2型糖尿病易感位點(diǎn)rs2241766的檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)2型糖尿病易感位點(diǎn)的方法及試劑盒，所述方法包括步驟：(1)提取樣品的基因組DNA，擴(kuò)增樣品的脂聯(lián)素基因中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)使用HRM分析技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP位點(diǎn)rs2241766的基因型。采用HRM分析技術(shù)對(duì)擴(kuò)增后的脂聯(lián)素基因中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行基因型分析，該方法操作簡(jiǎn)單、快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，可以實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)；使用上述試劑盒可以清晰的判斷受檢人群是否攜帶2型糖尿病易感基因，將2型糖尿病易感人群從人群中篩選出來(lái)，改變不良的生活習(xí)慣，達(dá)到預(yù)防的目的。
【專利說明】2型糖尿病易感位點(diǎn)rs2241 766的檢測(cè)方法及試劑盒 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)2型糖尿病易感性的方法及試劑盒，更具體的說是通過測(cè)定 與2型糖尿病相關(guān)基因脂聯(lián)素基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP)預(yù)測(cè)受試者對(duì)于2型糖尿病的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開 發(fā)，屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 2型糖尿病是成人發(fā)病型糖尿病，多在35-40歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90%以 上。病友體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并非完全喪失，有的患者體內(nèi)胰島素甚至產(chǎn)生過多，但胰島 素的作用效果卻大打折扣，因此患者體內(nèi)的胰島素是一種相對(duì)缺乏。
[0003] 2型糖尿病有更強(qiáng)的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性。目前認(rèn)為發(fā)病原因是 胰島素抵抗（主要表現(xiàn)為高胰島素血癥，葡萄糖利用率降低）和胰島素分泌不足的合并存 在，其表現(xiàn)是不均一的，有的以胰島素抵抗為主伴有胰島素分泌不足，有的則是以胰島素分 泌不足伴有或不伴有胰島素抵抗。
[0004] 2型糖尿病的發(fā)現(xiàn)一般較緩慢而隱襲，有的以慢性并發(fā)癥來(lái)就診而被發(fā)現(xiàn)，多較輕 或無(wú)癥狀，80 %患者超重或肥胖，老年人在誘因下易患非酮癥高滲性糖尿病昏迷，慢性并發(fā) 癥以大血管并發(fā)癥為主，病情相對(duì)穩(wěn)定。治療以飲食治療和口服藥物治療為主。
[0005] 近年來(lái)，單核苷酸多態(tài)性（SNP)和單倍型（haplotype)在多基因疾病研究中的廣 泛運(yùn)用，為在分析水平上研究2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制開辟了全新的思路。同時(shí)，高 通量、低成本的SNP檢測(cè)手段的不斷出現(xiàn)也為SNP大規(guī)?？焖俜中吞峁┝丝赡?。然而，現(xiàn)有 檢測(cè)2型糖尿病易感性的方法均存在或者準(zhǔn)確率低、或者成本高、或者難以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn) 等不足。
[0006] 因此，有必要提出一種新的檢測(cè)方法以解決上述問題。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0007] 本發(fā)明的主要目的是提供一種輔助診斷2型糖尿病的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、快 速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，可以實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測(cè)2型糖尿病易感位點(diǎn)的試劑盒，該試劑盒 包括PCR引物及含有該引物的試劑盒，其可以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增與HRM分析。
[0009] 為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種檢測(cè)2型糖尿病易感位點(diǎn)的 方法，包括步驟：（1)提取樣品的基因組DNA，擴(kuò)增樣品的脂聯(lián)素基因中包含rs2241766位點(diǎn) 的區(qū)域，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；（2)使用HRM分析技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP位點(diǎn)rs2241766的基因 型。
[0010] 進(jìn)一步的，脂聯(lián)素基因的rs2241766位點(diǎn)的基因型帶有G時(shí)，該脂聯(lián)素基因所屬樣 品的測(cè)試者對(duì)于2型糖尿病的易感性高于基因型沒有G的測(cè)試者。
[0011] 進(jìn)一步的，使用特異性引物擴(kuò)增樣品的脂聯(lián)素基因中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū) 域，該特異性引物是指針對(duì)脂聯(lián)素基因上rs2241766號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包 含上述SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
[0012] 進(jìn)一步的，所述特異性引物具有SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列。
[0013] 進(jìn)一步的，使用HRM分析技術(shù)直接檢測(cè)擴(kuò)增后包含上述SNP位點(diǎn)的DNA片段的引 物對(duì)的基因型。
[0014] 進(jìn)一步的，將擴(kuò)增后包含上述SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)轉(zhuǎn)移至分析裝置，然后 使用HRM分析技術(shù)對(duì)該引物對(duì)的基因型進(jìn)行分析。
[0015] 進(jìn)一步的，所述2型糖尿病易感位點(diǎn)的檢測(cè)方法在體外非診斷性檢測(cè)2型糖尿病 易感性方面的應(yīng)用。
[0016] 為了解決上述問題，本發(fā)明采用的另一技術(shù)方案是：一種用于檢測(cè)2型糖尿病易 感位點(diǎn)的試劑盒，對(duì)脂聯(lián)素基因中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增及HRM技術(shù)分析。
[0017] 進(jìn)一步的，所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增脂聯(lián)素基因中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域 的特異性引物。
[0018] 進(jìn)一步的，所述特異性引物具有SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列。
[0019] 進(jìn)一步的，試劑盒的組分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgC12 溶液、lul2 μ M Primer Mix、lul5ng/μ 1 左右 DNA、 1.8ul H20、具有SEQ ID N02和SEQ ID N03所示的核苷酸序列的特異性引物。
[0020] 進(jìn)一步的，所述試劑盒在檢測(cè)2型糖尿病易感性方面的應(yīng)用。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：采用HRM分析技術(shù)對(duì)擴(kuò)增后的脂聯(lián)素 基因中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行基因型分析，該方法操作簡(jiǎn)單、快速，使用成本低， 結(jié)果準(zhǔn)確，可以實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0022] 圖1是脂聯(lián)素基因 rs2241766位點(diǎn)基因型的HRM檢測(cè)結(jié)果；
[0023] 圖2是測(cè)序結(jié)果截圖，顯示了 rs2241766的一種SNP基因型的探針分型結(jié)果。 【【具體實(shí)施方式】】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人、分子克隆、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。
[0025] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)2型糖尿病易感位點(diǎn)的方法及試劑盒，所述方法包括步 驟：⑴提取樣品的基因組DNA，擴(kuò)增樣品的脂聯(lián)素基因中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域，得到 擴(kuò)增產(chǎn)物；（2)使用HRM分析技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中SNP位點(diǎn)rs2241766的基因型。該2型 糖尿病易感位點(diǎn)的檢測(cè)方法及試劑盒亦可用于檢測(cè)2型糖尿病的易感性。
[0026] 在本發(fā)明中，脫氧核糖核酸（DNA)序列編號(hào)：rs2241766位置基于SEQ ID N0 :1所 示的核苷酸序列；引物1基于SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列；引物2基于SEQ ID N0 :3 所示的核苷酸序列；擴(kuò)增產(chǎn)物3基于SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
[0027] 經(jīng)過多年研究證明了脂聯(lián)素基因單核苷酸多態(tài)性位rs2241766與2型糖尿病密切 相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能：脂聯(lián)素基因中基因型的改變將導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn) 升高，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在脂聯(lián)素基rs2241766T - G在病例和對(duì)照組中的分布存在 顯著性差異，該SNP多態(tài)性可改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
[0028] 檢測(cè)可以針對(duì)基因組DNA，也可針對(duì)脂聯(lián)素基因的擴(kuò)增片段。脂聯(lián)素基因的 rs2241766的基因型也可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交 檢測(cè)突變。
[0029] 實(shí)施例1 :突光PCR檢測(cè)
[0030] 一、實(shí)驗(yàn)材料
[0031] 熒光定量PCR，聚合酶鏈反應(yīng)液
[0032] 二、引物及探針設(shè)計(jì)與合成：
[0033] 以脂聯(lián)素基因的部分序列為模板，使用Primer Premierf軟件分析引物，并由上海 生工生物工程有限公司定制合成。
[0034] 檢測(cè)用引物：
[0035] 脂聯(lián)素基因 rs2241766上游引物序列：5'-
[0036] CTGTTGCTGGGAGCTGTTCTA-3， （SEQ ID N02)
[0037] 脂聯(lián)素基因 rs2241766下游引物序列：5'-
[0038] GGCCCTTGAGTCGTGGTTT-3; (SEQ ID N03)
[0039] 三、樣本檢測(cè)：
[0040] 實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)50例2型糖尿病病例和50例正常對(duì)照人群，每例收集血樣標(biāo)本約 2ml，用酚/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結(jié)果用微量紫外/可見光分光光度計(jì)（INFINIGEN公 司）檢測(cè)。
[0041] 按如下體系進(jìn)行突光PCR擴(kuò)增，最后用roche lc480softwarel. 5掃描并聚類分析
[0042]
【權(quán)利要求】
1. 一種2型糖尿病易感位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于：包括步驟： (1) 提取樣品的基因組DNA，擴(kuò)增樣品的脂聯(lián)素基因中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域，得 到擴(kuò)增產(chǎn)物；和 (2) 使用高分辨烙解曲線（high-resolution melt，HRM)分析技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中單 核苷酸多態(tài)性（SNP)位點(diǎn)rs2241766的基因型。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：脂聯(lián)素基因的rs2241766位點(diǎn)的基因型帶 有G時(shí)，該脂聯(lián)素基因所屬樣品的測(cè)試者對(duì)于2型糖尿病的易感性高于基因型沒有G的測(cè) 試者。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：使用特異性引物擴(kuò)增樣品的脂聯(lián)素基因中 包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域，該特異性引物是指針對(duì)脂聯(lián)素基因上rs2241766號(hào)SNP位點(diǎn) 而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含上述SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述特異性引物具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：使用HRM分析技術(shù)直接檢測(cè)擴(kuò)增后包含上 述SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)的基因型。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：將擴(kuò)增后包含上述SNP位點(diǎn)的DNA片段的 引物對(duì)轉(zhuǎn)移至分析裝置，然后使用HRM分析技術(shù)對(duì)該引物對(duì)的基因型進(jìn)行分析。
7. -種用于檢測(cè)2型糖尿病易感位點(diǎn)的試劑盒，其特征在于：對(duì)脂聯(lián)素基因中包含 rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增及HRM技術(shù)分析。
8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增脂聯(lián)素基因 中包含rs2241766位點(diǎn)的區(qū)域的特異性引物。
9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述特異性引物具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于：試劑盒的組分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgC12 溶液、lul2 μ Μ Primer Mix、lul5ng/yl 左右 DNA、1.8ul H20、具有 SEQ ID N02 和 SEQ ID N03 所示的核苷 酸序列的特異性引物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104059991SQ201410331667
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】黃迅威, 張?zhí)熘? 沈玲宇, 邵敏華 申請(qǐng)人:光瀚健康咨詢管理(上海)有限公司