酸的菌株，其分類學命名為卷枝毛霉 〇?11(3〇1'(^1'(^1^11〇丨(168)，保藏編號為 ：0610：此.8361。該菌株生長活力旺盛，產(chǎn)脂肪酸量 高，尤其高產(chǎn)多不飽和脂肪酸；該菌株的生物量為13. 3g/L，總脂肪酸的量達3. 0g/L，占菌 體生物量的22. 3%。與高山被孢霉（Mortierella alpine ATCC 32222)相比，本菌株合成 的PUFAs產(chǎn)量比其高出將近3倍；合成的γ -亞麻酸（GLA)是其產(chǎn)量的12倍。該菌株是 生產(chǎn)不飽和脂肪酸的優(yōu)良菌株，適合產(chǎn)業(yè)化推廣。
[0034] (2)本發(fā)明提供了一種全新的篩選方法，通過這種篩選方法，可以實現(xiàn)菌種篩選的 高通量，節(jié)約篩選成本，提高工作效率，有效避免了誘變篩選的隨機性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1典型菌株蘇丹黑染色鏡檢結(jié)果示意圖（40 X 10倍）。
[0036] 圖2脂肪顆粒較多的五株備選菌株蘇丹黑染色鏡檢結(jié)果示意圖（40 X 10倍）。
[0037] 圖3五株備選菌株菌落形態(tài)，從左到右分別為1C12、2A11、2A12、2B31及2A34。
[0038] 圖4五株備選菌株液體發(fā)酵合成PUFAs總量、GLA及LA的量。

【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0040] 實施例1低溫培養(yǎng)進行初篩
[0041] 將來自三個地區(qū)的九個土樣（見表1)分別標記為A1，A2，A3，B1，B2，B3，C1，C2，C3。 各稱lg 土樣，加入裝有l(wèi)OOmL無菌水及玻璃珠的500mL三角瓶中，振蕩15min，取150 μ L懸 液（稀釋度相當于1(Γ2)涂布于PDA平板（每個樣品涂布三個平板），分別置于5°C和28°C 進行培養(yǎng)。
[0042] 表1采集土壤的基本情況
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一株產(chǎn)多不飽和脂肪酸（PUFAs)的菌株，其分類學命名為卷枝毛霉（Mucor circinelloides)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏 日期為2013年10月17日，保藏編號為CGMCC No. 8361。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述菌株的篩選方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 低溫初篩：將土壤樣品的稀釋液涂布于平板上，低溫下培養(yǎng)； (2) 蘇丹黑染色復篩：將低溫培養(yǎng)平板上長出的菌落挑出，用蘇丹黑染液進行染色制 片，鏡檢； (3) 液體發(fā)酵培養(yǎng)：將復篩得到的菌株進行種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，收集并干燥菌體； (4) 氣相色譜檢測：提取上述干燥菌體中的細胞內(nèi)脂肪酸，氣相色譜檢測其含量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟（1)所述的平板培養(yǎng)基為PDA培 養(yǎng)基； 優(yōu)選地，所述的PDA培養(yǎng)基含有如下組分：馬鈴薯200g/L ;葡萄糖20g/L ;瓊脂17g/L ; 將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5. 8,115°C滅菌20min ; 優(yōu)選地，所述的低溫培養(yǎng)在3-10°C下進行，培養(yǎng)5-9天。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟（2)所述的蘇丹黑染液由蘇丹黑 B保存液40mL加碳酸磷酸緩沖液20mL混合過濾而成； 優(yōu)選地，所述蘇丹黑B保存液的配制為：蘇丹黑BO. 15g加50mL無水乙醇混勻，放置2 天，時常搖動，使蘇丹黑B完全溶解； 優(yōu)選地，所述碳酸磷酸緩沖液由a溶液和b溶液混合而成；所述a溶液為石碳酸結(jié)晶8g 加無水乙醇15mL，混勻；所述b溶液為十二水合磷酸氫二鈉0. 15g加蒸饋水50mL，混勻； 步驟（2)所述的鏡檢采用光學顯微鏡進行，物鏡為40X，目鏡為10X。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟（3)所述液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為： 溫度30°C，轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)5天； 所述的種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g/L ;酵母粉1. 5g/L ;L-酒石酸銨3. 3g/L ;磷酸二 氫鉀7. Og/L ;磷酸氫二鈉2. Og/L ;七水硫酸鎂1. 5g/L ;二水氯化鈣0. lg/L ;六水合三氯化 鐵0· 008g/L ;七水硫酸鋅0· 001g/L ;五水硫酸銅0· 0001g/L ;六水硝酸鈷0· 0001g/L ;五水 硫酸錳0. 〇〇〇lg/L ;并用氫氧化鉀將pH值調(diào)至6. 2,葡萄糖分開滅菌，115°C滅菌20min ; 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖50g/L ;酵母粉1. 5g/L ;L-酒石酸銨2. 0g/L ;磷酸二 氫鉀7. 0g/L ;磷酸氫二鈉2. 0g/L ;七水硫酸鎂1. 5g/L ;二水氯化鈣0. lg/L ;六水合三氯化 鐵0· 008g/L ;七水硫酸鋅0· 001g/L ;五水硫酸銅0· 0001g/L ;六水硝酸鈷0· 0001g/L ;五水 硫酸錳0. 〇〇〇lg/L ;并用氫氧化鉀將pH值調(diào)至6. 2,葡萄糖分開滅菌，115°C滅菌20min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟（4)所述的氣相色譜條件為：采 用GC-2010色譜儀，色譜柱為DB-Waxetr ;用氫火焰離子檢測器檢測，汽化室和檢測器溫度 分別為240°C和260°C;分流方式為進樣1L，分流比10:1，載氣為氮氣；程序升溫為初始溫度 120°C保持 3min，以 5°C /min 升到 190°C，再以 4°C /min 升到 220°C，保持 20min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項所述的篩選方法，其特征在于，步驟（4)最終得到的高產(chǎn)不 飽和脂肪酸的菌株，根據(jù)18SrRNA測序結(jié)果確定該菌株為Mucor circinelloides。
【文檔編號】C12N1/02GK104099254SQ201410330424
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】劉小鳴, 熊文珂, 蔣瑜, 王萍, 李敏, 江麗紅 申請人:無錫超科食品有限公司