針對(duì)TGFβ的抗體的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及抗體分子，特別是結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)的抗體分子，及其用途。更具體而言，本發(fā)明涉及結(jié)合且優(yōu)選中和TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的抗體分子，即所謂的“泛特異性”抗體分子，以及此類抗體分子的用途。本發(fā)明內(nèi)的優(yōu)選實(shí)施方案是抗體分子，無(wú)論是完整的抗體(例如IgG，如IgG1或IgG4)還是抗體片段(例如scFv、Fab、dAb)?！緦＠f(shuō)明】針對(duì)TGFP的抗體[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年2月8日、申請(qǐng)?zhí)枮?00680008838.9、發(fā)明名稱為"針對(duì)TGFβ的抗體"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)?！?br>技術(shù)領(lǐng)域：
】[0002]本發(fā)明涉及抗體分子，特別是結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFi3)的抗體分子，及其用途。更具體而言，本發(fā)明涉及結(jié)合且優(yōu)選中和TGFi31、TGFi32和TGFi33的抗體分子，即所謂的"泛特異性"抗體分子，以及此類抗體分子的用途。[0003]背景[0004]TGF0在1981年首次被鑒別（Roberts等人，1981)。在人類中存在3種同種型：TGFP1、TGFP2和TGFP3(SwissProt登錄號(hào)分別為P01137、P08112和P10600)，在其生物活性狀態(tài)下，它們是25kDa同型二聚體，包括兩個(gè)通過(guò)鏈間二硫橋連接的具有112個(gè)氨基酸的單體。TGFP1與TGFP2的不同在于27,并且與TGFP3的不同在于22,主要是保守性氨基酸改變。這些差異已在通過(guò)X射線晶體學(xué)測(cè)定的TGF03D結(jié)構(gòu)上作圖（Schlunegger等人，1992;Peer等人，1996)，并且已確定受體結(jié)合區(qū)域（Griffith等人，1996;Qian等人，1996)。[0005]人TGFβs非常類似于小鼠TGFβs:人TGFβ1與小鼠TGFβ1只有1個(gè)氨基酸的差異，人TGFβ2與小鼠TGFβ2只有3個(gè)氨基酸的差異，并且人TGFβ3與小鼠TGFβ3相同。因此，在小鼠（包括轉(zhuǎn)基因小鼠）中生產(chǎn)針對(duì)人TGFi3s的抗體是困難的。[0006]TGFi3s是參與細(xì)胞增殖和分化、胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)形成、骨發(fā)育、傷口愈合、血細(xì)胞生成以及免疫和炎癥應(yīng)答的多功能細(xì)胞因子（Border等人，1995a)。TGFi3s的失調(diào)導(dǎo)致病理過(guò)程，這些病理過(guò)程在人中已牽涉眾多病狀，例如出生缺陷、癌癥、慢性炎癥、自身免疫和纖維化疾?。˙order等人，1994;Border等人，1995b)。[0007]在許多纖維化動(dòng)物模型中已使用中和抗體作為拮抗劑進(jìn)行了研究（Border等人，1995b;Border等人，1994)，例如腎小球腎炎（Border等人，1990)、神經(jīng)瘢痕化（Logan等人，1994)、皮膚瘢痕化（Shah等人，1994)和肺纖維化（Giri等人，1993)。這些模型代表的所有疾病代表了未滿足的對(duì)新型治療產(chǎn)品的需要（Bonewald，1999Jackson，1998)。然而，在這些及其他動(dòng)物研究中使用的抗體已在動(dòng)物中產(chǎn)生，并且它們?cè)谌酥械闹委熞嫣幙赡苁怯邢薜?，因?yàn)槠渚哂姓T導(dǎo)免疫原性應(yīng)答的可能性以及其具有快速的藥物代謝動(dòng)力學(xué)清除(Vaughan等人，1998)。對(duì)于治療TGF0介導(dǎo)的疾病，人抗體是更希望的。[0008]已知各種抗體片段能夠特異地并且以良好的親和力結(jié)合靶蛋白。例如，只包含通過(guò)短肽連接體連接在一起的重鏈可變結(jié)構(gòu)域（VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域（VL)的抗體片段，稱為單鏈Fv(scFv)，已被廣泛使用。中和TGFβ1(CAT-192)或TGFβ2(CAT-152或Trabio?)的人抗體以前已產(chǎn)生（EP0945464,EP0853661，Thompson等人1999)。然而，本領(lǐng)域中可獲得的大多數(shù)TGFi3抗體是非人的。此外，在本發(fā)明之前唯一針對(duì)TGFi3的泛特異性(pan-specific)單克隆抗體是哨齒類動(dòng)物的。[0009]與人TGF31和人TGF32結(jié)合的針對(duì)中和性和非中和性表位的多克隆抗體已在兔（Danielpour等人，1989b;Roberts等人，1990)、雞（R&DSystems，Minneapolis)和火雞(Danielpour等人，1989c)中產(chǎn)生。代表了部分TGFi3序列的肽也已用作免疫原來(lái)在兔中產(chǎn)生中和性多克隆抗血清（Border等人，1990;Flanders等人，1988)。此類非人多克隆抗體不適合于人治療用途。[0010]1D11.16是鼠類泛特異性抗TGFi3抗體，其在廣泛范圍的體外測(cè)定法中中和人和小鼠TGFP1、TGFP2和TGFP3(Dasch等人，1989;Dasch等人，1996;R&DSystem關(guān)于MAB1835的產(chǎn)品頁(yè)），并且于在纖維化動(dòng)物模型中的原理驗(yàn)證研究之中是有效的（Ling等人，2003;Miyajima等人，2000;Schneider等人，1999;Khanna等人，1999;Shenkar等人，1994)。然而，因?yàn)?D11.16是鼠類單克隆抗體（Dasch等人，1989;Dasch等人，1996)，所以它不適合在人中的治療用途。[0011]附圖簡(jiǎn)述[0012]圖1顯示了PET1073G12種系IgG4(實(shí)心正方形）和1D11.16(空心圓圈）對(duì)來(lái)自NHLF細(xì)胞的經(jīng)TGFP1(a)、TGFP2(b)或TGFP3(c)(10pM)誘導(dǎo)的纖連蛋白產(chǎn)生的中和作用抑制）。實(shí)心三角形代表以最高濃度（ΙΟΟηΜ)測(cè)試的無(wú)關(guān)IgG4。數(shù)據(jù)顯示為一式兩份進(jìn)行的η次實(shí)驗(yàn)的平均值土SE平均值。關(guān)于IC5(I值見(jiàn)表2。[0013]圖2顯示了PET1074B9種系IgG4(實(shí)心正方形）和1D11.16(空心圓圈）對(duì)來(lái)自NHLF細(xì)胞的經(jīng)TGFM(a)、TGFP2(b)或TGFP3(c)(10pM)誘導(dǎo)的纖連蛋白產(chǎn)生的中和作用抑制）。實(shí)心三角形代表以最高濃度（ΙΟΟηΜ)測(cè)試的無(wú)關(guān)IgG4。數(shù)據(jù)顯示為一式兩份進(jìn)行的η次實(shí)驗(yàn)的平均值土SE平均值。關(guān)于IC5(I值見(jiàn)表2。[0014]圖3顯示了PET1287A10種系IgG4(實(shí)心正方形）和1D11.16(空心圓圈）對(duì)來(lái)自NHLF細(xì)胞的經(jīng)TGFP1(a)、TGFP2(b)或TGFP3(c)(10pM)誘導(dǎo)的纖連蛋白產(chǎn)生的中和作用抑制）。實(shí)心三角形代表以最高濃度（ΙΟΟηΜ)測(cè)試的無(wú)關(guān)IgG4。數(shù)據(jù)顯示為一式兩份進(jìn)行的η次實(shí)驗(yàn)的平均值土SE平均值。關(guān)于IC5(I值見(jiàn)表2。[0015]發(fā)明概述[0016]在本發(fā)明的各個(gè)方面中提供了下文包括的實(shí)施方案的主題。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面和實(shí)施方案在本文的說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)。[0017]本發(fā)明提供了對(duì)于TGFi3特別是人TGFi3的特異性結(jié)合成員。特別提供了針對(duì)TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的特異性結(jié)合成員。本發(fā)明內(nèi)的優(yōu)選實(shí)施方案是抗體分子，無(wú)論是完整的抗體（例如IgG，如IgGl或IgG4)還是抗體片段（例如scFv、Fab、dAb)。提供了抗體抗原-結(jié)合區(qū)域和抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如包含此類區(qū)域的抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域。提供了在VH和VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)的互補(bǔ)性決定區(qū)CDRs，其可以在不同框架區(qū)FR's內(nèi)提供，以視情況而形成VH或VL結(jié)構(gòu)域?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以由抗體VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域或其抗原結(jié)合部分組成。[0018]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了對(duì)于人TGFi3的特異性結(jié)合成員，其包括抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)、HCDR組、IXDR組或兩者和/或人抗體VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域或兩者。[0019]HCDR1、HCDR2和HCDR3這一組可以具有選自下列的序列：[0020]HCDR1SEQIDN0:3、HCDR2SEQIDN0:4、HCDR3SEQIDN0:5(在本文中稱為"PET1073G12的HCDRs組"）；[0021]HCDR1SEQIDN0:13、HCDR2SEQIDN0:14、HCDR3SEQIDNO:15(在本文中稱為"PET1074B9的HCDRs組"）；[0022]HCDR1SEQIDN0:23、HCDR2SEQIDN0:24、HCDR3SEQIDNO:25(在本文中稱為"PET1287A10的HCDRs組"）。[0023]IXDR1、IXDR2和IXDR3這一組可以具有選自下列的序列：[0024]LCDR1SEQIDN0:8、LCDR2SEQIDN0:9、LCDR3SEQIDNO:10(在本文中稱為"PET1073G12的LCDRs組"）；[0025]LCDR1SEQIDN0:18、LCDR2SEQIDN0:19、LCDR3SEQIDNO:20(在本文中稱為"PET1074B9的LCDRs組"）；[0026]LCDR1SEQIDN0:28、LCDR2SEQIDN0:29、LCDR3SEQIDNO:30(在本文中稱為"PET1287A10的LCDRs組"）。[0027]PET1073G12的HCDRs組與PET1073G12的LCDRS組一起在本文中稱為PET1073G12的⑶Rs組。[0028]PET1074B9的HCDRs組與PET1074B9的LCDRS組一起在本文中稱為PET1074B9的CDRs組。[0029]PET1287A10的HCDRs組與PET1287A10的LCDRS組一起在本文中稱為PET1287A10的⑶Rs組。[0030]本發(fā)明還提供了包含如本文公開(kāi)的HCDRs組的VH結(jié)構(gòu)域，同樣地還分開(kāi)地提供了包含如本文公開(kāi)的LCDRs組的VL結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，這樣的VH結(jié)構(gòu)域是與這樣的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)的，并且最優(yōu)選地VH和VL結(jié)構(gòu)域的配對(duì)與如本文所示的克隆中的一樣。[0031]本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括HCDRUHCDR2和HCDR3這一HCDRs組的VH結(jié)構(gòu)域，其中所述HCDRs組相應(yīng)于具有1個(gè)或2個(gè)氨基酸置換的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs組。[0032]本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括IXDRUIXDR2和IXDR3這一IXDRs組的VL結(jié)構(gòu)域，其中所述CDRs組相應(yīng)于具有1個(gè)或2個(gè)氨基酸置換的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的IXDRs組。[0033]本發(fā)明還提供了在此類VH和/或VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)包括抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的特異性結(jié)合成員。[0034]跟隨將多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)應(yīng)用于結(jié)構(gòu)/特性-活性關(guān)系的計(jì)算化學(xué)的引導(dǎo)(Wold等人，Multivariatedataanalysisinchemistry.Chemometrics-MathematicsandStatisticsinChemistry(Ed.：B.Kowalski),D.ReidelPublishingCompany,Dordrecht，Holland，1984(ISBN90-277-1846-6))，抗體的定量的活性-特性關(guān)系可以使用眾所周知的數(shù)學(xué)技術(shù)例如統(tǒng)計(jì)回歸、模式識(shí)別和分類來(lái)獲得（Norman等人，AppliedRegressionAnalysis.Wiley-Interscience;第三版（April1998)ISBN:0471170828;AbrahamKandel,EricBacker.Computer-AssistedReasoninginClusterAnalysis.PrenticeHallPTR；(Mayll,1995),ISBN:0133418847；ffojtekKrzanowski.PrinciplesofMultivariateAnalysis：AUser'sPerspective(OxfordStatisticalScienceSeries,No22(Paper)).OxfordUniversityPress；(December2000),ISBN:0198507089；IanH.Witten,ElbeFrank.DataMining:PracticalMachineLearningToolsandTechniqueswithJavaImplementations.MorganKaufmann;(October11,1999),ISBN：1558605525;DavidG.T.Denison(編者），ChristopherC.Holmes,BaniK.Mallick,AdrianF.M.Smith.BayesianMethodsforNonlinearClassificationandRegression(WileySeriesinProbabilityandStatistics).Johnffiley&Sons；(July2002),ISBN：0471490369；ArupK.Ghose,VellarkadN.Viswanadhan.CombinatorialLibraryDesignandEvaluationPrinciples,Software,Tools,andApplicationsinDrugDiscovery.ISBN:0-8247-0487-8)?？贵w的特性可以得自抗體序列的經(jīng)驗(yàn)和理論模型（例如，可能接觸的殘基或計(jì)算的物理化學(xué)特性的分析）、功能和三維結(jié)構(gòu)，并且這些特性可以單獨(dú)和組合考慮。[0035]已知原子結(jié)構(gòu)的抗體的分析已闡明抗體結(jié)合位點(diǎn)的序列和三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系（ChothiaC.等人，JournalMolecularBiology(1992)227,799-817;Al_Lazikani等人，JournalMolecularBiology(1997)273(4)，927_948)。這些關(guān)系暗不，除了VH結(jié)構(gòu)域中的第三個(gè)區(qū)域（環(huán)）外，結(jié)合位點(diǎn)環(huán)具有少數(shù)主鏈構(gòu)象中的一種：正則結(jié)構(gòu)（canonicalstructures)。已顯示，在特定環(huán)中形成的正則結(jié)構(gòu)由其大小以及在環(huán)和框架區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵位點(diǎn)處某些殘基的存在來(lái)確定（Chothia等人和Al-Lazikani等人，同上）。[0036]這一序列-結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究可以用于預(yù)測(cè)在已知序列但未知三維結(jié)構(gòu)的抗體中的那些殘基，它們?cè)诰S持其CDR環(huán)的三維結(jié)構(gòu)中是重要的并因此在維持結(jié)合特異性中是重要的。這些預(yù)測(cè)可以通過(guò)將預(yù)測(cè)與來(lái)自先導(dǎo)物優(yōu)化實(shí)驗(yàn)（leadoptimizationexperiments)的輸出結(jié)果進(jìn)行比較來(lái)證實(shí)。在結(jié)構(gòu)方法中，可以使用任何可免費(fèi)獲得或商業(yè)的軟件包例如WAM(Whitelegg，N.R.u.和Rees，A.R(2000)Prot.Eng.，12,815-824)來(lái)形成抗體分子的理論模型。然后，蛋白質(zhì)可視化和分析軟件包例如InsightII(Accelerys,Inc.)或DeepView(Guex，Ν·和Peitsch，M.C.Electrophoresis(1997)18,2714-2723)可用于評(píng)估在⑶R和FR中每個(gè)位置上的可能置換。這個(gè)信息隨后可用于進(jìn)行可能對(duì)活性具有最小或有利影響的置換。[0037]在CDRs、抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域和特異性結(jié)合成員的氨基酸序列內(nèi)進(jìn)行置換所需的技術(shù)一般是本領(lǐng)域可獲得的。使用可能或不能被預(yù)測(cè)對(duì)活性具有最小或有利影響的置換，可以制備變體序列，并且測(cè)試結(jié)合和/或中和TGFi3的能力和/或任何其他所需特性。這在下文中進(jìn)一步討論。[0038]如已注明的，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合成員，其包括指定的CDRs組，特別是PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10的CDRs組，以及在CDRs組內(nèi)有1個(gè)或2個(gè)置換的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs組。[0039]提供了在抗體框架區(qū)或其他蛋白質(zhì)支架例如纖連蛋白或細(xì)胞色素B內(nèi)的相關(guān)⑶Rs組。優(yōu)選采用抗體框架區(qū)。[0040]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，重鏈采用人VH1家族基因。在各種實(shí)施方案中，與人VH1家族基因的種系氨基酸序列相比較，重鏈框架氨基酸序列包含1一12,優(yōu)選3-12,和更優(yōu)選3-8個(gè)氨基酸差異。在某些實(shí)施方案中，重鏈框架序列是種系序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，重鏈的抗體框架區(qū)可以是來(lái)自VH1家族的人DP-10(VHl-69)或人DP-88(VHl-e)。優(yōu)選地，使用人DP-10基因的實(shí)施方案在第27、78和94位殘基處具有非種系氨基酸。在某些實(shí)施方案中，第27位殘基是酪氨酸，第78位殘基是蘇氨酸，和第94位殘基是絲氨酸或亮氨酸。在某些實(shí)施方案中，輕鏈采用與種系氨基酸序列相比較具有1一5,優(yōu)選1一4,更優(yōu)選1一3個(gè)氨基酸差異的人νκ3家族基因。在某些實(shí)施方案中，輕鏈框架序列是種系人νκ3家族基因序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，輕鏈框架區(qū)可以是人DPK-22(A27)。在某些此類實(shí)施方案中，第2位殘基是非種系氨基酸。在某些實(shí)施方案中，第2位殘基是蘇氨酸。[0041]在一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了具有SEQIDN0:2的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域"，或具有SEQIDN0:12的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1074B9VH結(jié)構(gòu)域"，或具有SEQIDN0:22的氨基酸序列的VH結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域"。[0042]在一個(gè)進(jìn)一步高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了具有SEQIDN0:7的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域"，或具有SEQIDN0:17的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1074B9VL結(jié)構(gòu)域"，或具有SEQIDN0:27的氨基酸序列的VL結(jié)構(gòu)域，這被稱為"PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域"。根據(jù)本發(fā)明提供的一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案由PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:2)和PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:7)組成。根據(jù)本發(fā)明提供的另一高度優(yōu)選的實(shí)施方案由PET1074B9VH結(jié)構(gòu)域（SEQIDNO:12)和PET1074B9VL結(jié)構(gòu)域（SEQIDNO:17)組成。根據(jù)本發(fā)明提供的另一高度優(yōu)選的實(shí)施方案由PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:22)和PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:27)組成。根據(jù)本發(fā)明提供的這些或任何其他抗體抗原-結(jié)合位點(diǎn)可以以任何所希望的抗體分子形式提供，例如scFv、Fab、IgGl、IgG4、dAb等，如本文其他地方進(jìn)一步討論的。[0043]在一個(gè)進(jìn)一步高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了IgG4抗體分子，其包括PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選還包括相應(yīng)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域。[0044]本發(fā)明提供了包括PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域和/或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域的其他IgG4或其他抗體分子，正如提供了包括在抗體VH結(jié)構(gòu)域內(nèi)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs組，和/或在抗體VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs組的其他抗體分子。[0045]為了方便，在這里指出，本文中使用的"和/或"被視為具有或不具有另一個(gè)的所述兩個(gè)指定特征或組分中每一個(gè)的具體公開(kāi)。例如"A和/或B"被視為（i)A、（ii)B以及(iii)A和B中每一個(gè)的具體公開(kāi)，就像每一個(gè)單獨(dú)在本文中列出。[0046]如所注明的，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中提供了特異性結(jié)合成員，其結(jié)合人TGFβ的所有3種同種型，并且包括PET1073G12、ΡΕΤ1074Β9或PET1287A10VH和/或VL結(jié)構(gòu)域，或者那些結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合部分。[0047]在某些實(shí)施方案中，將VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)以提供抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域（SEQIDNO:2)與PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域（SEQIDNO:7)配對(duì)，從而使得形成了包括PET1073G12VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將PET1074B9VH結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:12)與PET1074B9VL結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:17)配對(duì)，從而使得形成了包括PET1074B9VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:22)與PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:27)配對(duì)，從而使得形成了包括PET1287A10VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在其他實(shí)施方案中，將PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH與除相應(yīng)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL以外的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)。本領(lǐng)域中良好地建立了輕鏈混雜（promiscuity)。[0048]類似地，本文公開(kāi)的任何HCDRs組可以在VH結(jié)構(gòu)域中提供，所述VH結(jié)構(gòu)域單獨(dú)地或與VL結(jié)構(gòu)域相組合地用作特異性結(jié)合成員?？梢蕴峁┚哂斜疚墓_(kāi)的HCDRs組的VH結(jié)構(gòu)域，并且如果將此類VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)，那么可以提供具有本文公開(kāi)的LCDRs組的VL結(jié)構(gòu)域。HCDRs組和LCDRs組的配對(duì)可以是如本文關(guān)于PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10抗體所公開(kāi)的那樣。VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)可以是種系框架。重鏈結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)可以選自VH-1家族，并且優(yōu)選的VH-1框架是DP-10或DP-88框架。輕鏈的框架區(qū)可以選自Vk3家族，并且優(yōu)選的此類框架是DPK-22。[0049]-個(gè)或多個(gè)⑶Rs可以取自VH或VL結(jié)構(gòu)域，其序列是本文公開(kāi)的并且引入合適的框架中。這在本文中進(jìn)一步討論。同樣可采用如使用本文描述的方法獲得的抗體的其他CDRs和CDRs組。[0050]抗體VH結(jié)構(gòu)域、抗體VL結(jié)構(gòu)域、HCDRs組、IXDRs組、⑶Rs組、一種或多種HCDRs例如HCDR3、和/或一種或多種LCR's例如LCDR3,可以在本文關(guān)于其他分子所公開(kāi)的本發(fā)明任何方面和實(shí)施方案中采用，例如具有改善的效力的抗原結(jié)合位點(diǎn)的突變和選擇方法。[0051]本發(fā)明的VH和VL結(jié)構(gòu)域以及CDRs的變體，包括其氨基酸序列在本文中列出的并且可以在對(duì)于TGFi3的特異性結(jié)合成員中采用的那些，可以通過(guò)序列改變或突變以及篩選的方法獲得。本發(fā)明還提供了此類方法。[0052]如所討論的，可以根據(jù)本發(fā)明采用其序列在本文中具體公開(kāi)的任何VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體。特別的變體可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列改變（添力口、刪除、置換和/或插入氨基酸殘基），可以是少于約20個(gè)改變、少于約15個(gè)改變、少于約10個(gè)改變或少于約5個(gè)改變，4、3、2或1個(gè)改變。改變可以在一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)CDRs中進(jìn)行。[0053]根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了人、人源化、嵌合或合成的特異性結(jié)合成員，其與任何特異性結(jié)合成員競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原，所述任何特異性結(jié)合成員結(jié)合所述抗原并包括特異性的抗體抗原-結(jié)合區(qū)、本文公開(kāi)的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、本文公開(kāi)的CDRs或HCDR3組、或這些中的任何一種的變體。結(jié)合成員之間的競(jìng)爭(zhēng)可以在體外容易地測(cè)定，例如使用ELISA和/或通過(guò)將特異性的報(bào)告分子標(biāo)記至一個(gè)結(jié)合成員，其可以在其他未標(biāo)記的結(jié)合成員存在下被檢測(cè)，從而使得能夠鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的特異性結(jié)合成員。結(jié)合成員之間的交叉競(jìng)爭(zhēng)可以容易地通過(guò)進(jìn)行反轉(zhuǎn)測(cè)定法（reverseassay)來(lái)測(cè)定，例如通過(guò)顛倒標(biāo)記的和未標(biāo)記的結(jié)合成員以鑒定在兩個(gè)方向上阻斷結(jié)合的對(duì)。[0054]因此，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供了包括抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的特異性結(jié)合成員，其與PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗體分子，特別是PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10scFv和/或IgG4,競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGFβ。在各種實(shí)施方案中，抗體是人、人源化、嵌合或合成的抗體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了包括人、人源化、嵌合或合成的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的特異性結(jié)合成員，其與本發(fā)明的抗原結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGFβ，其中人、人源化、嵌合或合成的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成，并且其中VH和VL結(jié)構(gòu)域包括如本文公開(kāi)的⑶Rs組。[0055]考慮到本文公開(kāi)的信息，在本領(lǐng)域中可得各種方法以用于獲得針對(duì)TGFi3的人、人源化、嵌合或合成的抗體，并且其可以與PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10抗體分子，具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs組的抗體分子，具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10HCDRs組的抗體分子，或具有PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10IXDRS組的抗體分子競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGF3。[0056]在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于獲得一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合TGF31、TGFi32和TGFi33的特異性結(jié)合成員的方法，該方法包括使根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員文庫(kù)與所述TGFβs接觸，并且選擇所述文庫(kù)中的一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合所有所述TGFβs的特異性結(jié)合成員。[0057]所述文庫(kù)可以展示在噬菌體顆粒表面上，每個(gè)顆粒包含編碼展示在其表面上的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域（并且任選地，如果存在，還有所展示的VL結(jié)構(gòu)域）的核酸。[0058]選擇能夠結(jié)合抗原并展示在噬菌體顆粒上的特異性結(jié)合成員之后，可以從展示所述選擇的特異性結(jié)合成員的噬菌體顆粒上獲取核酸。通過(guò)表達(dá)具有取自噬菌體顆粒（所述噬菌體顆粒展示所述選擇的特異性結(jié)合成員）的核酸的序列的核酸，此類核酸可以用于后續(xù)生產(chǎn)特異性結(jié)合成員或抗體VH可變結(jié)構(gòu)域（和任選地，抗體VL可變結(jié)構(gòu)域）。[0059]具有所述選擇的特異性結(jié)合成員的抗體VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的抗體VH結(jié)構(gòu)域可以以分離的形式提供，如可以提供包括此類VH結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員?？梢赃M(jìn)一步測(cè)試結(jié)合所有3種TGFβ同種型的能力，以及與PET1073G12、PET1074B9或ΡΕΤ1287Α10(例如以scFv形式和/或IgG形式，例如IgG4)競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所有3種人的TGFβ同種型的能力。如下文進(jìn)一步討論的，可以測(cè)試中和TGF0的能力。[0060]根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以PET1073G12、ΡΕΤ1074Β9或ΡΕΤ1287Α10抗體分子（例如scFv，或優(yōu)選IgG4)的親和力，或以大于上述分子之一的親和力結(jié)合TGF31、TGFβ2和/或TGFβ3。根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以PET1073G12、PET1074B9或ΡΕΤ1287Α10抗體分子（例如scFv，或優(yōu)選PET1073G12、ΡΕΤ1074Β9或PET1287A10IgG4)的效力，或以大于上述分子之一的效力中和TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3。[0061]根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以PET1073G12、ΡΕΤ1074Β9或ΡΕΤ1287Α10抗體分子（例如scFv，或優(yōu)選IgG4)的效力，或以大于上述分子之一的效力中和天然存在的TGFi3。不同特異性結(jié)合成員的結(jié)合親和力和中和效力可以在適當(dāng)條件下進(jìn)行比較。[0062]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案優(yōu)選包括人、人源化、嵌合或合成的抗體，其中和天然存在的TGFP，其中和效力等于或大于由PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域和相應(yīng)的PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VL結(jié)構(gòu)域形成的TGFβ抗原結(jié)合位點(diǎn)的效力。[0063]除了抗體序列外，根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可以包括其他氨基酸，所述其他氨基酸例如形成肽或多肽，例如折疊的結(jié)構(gòu)域，或者賦予該分子除了結(jié)合抗原的能力以外的另一種功能特征。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以攜帶可檢測(cè)的標(biāo)記，或可以綴合至毒素或靶向性部分或酶（例如，經(jīng)由肽基鍵或連接體）。[0064]在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其包含編碼根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域或CDR的序列，以及提供了制備本發(fā)明的特異性結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域或CDR的方法，所述方法包括在一定條件下表達(dá)所述核酸從而導(dǎo)致產(chǎn)生所述特異性結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域、或CDR，并將其回收。[0065]根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以在人或動(dòng)物機(jī)體的治療或診斷方法中使用，例如治療（這可以包括預(yù)防性治療）人患者中的疾病或病癥的方法，其包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的特異性結(jié)合成員。根據(jù)本發(fā)明可治療的病狀包括其中TGFi3起作用的任何病狀，尤其是纖維化疾病的治療、傷口愈合的調(diào)節(jié)和癌癥治療。[0066]更具體而言，本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可用于在體外或體內(nèi)抑制3種人TGF3同種型中的任何一種或全部的活性。此類活性包括但不限于，TGFi3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM)沉積，抑制上皮和內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)平滑肌增殖，誘導(dǎo)III型膠原表達(dá)，誘導(dǎo)TGF-β、纖連蛋白、VEGF和IL-11表達(dá)，結(jié)合潛在性相關(guān)肽（LatencyAssociatedPeptide)，腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制，促進(jìn)血管發(fā)生，激活肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)轉(zhuǎn)移和抑制NK細(xì)胞活性。[0067]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可用于治療由TGFi3活性直接或間接引起的疾病和病狀。因?yàn)楸景l(fā)明的特異性結(jié)合成員是泛特異性的，即它們結(jié)合并抑制所有3種TGF3同種型的活性，所以它們對(duì)于治療涉及兩種或更多種TGFi3同種型的病狀和疾?。ɡ绺腥竞湍[瘤）以及其中希望抑制多重靶的嚴(yán)重病狀來(lái)說(shuō)是特別有利的。[0068]特異性結(jié)合成員可用于治療下列疾病和病狀，所述疾病和病狀包括，但不限于，纖維化疾?。ɡ缒I小球腎炎、神經(jīng)瘢痕化、皮膚瘢痕化、肺纖維化、肺部纖維化、輻射誘導(dǎo)的纖維化、肝纖維化、骨髓纖維化）、燒傷、免疫介導(dǎo)型疾病、炎性疾?。ò愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）、移植排斥、癌癥、杜普伊特倫攣縮和胃潰瘍。它們還可用于治療、預(yù)防和減少腎機(jī)能不全發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，所述腎機(jī)能不全包括，但不限于：糖尿病性（I型和II型）腎病、輻射性腎病、梗阻性腎病、全身性硬皮病、肺纖維化、同種異體移植物排斥、遺傳性腎臟?。ɡ缍嗄倚阅I病、髓質(zhì)海綿腎、馬蹄腎）、腎小球腎炎、腎硬化、腎鈣質(zhì)沉著、全身性紅斑狼瘡、斯耶格倫綜合征、貝格爾病、系統(tǒng)性或腎小球性高血壓、腎小管間質(zhì)性腎病、腎小管性酸中毒、腎結(jié)核和腎梗死。特別地，當(dāng)與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的拮抗劑相組合時(shí)它們是有用的，所述拮抗劑包括但不限于：腎素抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE)抑制劑、AngII受體拮抗劑（也稱為"AngII受體阻滯劑"）和醛固酮拮抗劑。使用與此類拮抗劑相組合的本發(fā)明的特異性結(jié)合成員的方法在PCT/US04/13677中闡述，其內(nèi)容引入本文作為參考。[0069]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可用于治療與ECM沉積相關(guān)的疾病和病狀，所述疾病和病狀包括全身性硬皮病、手術(shù)后粘連、瘢痕瘤和肥厚性瘢痕化、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、青光眼引流手術(shù)、角膜損傷、白內(nèi)障、佩羅尼病、成人呼吸窘迫綜合征、肝硬化、心肌梗死后的瘢痕化、血管成形術(shù)后的再狹窄、蛛網(wǎng)膜下出血后的瘢痕化、多發(fā)性硬化癥、椎板切除術(shù)后的纖維化、腱及其他修復(fù)后的纖維化、由于紋身去除引起的瘢痕化、膽汁性肝硬化（包括硬化性膽管炎）、心包炎、胸膜炎、氣管造口術(shù)、穿透性CNS損傷、嗜曙紅性肌痛綜合征、血管再狹窄、靜脈閉塞性病、胰腺炎和牛皮癬性關(guān)節(jié)病。[0070]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員進(jìn)一步可用于其中促進(jìn)上皮重新形成是有益的病狀。此類病狀包括但不限于皮膚疾病，例如靜脈曲張性潰瘍，缺血性潰瘍（褥瘡），糖尿病性潰瘍，移植物部位，移植物供體部位，擦傷和燒傷，支氣管上皮的疾病例如哮喘、ARDS，腸上皮的疾病例如與細(xì)胞毒素治療相關(guān)的粘膜炎、食管潰瘍（反流疾病（reflexdisease))、胃潰瘍、小腸和大腸損傷（炎性腸病）。[0071]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員的再進(jìn)一步用途是用于其中希望內(nèi)皮細(xì)胞增殖的病狀中，例如在穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、促進(jìn)血管吻合愈合中，或者用于其中希望抑制平滑肌細(xì)胞增殖的病狀中，例如在動(dòng)脈疾病、再狹窄和哮喘中。[0072]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員還可用于增強(qiáng)針對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的感染的免疫應(yīng)答，例如由利什曼蟲(chóng)屬物種（Leishmaniaspp.)、克魯茲錐蟲(chóng)（Trypanosomacruzi)、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis)和麻風(fēng)分枝桿菌（Mycobacteriumleprae)，以及原生動(dòng)物鼠弓楽體（Toxoplasmagondii),真菌莢膜組織胞楽菌（Histoplasmacapsulatum)、白色念珠菌（Candidaalbicans)、近平滑念珠菌（Candidaparapsilosis)和新型隱球酵母（Cryptococcusneoformans)，和立克次氏體（Rickettsia)例如普氏立克次氏體(R.prowazekii)、康氏立克次氏體（R.coronii)和恙蟲(chóng)病立克次氏體（R.tsutsugamushi)引起的那些。它們還可用于減少例如由腫瘤、AIDS或肉芽腫疾病引起的免疫抑制。[0073]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員進(jìn)一步可用于治療過(guò)度增生性疾病，例如癌癥，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚癌、肺癌、子宮頸癌和膀胱癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，間皮瘤，以及各種白血病和肉瘤，例如卡波西肉瘤，并且特別可用于治療或預(yù)防此類腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。特別地，本發(fā)明的拮抗劑特異性結(jié)合成員可用于抑制環(huán)孢菌素介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。[0074]當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，在癌癥治療的情況下，"治療"包括導(dǎo)致減緩腫瘤生長(zhǎng)或減少腫瘤轉(zhuǎn)移以及癌癥部分緩解的任何醫(yī)學(xué)干預(yù)，以便延長(zhǎng)患者的預(yù)期壽命。[0075]本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面提供了核酸，其一般是分離的，并且編碼本文公開(kāi)的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域和/或VL可變結(jié)構(gòu)域。[0076]本發(fā)明的另一方面提供了核酸，其一般是分離的，并且編碼本文公開(kāi)的HCDR或LCDR序列，尤其是選自SEQID勵(lì)：3、4、5、13、14、15、23、24和25的！《1?，或選自SEQIDN0:8、9、10、18、19、20、28、29、30的VLCDR，最優(yōu)選PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10HCDR3(分別為SEQIDN0:5、15或25)。本文還提供了編碼PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的CDRs組的核酸，編碼PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs組的核酸，以及編碼PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs組的核酸，正如提供了編碼單個(gè)的CDRs、HCDRs、LCDRs，以及PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10CDRs、HCDRs、LCDRs組的核酸。[0077]-個(gè)進(jìn)一步的方面提供了用本發(fā)明的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。[0078]-個(gè)再進(jìn)一步的方面提供了生產(chǎn)抗體VH可變結(jié)構(gòu)域的方法，該方法包括導(dǎo)致從編碼核酸進(jìn)行表達(dá)。此類方法可以包括在用于生產(chǎn)所述抗體VH可變結(jié)構(gòu)域或引起所述抗體VH結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。[0079]用于生產(chǎn)VL可變結(jié)構(gòu)域以及包括VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員的類似方法作為本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供。[0080]生產(chǎn)方法可以包括產(chǎn)物的分離和/或純化的步驟。[0081]生產(chǎn)方法可以包括將產(chǎn)物配制到包含至少一種另外組分例如藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物中。[0082]本發(fā)明的這些及其他方面在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。[0083]發(fā)明詳述[0084]術(shù)語(yǔ)[0085]特異件結(jié)合成員[0086]這描述了具有對(duì)于彼此的結(jié)合特異性的分子對(duì)的成員。特異性結(jié)合對(duì)的成員可以是天然衍生的或者完全或部分合成產(chǎn)生的。分子對(duì)的一個(gè)成員在其表面上具有區(qū)域或腔，所述區(qū)域或腔特異地結(jié)合在該分子對(duì)的另一成員表面上的區(qū)域或在其中的腔。因此，所述對(duì)的成員具有互相特異地結(jié)合的特性。本發(fā)明與結(jié)合靶抗原的特異性結(jié)合成員有關(guān)。[0087]特異件的[0088]這可以用于指這樣的情況，即特異性結(jié)合成員將不顯示任何顯著的與來(lái)自給定動(dòng)物的除了其特異性結(jié)合配偶體之外的其他分子的結(jié)合。例如，對(duì)人TGF0特異的特異性結(jié)合成員與其他非TGF-β人分子將不具有顯著結(jié)合，然而它可以與來(lái)自其他物種的TGF-β交叉反應(yīng)。[0089]抗原結(jié)合性特異性結(jié)合成員包括抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如，特異性結(jié)合成員可以是抗體分子?？乖Y(jié)合位點(diǎn)還可以通過(guò)將CDRs排列在非抗體蛋白質(zhì)支架例如纖連蛋白或細(xì)胞色素B等上來(lái)提供（Koide等人，（1998)JournalofMolecularBiology，284:1141_1151;Nygren等人（1997)CurrentOpinioninStructuralBiology，第7卷：463-469)。用于改造蛋白質(zhì)中的新型結(jié)合位點(diǎn)的支架已由Nygren等人（同上）詳細(xì)進(jìn)行了綜述。用于抗體模擬物的蛋白質(zhì)支架在W000/34784中公開(kāi)，其描述了包括具有至少一個(gè)隨機(jī)化環(huán)的III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域（fibronectintypeIIIdomain)的蛋白質(zhì)（抗體模擬物）。其中接枝一個(gè)或多個(gè)CDRs例如HCDRs組的合適支架可以由免疫球蛋白基因超家族的任何結(jié)構(gòu)域成員提供。支架可以是人或非人蛋白質(zhì)。[0090]非抗體蛋白質(zhì)支架的優(yōu)點(diǎn)是，它可以提供在保守框架區(qū)中的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其比至少某些抗體分子更小和/或更容易制備。特異性結(jié)合成員的小尺寸可以賦予有用的生理學(xué)特性，例如進(jìn)入細(xì)胞、滲透到組織深處或到達(dá)在其他結(jié)構(gòu)中的靶的能力，或者在靶抗原的蛋白質(zhì)腔內(nèi)進(jìn)行結(jié)合的能力。[0091]非抗體蛋白質(zhì)支架中的抗原結(jié)合位點(diǎn)的用途在WeSS，2004中進(jìn)行了綜述。通常的是具有穩(wěn)定的主鏈以及一個(gè)或多個(gè)可變環(huán)的蛋白質(zhì)，其中環(huán)的氨基酸序列特異地或隨機(jī)地突變以產(chǎn)生具有對(duì)于結(jié)合靶抗原而言的特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。此類蛋白質(zhì)包括來(lái)自金黃色葡萄球菌（s.aureus)的A蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、四連蛋白、纖連蛋白（例如第10個(gè)III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域）和脂籠蛋白的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其他方法包括合成的"微體(Microbodies)"(SelecoreGmbH)，其基于大環(huán)寡肽（cyclotides)，所述大環(huán)寡肽是具有分子內(nèi)-硫鍵的小蛋白質(zhì)。[0092]除了抗體序列和/或抗原結(jié)合位點(diǎn)外，根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以包括其他氨基酸，所述其他氨基酸例如形成肽或多肽，例如折疊的結(jié)構(gòu)域，或者賦予該分子除了結(jié)合抗原的能力以外的另一種功能特征。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以攜帶可檢測(cè)的標(biāo)記，或可以綴合至毒素或靶向性部分或酶（例如，經(jīng)由肽基鍵或連接體）。例如，特異性結(jié)合成員可以包括催化位點(diǎn)（例如在酶結(jié)構(gòu)域中）以及抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合抗原并因此將所述催化位點(diǎn)靶向抗原。所述催化位點(diǎn)可以抑制該抗原的生物學(xué)功能，例如通過(guò)切割。[0093]盡管如所注明的，⑶Rs可以由支架例如纖連蛋白或細(xì)胞色素B攜帶(Haan&Maggos，2004BioCentury，12(5):A1_A6;Koide等人，同上；Nygren等人，同上），但用于攜帶本發(fā)明的CDR或CDRs組的結(jié)構(gòu)一般將具有抗體重鏈或輕鏈序列或其基本部分，在所述基本部分中所述CDR或CDRs組位于相應(yīng)于由經(jīng)重排的免疫球蛋白基因編碼的天然存在的VH和VL抗體可變結(jié)構(gòu)域的⑶R或⑶Rs組的位置處。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置可以通過(guò)參考Kabat，等人，1987及其最新資料來(lái)確定，所述資料現(xiàn)在在因特網(wǎng)(http://immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎查找"Kabat"）上可獲得。[0094]抗體分子[0095]這描述了無(wú)論是天然的還是部分或全部合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了包括抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽或蛋白質(zhì)。包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段是諸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和雙抗體的分子。[0096]在人種系細(xì)胞的基因組中，抗體多肽鏈的遺傳信息包含于在沿著不同染色體分散的基因座內(nèi)的多個(gè)基因區(qū)段中。人重鏈（VH)在第14號(hào)染色體上編碼，κ輕鏈（Vk)在第2號(hào)染色體上編碼，并且λ輕鏈（Vλ)在第22號(hào)染色體上編碼。在B-淋巴細(xì)胞（抗體生成細(xì)胞）的發(fā)育過(guò)程中，在這些基因座中的基因區(qū)段通過(guò)重組進(jìn)行裝配，導(dǎo)致形成完整的抗體重鏈或輕鏈基因（TonegawaS.Nature，302,575-81，1983)?？贵w恒定區(qū)（VH，Vk和νλ)在整個(gè)人群中大部分是相同的，但在可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在相當(dāng)大的多樣性。這樣的多樣性使得能夠形成數(shù)十億種不同的抗體，每種抗體具有對(duì)于不同靶抗原的特異性。[0097]在抗體可變區(qū)內(nèi)的多樣性是以幾種方式產(chǎn)生的。首先，在基因水平上，在抗體可變種系基因序列中存在相當(dāng)大的多樣性。已描述了大約50種不同的VH種系（TomlinsonI.M.等人，J.Mol.Biol.，227,776-798,1992),35種不同的Vk種系（TomlinsonI.M.等人，EMB0J，14,4628-38，1995)和30種不同的Vλ種系（WilliamsS·C·&WinterG·Eur·J.Immunol，23，1456_61，1993;KawasakiK.等人，GenomeRes，7,250_61，1997)?？贵w由這些種系基因序列的不同組合產(chǎn)生。然后，通過(guò)諸如體細(xì)胞重組和超變的過(guò)程將進(jìn)一步的多樣性引入抗體可變結(jié)構(gòu)域中（TonegawaS.Nature，302,575-81，1983)。[0098]盡管在抗體可變種系基因序列中存在相當(dāng)大的多樣性，但基于序列同源性可以將這些序列分組為家族。50種不同的VH基因序列可以分組為7個(gè)家族，35種Vk序列可以分組為6個(gè)家族，和30種νλ序列可以分組為10個(gè)家族。這些組在大小上從1個(gè)成員（VH6和Vk4)到至多21個(gè)成員（VH3)不等，并且每個(gè)組的成員共享高度的序列同源性。[0099]可以將抗體與VH和VL種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，以確定其最接近的種系匹配并鑒定由體細(xì)胞超變引入的任何氨基酸改變。研究已顯示，人免疫系統(tǒng)在免疫應(yīng)答過(guò)程中優(yōu)先于其他種系（例如VH2)而采用某些種系（例如VH3DP47)(KnappikA.等人，J.Mol.Biol，296,57-86,2000)。然而，通過(guò)噬菌體展示分離的抗體群通常采用廣泛范圍的種系基因，即使當(dāng)針對(duì)單一抗原進(jìn)行分離時(shí)（EdwardsB.等人，J.MolBiol,334,103-118,2003)。[0100]可以采取單克隆和其他抗體并使用重組DNA技術(shù)來(lái)產(chǎn)生保留原始抗體的特異性的其他抗體或嵌合分子。此類技術(shù)可以涉及將編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA與恒定區(qū)連接，或?qū)⒖贵w的互補(bǔ)性決定區(qū)（CDRs)引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)加框架區(qū)內(nèi)。參見(jiàn)，例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400,和大量后續(xù)文獻(xiàn)。可以對(duì)雜交瘤或產(chǎn)生抗體的其他細(xì)胞實(shí)施基因突變或其他改變，其可以改變或不可以改變所產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。[0101]因?yàn)榭贵w可以以多種方式進(jìn)行修飾，所以術(shù)語(yǔ)"抗體分子"應(yīng)當(dāng)被解釋為涵蓋任何特異性結(jié)合成員或物質(zhì)，所述特異性結(jié)合成員或物質(zhì)具有有著所需特異性的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此，這個(gè)術(shù)語(yǔ)涵蓋了抗體片段和衍生物，包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無(wú)論是天然的還是完全或部分合成的。因此包括了嵌合分子，其包含與另一種多肽融合的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等價(jià)物。嵌合抗體的克隆和表達(dá)在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及大量后續(xù)文獻(xiàn)中描述。[0102]在抗體改造領(lǐng)域中可用的進(jìn)一步技術(shù)已使得能夠分離人和人源化的抗體。例如，人雜交瘤可以如Kontermann等人（KontermannR和DubelStefan;AntibodyEngineering，Springer-VerlagNewYork，LLC;2001，ISBN:3540413545)所述進(jìn)行制備。噬菌體展示這一用于產(chǎn)生特異性結(jié)合成員的另一種已建立的技術(shù)已在許多出版物例如Kontermann等人（同上）和W092/01047(下文進(jìn)一步討論）中進(jìn)行了詳細(xì)描述。轉(zhuǎn)基因小鼠（其中小鼠抗體基因是失活的并用人抗體基因功能性地替代，同時(shí)保持小鼠免疫系統(tǒng)的其他組分完整）可以用于分離針對(duì)人抗原的人抗體（Mendez等人，1997)。單克隆或多克隆的人抗體，還可在其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物例如山羊、牛、綿羊、兔等中制備。[0103]合成的抗體分子可以通過(guò)從基因進(jìn)行表達(dá)而制備，所述基因借助于合成的并在合適的表達(dá)載體內(nèi)裝配的寡核苷酸而產(chǎn)生，例如如Knappik等人（同上）或Krebs等人，JournalofImmunologicalMethods254200167-84所描述的。[0104]已顯示，完整抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的例子是（i)由VL、CL、VH和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；（ii)由VH和CHI結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iii)由單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；（iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段（Ward，E.S.等人，Nature341,544-546(1989)，McCafferty等人（1990)Nature，348,552-554);(v)分離的⑶R區(qū)；（vi)F(ab'）2片段，其是包括兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；（vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽連接體連接，所述肽連接體允許這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域聯(lián)合以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)（Bird等人，Science，242,423-426,1988;Huston等人，？1'〇(：.似1:1·Acad.SciUSA85,5879-5883;1998);(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體（PCT/US92/09665);和（ix)"雙抗體"，其是通過(guò)基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段（W0/13804;F.H〇lliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,1993)。Fv、scFv或雙抗體分子可以通過(guò)引入連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的二硫橋來(lái)穩(wěn)定（Y.Reiter等人，NatureBiotech,14,1239-1245，1996)。還可制備包括與CH3結(jié)構(gòu)域連接的scFv的小抗體（minibodies)(S.Hu等人，CancerRes.,56,3055-3061,1996)〇[0105]dAb(結(jié)構(gòu)域抗體）是抗體的小單體型抗原結(jié)合性片段，即抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)（Holt等人，2003)。VHdAbs在駱駝科動(dòng)物（camelids)(例如駱駝，美洲駝）中天然存在，并且可以通過(guò)用靶抗原免疫駱駝科動(dòng)物、分離抗原特異性B細(xì)胞并從單個(gè)B細(xì)胞中直接克隆dAb基因來(lái)產(chǎn)生。dAbs還可在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生。其小尺寸、良好的溶解性和溫度穩(wěn)定性使得它們?cè)谏韺W(xué)上特別有用，并適合于選擇和親和力成熟。本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以是dAb，其包括基本上如本文列出的VH或VL結(jié)構(gòu)域，或含有基本上如本文列出的CDRs組的VH或VL結(jié)構(gòu)域。[0106]當(dāng)使用雙特異性抗體時(shí)，這些可以是常規(guī)的雙特異性抗體，其可以以各種方式進(jìn)行制備（Hoiliger，P.和WinterG.CurrentOpinionBiotechnol.4,446-449(1993))，例如采用化學(xué)方法或由雜種雜交瘤制備，或者可以是上文提及的雙特異性抗體片段中的任何一種。雙特異性抗體的例子包括BiTE?技術(shù)的那些，其中可以使用具有不同特異性的兩種抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并將它們經(jīng)由柔性短肽直接連接。這將兩種抗體組合在短的單個(gè)多肽鏈上。只使用可變結(jié)構(gòu)域可以構(gòu)建不含F(xiàn)c區(qū)的雙抗體和scFv，這有效地減少了抗獨(dú)特型反應(yīng)的影響。[0107]雙特異性雙抗體，與雙特異性完整抗體不同，也可以是特別有用的，因?yàn)樗鼈兛梢匀菀椎卦诖竽c桿菌（E.coli)中構(gòu)建并表達(dá)。使用噬菌體展示（W094/13804)從文庫(kù)中可以容易地選擇出具有合適的結(jié)合特異性的雙抗體（以及許多其他多肽例如抗體片段）。如果雙抗體的一個(gè)臂保持恒定，例如，具有針對(duì)TGFi3的特異性，那么就可以制備文庫(kù)，其中另一個(gè)臂是可變的，并且可以選擇出具有合適的特異性的抗體。雙特異性完整抗體可以通過(guò)knobs-into-holes改造進(jìn)行制備（C.E.B.Ridgeway等人，ProteinEng.，9,616_621,1996)。[0108]抗原結(jié)合位點(diǎn)[0109]這描述了特異性結(jié)合成員例如抗體分子的一部分，其接觸并與結(jié)合對(duì)中的另一個(gè)成員即抗原的部分或全部互補(bǔ)。在抗體分子中，抗原結(jié)合位點(diǎn)可以稱為抗體抗原-結(jié)合位點(diǎn)，并包括特異地結(jié)合并與靶抗原全部或部分互補(bǔ)的抗體的一部分。當(dāng)抗原很大時(shí)，抗體可以只結(jié)合抗原的特定部分，這個(gè)部分稱為表位。[0110]抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域[0111]抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是特異性結(jié)合成員的一部分，其包括抗原結(jié)合位點(diǎn)并結(jié)合靶抗原。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以由一個(gè)或多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域（例如，由VH結(jié)構(gòu)域組成的所謂的Fd抗體片段）或其抗原結(jié)合部分提供。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體輕鏈可變區(qū)（VL)和抗體重鏈可變區(qū)（VH)。[0112]特異性結(jié)合成員可以是天然地或通過(guò)各種真核細(xì)胞系統(tǒng)（例如，CH0或NS0(ECACC85110503)細(xì)胞）糖基化的，或它們可以是（例如，如果通過(guò)在原核細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生）未糖基化的。還可以有意地改變糖基化，例如通過(guò)抑制巖藻糖基化，以便增加所得抗體的ADCC活性。因此，本發(fā)明的特異性結(jié)合成員中的任何一個(gè)可以如此表達(dá)以便最小化或消除巖藻糖基化。[0113]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域?qū)?huì)與其序列被在本文中列出的指定區(qū)域等同或高度類似。預(yù)期可以在CDR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域中進(jìn)行1一5,優(yōu)選1一4或1或2,或3或4個(gè)氨基酸置換。高度類似于其序列被在本文中給出的那些的VH或VL結(jié)構(gòu)域以及CDRs和CDRs組由本發(fā)明的方面所涵蓋，正如其序列基本上如本文列出的那些一樣。[0114]用于攜帶本發(fā)明的⑶R或⑶Rs組的結(jié)構(gòu)一般將具有抗體重鏈或輕鏈序列或其基本部分，在所述基本部分中所述CDR或CDRs組位于相應(yīng)于由經(jīng)重排的免疫球蛋白基因編碼的天然存在的VH和VL抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR或CDRs組的位置處。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置可以通過(guò)參考Kabat，E.A.等人（SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.第四版.USDepartmentofHealthandHumanServices.1987)及其最新資料來(lái)確定，所述資料現(xiàn)在在因特網(wǎng)（http://immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎查找"Kabat"）上可獲得。CDRs根據(jù)Kabat等人進(jìn)行定義。[0115]⑶Rs還可由其他支架例如纖連蛋白或細(xì)胞色素B攜帶。[0116]優(yōu)選地，攜帶基本上如本文列出的CDR氨基酸序列作為在人可變結(jié)構(gòu)域或其基本部分中的CDR?；旧先绫疚牧谐龅腍CDR3序列代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且優(yōu)選地，攜帶這些中的每一個(gè)作為在人重鏈可變結(jié)構(gòu)域或其基本部分中的HCDR3。[0117]本發(fā)明中采用的可變結(jié)構(gòu)域可以由任何種系或重排人可變結(jié)構(gòu)域獲得或衍生，或者可以是基于已知人可變結(jié)構(gòu)域的共有或?qū)嶋H序列的合成的可變結(jié)構(gòu)域?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)將本發(fā)明的CDR序列（例如CDR3)引入缺乏CDR(例如CDR3)的可變結(jié)構(gòu)域儲(chǔ)庫(kù)中。優(yōu)選的種系框架已在本文中進(jìn)行了鑒定。[0118]例如，Marks等人（Bio/Technology，1992，邊：779-783)描述了產(chǎn)生抗體可變結(jié)構(gòu)域儲(chǔ)庫(kù)的方法，其中指向或鄰近可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域5'端的共有引物（consensusprimers)與針對(duì)人VH基因的第3個(gè)框架區(qū)的共有引物結(jié)合使用，以提供缺乏CDR2的VK可變結(jié)構(gòu)域儲(chǔ)庫(kù)。Marks等人進(jìn)一步描述了這個(gè)儲(chǔ)庫(kù)如何可以與特定抗體的⑶R2相組合。使用類似技術(shù)，本發(fā)明的⑶R3-衍生的序列可以與缺乏⑶R3的VH或VL結(jié)構(gòu)域儲(chǔ)庫(kù)進(jìn)行改組，并且經(jīng)改組的完整VH或VL結(jié)構(gòu)域與同族（cognate)VL或VH結(jié)構(gòu)域相組合以提供本發(fā)明的特異性結(jié)合成員。然后，儲(chǔ)庫(kù)可以在合適的宿主系統(tǒng)中展示，例如W092/01047的噬菌體展示系統(tǒng)，或大量后續(xù)文獻(xiàn)中的任何一個(gè)，包括Kay，B.K.，Winter，J.和McCafferty，J.(1996)PhageDisplayofPeptidesandProteins:ALaboratoryManual，SanDiego：AcademicPress，從而使得可以選擇合適的特異性結(jié)合成員。儲(chǔ)庫(kù)可以由104個(gè)單個(gè)成員以上組成，例如106至108或101°個(gè)成員。其他合適的宿主系統(tǒng)包括酵母展示、細(xì)菌展示、T7展示、核糖體展示、共價(jià)展示等等。[0119]類似的改組或組合技術(shù)還由Stemmer(Nature，1994,370:389-391)公開(kāi)，他描述了與β-內(nèi)酰胺酶基因有關(guān)的技術(shù)，但評(píng)述到該方法可以用于產(chǎn)生抗體。[0120]進(jìn)一步的備選方案是產(chǎn)生攜帶本發(fā)明的CDR-衍生的序列的新型VH或VL區(qū)，其中使用一個(gè)或多個(gè)所選擇的VH和/或VL基因的隨機(jī)誘變以產(chǎn)生在完整的可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的突變。此類技術(shù)由Gram等人（1992,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，型：3576-3580)描述，他們使用易錯(cuò)PCR。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在HCDRs和/或IXDRs組中進(jìn)行1個(gè)或2個(gè)氨基酸置換。[0121]可以使用的另一種方法是將誘變導(dǎo)向VH或VL基因的⑶R區(qū)。此類技術(shù)由Barbas等人（1994,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，^i:3809-3813)和Schier等人（1996,J.Mol.Biol.263:551-567)公開(kāi)。[0122]所有上述技術(shù)是在本領(lǐng)域中本身已知的，并且其自身不構(gòu)成本發(fā)明的一部分。在已知本文提供的公開(kāi)內(nèi)容的情況下，技術(shù)人員將能夠使用此類技術(shù)來(lái)通過(guò)使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法提供本發(fā)明的特異性結(jié)合成員。[0123]本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面提供了用于獲得對(duì)TGF0抗原特異的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的方法，該方法包括通過(guò)在本文列出的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、刪除、置換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)提供作為所述VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體的VH結(jié)構(gòu)域，任選地將如此提供的VH結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域相組合，并測(cè)試VH結(jié)構(gòu)域或VH/VL組合以鑒定對(duì)TGFi3特異并任選地具有一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選特性的特異性結(jié)合成員或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選特性優(yōu)選為中和TGFi3活性的能力。所述VL結(jié)構(gòu)域可以具有基本上如本文列出的氨基酸序列。[0124]可以采用類似方法，其中本文公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)序列變體與一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域相組合。[0125]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以對(duì)PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10VH結(jié)構(gòu)域?qū)嵤┩蛔円蕴峁┮粋€(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體，其可以與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域相組合。[0126]本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面提供了用于制備對(duì)所有3種人TGFβ同種型特異的特異性結(jié)合成員，所述方法包括：[0127](a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的起始儲(chǔ)庫(kù)，所述VH結(jié)構(gòu)域包括待被替代的CDR3或缺乏⑶R3編碼區(qū)；[0128](b)將所述儲(chǔ)庫(kù)與編碼基本上如本文對(duì)于HCDR3而列出的氨基酸序列的供體核酸組合，從而使得所述供體核酸插入儲(chǔ)庫(kù)的CDR3區(qū)內(nèi)，以便提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸的產(chǎn)物儲(chǔ)庫(kù)；[0129](c)表達(dá)所述產(chǎn)物儲(chǔ)庫(kù)的核酸；[0130](d)選擇對(duì)至少一種TGF0同種型特異的特異性結(jié)合成員；和[0131](e)回收所述特異性結(jié)合成員或編碼其的核酸。[0132]該方法可以進(jìn)一步包括下述步驟：用3種TGFi3同種型中的每一種進(jìn)行結(jié)合測(cè)定法和中和測(cè)定法，以鑒定結(jié)合并中和所有3種同種型的特異性結(jié)合成員。[0133]此外，可以采用類似方法，其中本發(fā)明的LCDR3與編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸的儲(chǔ)庫(kù)相組合，所述VL結(jié)構(gòu)域包括待被替代的⑶R3或缺乏⑶R3編碼區(qū)。[0134]類似地，一個(gè)或多個(gè)，或所有3個(gè)⑶Rs可以接枝到VH或VL結(jié)構(gòu)域的儲(chǔ)庫(kù)中，隨后對(duì)它們進(jìn)行篩選以獲得對(duì)所有人TGFi3同種型特異的特異性結(jié)合成員。[0135]VH結(jié)構(gòu)域可以具有種系序列，并且在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中是DP-10或DP-88。VL結(jié)構(gòu)域序列可以具有種系序列，并且在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中是DPK-22。[0136]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以采用PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個(gè)或多個(gè)，或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的HCDRs組，和/或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10LCDRl、LCDR2和LCDR3中的一個(gè)或多個(gè)，或PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10的LCDRs組。[0137]免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的基本部分將包括至少所述3個(gè)CDR區(qū)，連同它們的間插框架區(qū)。優(yōu)選地，該部分將還包括第1個(gè)和第4個(gè)框架區(qū)中任一個(gè)或兩個(gè)的至少約50%，該50%是第1個(gè)框架區(qū)的C-末端50%和第4個(gè)框架區(qū)的N-末端50%。在可變結(jié)構(gòu)域的基本部分的N-末端或C-末端的另外殘基可以是通常不與天然存在的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域相關(guān)聯(lián)的那些。例如，通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行的本發(fā)明特異性結(jié)合成員的構(gòu)建可以導(dǎo)致引入由被導(dǎo)入以促進(jìn)克隆或其他操作步驟的連接體編碼的N-或C-末端殘基。其他操作步驟包括導(dǎo)入連接體以將本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域連接至包括免疫球蛋白重鏈的進(jìn)一步的蛋白質(zhì)序列、其他可變結(jié)構(gòu)域（例如在雙抗體的產(chǎn)生中）或蛋白質(zhì)標(biāo)記，如本文其他地方更詳細(xì)地討論的。[0138]盡管在本發(fā)明的優(yōu)選方面，包括VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)Φ奶禺愋越Y(jié)合成員是優(yōu)選的，但基于VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了本發(fā)明的進(jìn)一步方面。已知單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，尤其是VH結(jié)構(gòu)域，能夠以特異的方式結(jié)合靶抗原。[0139]在任一種單個(gè)特異性結(jié)合成員的情況下，這些結(jié)構(gòu)域可以用于篩選能夠形成二結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合成員的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域，所述二結(jié)構(gòu)域特異性成員能夠結(jié)合3種人TGFi3同種型。[0140]這可以通過(guò)噬菌體展示篩選方法，使用如W092/01047中公開(kāi)的所謂的梯級(jí)雙重組合方法（hierarchicaldualcombinatorialapproach)來(lái)完成，其中包含Η或L鏈克隆的單個(gè)集落用于感染編碼另一鏈（L或Η)的完整克隆文庫(kù)，并且根據(jù)噬菌體展示技術(shù)例如在那個(gè)參考文獻(xiàn)中所描述的那些來(lái)選擇所得的二鏈特異性結(jié)合成員。這項(xiàng)技術(shù)還在Marks等人（同前）中公開(kāi)。[0141]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以進(jìn)一步包括抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL結(jié)構(gòu)域可以以其C-末端附著至抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，包括人CK或匕鏈，優(yōu)選CK鏈。類似地，基于VH結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合成員可以以其C-末端附著至免疫球蛋白重鏈的所有或部分（例如CH1結(jié)構(gòu)域），所述免疫球蛋白重鏈源自任何抗體同種型，例如IgG、IgA、IgE和IgM，以及同種型亞類中的任何一種，優(yōu)選IgGl和IgG4。IgG4是優(yōu)選的。IgG4對(duì)于某些應(yīng)用是優(yōu)選的，因?yàn)樗唤Y(jié)合補(bǔ)體并且不產(chǎn)生效應(yīng)子功能。當(dāng)效應(yīng)子功能是希望的時(shí)，IgGl是優(yōu)選的。效應(yīng)子功能還可通過(guò)采用本領(lǐng)域已知的方法，經(jīng)由操控抗體的糖基化狀態(tài)例如通過(guò)減少巖藻糖含量而增加。重鏈可以具有或不具有C-末端賴氨酸殘基。具有這些特性并穩(wěn)定可變區(qū)的任何合成或其他恒定區(qū)變體對(duì)于在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用來(lái)說(shuō)也是優(yōu)選的。[0142]也在本發(fā)明內(nèi)的是本文公開(kāi)的特異性結(jié)合成員或其抗原結(jié)合片段的異質(zhì)性制備物。例如，此類制備物可以是抗體的混合物，所述抗體具有全長(zhǎng)重鏈和缺乏C-末端賴氨酸的重鏈，具有各種程度的糖基化，具有衍生的氨基酸（例如N-末端谷氨酸環(huán)化以形成焦谷氨酸殘基）和/或具有脫酰胺形式的重鏈和/或輕鏈。[0143]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以用可檢測(cè)的或功能性的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記?？蓹z測(cè)的標(biāo)記包括放射性標(biāo)記，例如1311或"TC，其可以使用抗體成像領(lǐng)域中已知的常規(guī)化學(xué)附著至本發(fā)明的抗體。標(biāo)記還包括酶標(biāo)記例如辣根過(guò)氧化物酶。標(biāo)記進(jìn)一步包括化學(xué)部分，例如生物素，其可以經(jīng)由與特異性同族可檢測(cè)部分例如經(jīng)標(biāo)記的抗生物素蛋白結(jié)合而進(jìn)行檢測(cè)。[0144]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員被設(shè)計(jì)成在人或動(dòng)物受試者（優(yōu)選人）的診斷或治療方法中使用。[0145]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的特異性結(jié)合成員抑制TGFi31、2和/或3與細(xì)胞表面TGFβ受體或受體復(fù)合物（包括，但不限于，包括受體絲氨酸/蘇氨酸激酶I型或II型和蛋白聚糖β_聚糖（TGFi3III型受體）的復(fù)合物）的結(jié)合。因此，本發(fā)明包括用于抑制TGFi3與細(xì)胞表面TGFi3受體或受體復(fù)合物的結(jié)合的方法，包括使TGFi3與本發(fā)明的特異性結(jié)合成員接觸并檢測(cè)與所述受體或受體復(fù)合物結(jié)合的抑制的步驟。在各種實(shí)施方案中，TGFi3與其受體結(jié)合的抑制可以通過(guò)下列表明：TGFi3I型受體的磷酸化減少、TGFi3I型受體的激活減少、R-SMAD蛋白特別是SMAD2和SMAD3的磷酸化和/或激活減少、所述SMAD蛋白至細(xì)胞核的移位減少、SMAD蛋白與DNA的結(jié)合減少和/或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，所述基因在所述細(xì)胞或細(xì)胞類型中的表達(dá)已知通過(guò)TGFi3信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行調(diào)節(jié)。進(jìn)一步的測(cè)定法在實(shí)施例中闡述。[0146]因此，本發(fā)明的進(jìn)一步方面提供了包括施用所提供的特異性結(jié)合成員的治療方法，包含此類特異性結(jié)合成員的藥物組合物，以及此類特異性結(jié)合成員在制備用于施用的藥物中的用途，例如在制備藥物或藥物組合物的方法中，該方法包括用藥學(xué)上可接受的賦形劑配制所述特異性結(jié)合成員。[0147]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以通過(guò)注射（例如皮下、靜脈內(nèi)、腔內(nèi)（例如腫瘤切除術(shù)后）、損傷內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)），通過(guò)吸入，或局部（例如眼內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸、傷口內(nèi)、皮膚上）或口服施用。施用途徑可以通過(guò)產(chǎn)品的物理化學(xué)特征，通過(guò)疾病的特別考慮，通過(guò)劑量或給藥間隔，或者通過(guò)對(duì)于優(yōu)化功效或最小化副作用的要求來(lái)確定。[0148]設(shè)想抗TGF0治療將不限于由衛(wèi)生保健專業(yè)人士施用。因此，皮下注射，尤其是使用不含針頭的裝置，可以是適當(dāng)?shù)?。[0149]根據(jù)本發(fā)明，所提供的組合物可以施用給有此需要的個(gè)體。施用優(yōu)選以"治療有效量"，這足以顯示對(duì)患者的利益。此類利益可以是至少改善特定疾病或病癥的至少一種癥狀。所施用的實(shí)際量，以及施用率和時(shí)間過(guò)程，將取決于被治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重度。治療處方，例如關(guān)于劑量等的決定，可以基于臨床前和臨床研究來(lái)確定，所述研究的設(shè)計(jì)完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平內(nèi)。[0150]精確劑量將取決于許多因素，包括所述抗體是用于診斷還是用于治療，待治療區(qū)域的大小和位置，抗體的精確性質(zhì)（例如，完整抗體、片段或雙抗體），以及附著至所述抗體的任何可檢測(cè)標(biāo)記或其他分子的性質(zhì)。一般的抗體劑量對(duì)于全身應(yīng)用來(lái)說(shuō)將是?〇〇μg-lmg，并且對(duì)于局部應(yīng)用來(lái)說(shuō)將是1μg-lmg。一般地，抗體將是完整的抗體，優(yōu)選IgG4同種型。這是對(duì)于成人患者的單一治療的劑量，對(duì)于兒童和嬰兒它可以按比例調(diào)整，并且還可以對(duì)于其他抗體形式按分子量和活性而成比例地調(diào)整。根據(jù)醫(yī)師的判斷，治療可以按每天一次、每周二次、每周一次、每月一次或其他時(shí)間間隔重復(fù)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，治療是周期性的，并且施用之間的時(shí)期是約2周或更多，優(yōu)選約3周或更多，更優(yōu)選約4周或更多，或約一月一次。[0151]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員將通常以藥物組合物的形式施用，其可以包含除特異性結(jié)合成員以外的至少一種組分。[0152]因此，除活性成分以外，根據(jù)本發(fā)明的并依據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用的藥物組合物可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖質(zhì)、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其他材料。此類材料應(yīng)當(dāng)是非毒性的并且不應(yīng)干擾活性成分的功效。此類材料可以包括，例如任何一種和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑以及生理學(xué)相容的物質(zhì)等。藥學(xué)上可接受的載體的一些例子是水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其組合。在許多情況下，在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化鈉將是優(yōu)選的。藥學(xué)上可接受的物質(zhì)的另外例子是濕潤(rùn)劑或少量輔助物質(zhì)例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑或緩沖質(zhì)，其增強(qiáng)抗體的保存期或效用。載體或其他材料的精確性質(zhì)將取決于施用途徑，所述施用途徑可以是口服、局部、通過(guò)吸入或通過(guò)注射，例如靜脈內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體通過(guò)靜脈內(nèi)輸注或注射進(jìn)行施用。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體通過(guò)肌內(nèi)或皮下注射進(jìn)行施用。[0153]用于口服施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊、粉劑或液體形式，例如含有惰性稀釋劑或可同化的可食用載體。片劑可以包含固體載體例如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般包含液體載體例如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油。可以包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖類溶液或者二醇例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。特異性結(jié)合成員（需要時(shí)，以及其他成分）還可包封在硬或軟殼明膠膠囊內(nèi)，壓縮成片劑，或直接摻入受試者飲食中。對(duì)于口服治療施用，活性成分可以與賦形劑相摻合，并以可吸收的片劑（ingestibletablets)、頰含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿劑、糯米紙囊劑等的形式進(jìn)行使用。為了通過(guò)除腸胃外施用以外的其他方式施用本發(fā)明的化合物，可能必需用防止其失活的材料包被所述化合物或?qū)⑺龌衔锱c所述材料共施用。[0154]對(duì)于靜脈內(nèi)注射，或在痛苦部位注射，活性成分將是腸胃外可接受的水溶液的形式，其是無(wú)熱原的并且具有合適的ρκ、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員將十分能夠例如使用等滲媒介物例如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸鹽林格注射液來(lái)制備合適的溶液。需要時(shí)，可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖質(zhì)、抗氧化劑和/或其他添加劑。[0155]組合物可以單獨(dú)或與其他治療相組合地同時(shí)或順次施用，這取決于被治療的病狀。[0156]本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以以液體、半固體或固體形式進(jìn)行配制，例如液體溶液（例如，可注射的和可輸注的溶液）、分散系或懸浮液、片劑、丸劑、粉劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于所希望的施用形式、治療應(yīng)用、所述分子的物理化學(xué)特性和遞送途徑。制劑可以包含賦形劑、或賦形劑的組合，例如：糖、氨基酸和表面活性劑。液體制劑可以包含廣泛范圍的抗體濃度和pH。固體制劑可以通過(guò)例如凍干、噴霧干燥、或經(jīng)超臨界流體技術(shù)進(jìn)行干燥來(lái)生產(chǎn)。[0157]通常，治療組合物在制造和貯存條件下必須是無(wú)菌的和穩(wěn)定的。組合物可以配制為溶液、微乳液、分散系、脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。無(wú)菌可注射溶液可以通過(guò)下列方式制備：在需要時(shí)將在合適溶劑中的所需量的特異性結(jié)合成員與上文列舉的一種成分或成分組合相摻合，隨后過(guò)濾滅菌。一般地，分散系通過(guò)將活性化合物整合入無(wú)菌媒介物中進(jìn)行制備，所述無(wú)菌媒介物包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來(lái)自上文列舉的那些中的所需的其他成分。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這種干燥方式從其先前無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。溶液的合適流動(dòng)性可以通過(guò)下列方式來(lái)維持：例如，通過(guò)使用包衣例如卵磷脂，在分散系的情況下通過(guò)維持所需顆粒大小，和通過(guò)使用表面活性劑。通過(guò)在組合物中包括延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和明膠可以導(dǎo)致可注射組合物的吸收延長(zhǎng)。[0158]在某些實(shí)施方案中，抗體組合物活性化合物可以用保護(hù)抗體不被快速釋放的載體進(jìn)行制備，例如受控釋放制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠囊化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備此類制劑的許多方法是被授予專利權(quán)的，或者一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)，例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems(J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1978)〇[0159]本發(fā)明提供了包括引起或允許本文提供的特異性結(jié)合成員結(jié)合TGFi3的方法。如所注明的，此類結(jié)合可以在體內(nèi)發(fā)生，例如在給患者施用特異性結(jié)合成員或編碼特異性結(jié)合成員的核酸后，或者它可以在體外發(fā)生，例如在ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀、親和層析、或基于細(xì)胞的測(cè)定法中，或者在基于離體的治療方法（例如，其中將細(xì)胞或體液離體與根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員接觸并隨后施用給患者的方法）中。[0160]可以測(cè)定與TGFi3結(jié)合的特異性結(jié)合成員的量。定量結(jié)果可以與測(cè)試樣品中的抗原量相關(guān)，這可能具有診斷意義。[0161]還提供了包括根據(jù)本發(fā)明任何方面或?qū)嵤┓桨傅奶禺愋越Y(jié)合成員或抗體分子的試劑盒，作為本發(fā)明的一個(gè)方面。在本發(fā)明的試劑盒中，特異性結(jié)合成員或抗體分子可以進(jìn)行標(biāo)記以允許測(cè)定其在樣品中的反應(yīng)性，例如，如下文進(jìn)一步描述的。試劑盒的組分一般是無(wú)菌的并且在密封的小瓶或其他容器中。試劑盒可以在診斷分析或其中抗體分子是有用的其他方法中采用。試劑盒可以包含關(guān)于在方法例如根據(jù)本發(fā)明的方法中使用所述組分的說(shuō)明書(shū)。幫助或使得能夠執(zhí)行此類方法的輔助材料可以包括在本發(fā)明的試劑盒內(nèi)。[0162]樣品中抗體的反應(yīng)性可以通過(guò)任何合適的方法進(jìn)行測(cè)定。放射免疫測(cè)定法（RIA)是一種可能性。將放射性標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原（測(cè)試樣品）混合并允許其結(jié)合抗體。將結(jié)合的抗原與未結(jié)合的抗原在物理上分離，并且測(cè)定與抗體結(jié)合的放射性抗原的量。測(cè)試樣品中的抗原越多，與抗體結(jié)合的放射性抗原就越少。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法還可與非放射性抗原一起使用，使用與報(bào)告分子連接的抗原或類似物。報(bào)告分子可以是具有光譜學(xué)上分開(kāi)的吸收或發(fā)射特征的熒光染料、磷光體或激光染料。合適的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白或德克薩斯紅。合適的生色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。[0163]其他報(bào)告物包括大分子膠?；蝾w粒材料例如膠乳珠，它們是有色、磁性或順磁性的，以及可以直接或間接引起可被肉眼觀察、被在電子學(xué)上檢測(cè)或記錄的可檢測(cè)信號(hào)的生物學(xué)或化學(xué)活性劑。這些分子可以是例如催化反應(yīng)的酶，所述反應(yīng)產(chǎn)生或改變顏色或者引起電特性的改變。它們可以是可分子激發(fā)的（molecularlyexcitable),從而使得能態(tài)之間的電子躍遷導(dǎo)致特征性的光譜吸收或發(fā)射。它們可以包括與生物傳感器結(jié)合使用的化學(xué)實(shí)體?？梢圆捎蒙锼?抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物素蛋白和堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)。通過(guò)單個(gè)抗體-報(bào)告物綴合物產(chǎn)生的信號(hào)可以用于衍生在樣品（正常和測(cè)試）中相關(guān)抗體結(jié)合的可定量的絕對(duì)或相對(duì)數(shù)據(jù)。[0164]本發(fā)明還提供了如上的特異性結(jié)合成員用于測(cè)量競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中的抗原水平的用途，也就是說(shuō)通過(guò)在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中采用本發(fā)明所提供的特異性結(jié)合成員來(lái)測(cè)量樣品中抗原水平的方法。這可以是結(jié)合的與未結(jié)合的抗原的物理分離不是必需的情況。將報(bào)告分子與特異性結(jié)合成員連接，從而在結(jié)合后發(fā)生物理或光學(xué)改變，是一種可能性。報(bào)告分子可以直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)的并優(yōu)選可測(cè)量的信號(hào)。報(bào)告分子的連接可以是直接或間接的、共價(jià)的（例如經(jīng)由肽鍵）或非共價(jià)的。經(jīng)由肽鍵的連接可能是編碼抗體和報(bào)告分子的基因融合物的重組表達(dá)的結(jié)果。[0165]本發(fā)明還提供了，例如在生物傳感器系統(tǒng)中通過(guò)采用根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員來(lái)直接測(cè)量抗原水平。[0166]測(cè)定結(jié)合的方式不是本發(fā)明的特征，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)其偏好和一般知識(shí)選擇合適的方式。[0167]如所注明的，在各個(gè)方面和實(shí)施方案中，本發(fā)明擴(kuò)展至人、人源化、嵌合或合成的特異性結(jié)合成員，其與本文定義的任何特異性結(jié)合成員例如PET1037GR、PET1074B9或ET1287A10IgG4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGFi3(TGFi31、2和/或3)。結(jié)合成員之間的競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)可以在體外容易地進(jìn)行測(cè)定，例如通過(guò)將特異性報(bào)告分子標(biāo)記至一個(gè)結(jié)合成員，其可以在其他未標(biāo)記的結(jié)合成員存在下進(jìn)行檢測(cè)，從而使得能夠鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的特異性結(jié)合成員。[0168]可以使用例如ELISA來(lái)測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)，其中TGFi3被固定至平板，并且將第一種經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合成員（參照結(jié)合成員）連同一種或多種其他未標(biāo)記的結(jié)合成員一起加入平板中。通過(guò)由經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合成員發(fā)出的信號(hào)減少而觀察到與經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合成員進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)的未標(biāo)記的結(jié)合成員的存在。[0169]在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)試中，可以采用抗原的肽片段，特別是包括目的表位的肽?？梢允褂镁哂斜砦恍蛄屑由显谌魏我粋€(gè)末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽。此類肽可以說(shuō)"基本上由指定序列組成"。根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員可以是這樣的，即它們與抗原的結(jié)合被具有或包括給定序列的肽所抑制。在為此的測(cè)試中，可以使用具有任一序列加上一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽。[0170]結(jié)合特定肽的特異性結(jié)合成員可以例如通過(guò)用所述肽進(jìn)行淘選而從噬菌體展示文庫(kù)中分離。[0171]本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本發(fā)明的特異性結(jié)合成員的分離的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明提供了這樣的核酸，其編碼如上定義的本發(fā)明的CDR或CDRs組，或抗體抗原-結(jié)合位點(diǎn)，或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域，或抗體分子，例如scFv或IgG4。[0172]本發(fā)明還提供了質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，其包括至少一個(gè)如上的多核苷酸。[0173]本發(fā)明還提供了重組宿主細(xì)胞，其包含一種或多種如上的構(gòu)建體。編碼所提供的任何⑶R或CDRs組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體分子例如scFv或IgG4的核酸，其自身形成本發(fā)明的一個(gè)方面，正如生產(chǎn)所編碼的產(chǎn)物的方法一樣，所述方法包括從編碼其的核酸進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)可以方便地通過(guò)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)包含所述核酸的重組宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。在通過(guò)表達(dá)而產(chǎn)生后，VH或VL結(jié)構(gòu)域，或特異性結(jié)合成員，可以使用任何合適的技術(shù)進(jìn)行分離和/或純化，隨后在適當(dāng)時(shí)進(jìn)行使用。[0174]根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域以及編碼性核酸分子和載體可以以基本上純或同質(zhì)的形式被提供為分離和/或純化的形式（例如從其天然環(huán)境中），或在核酸的情況下，不含或基本上不含除編碼具有所需功能的多肽的序列以外的其他核酸或基因來(lái)源。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以包括DNA和RNA，或可以是完全或部分合成的。當(dāng)提及本文列出的核苷酸序列時(shí)，涵蓋了具有指定序列的DNA分子，并涵蓋了具有其中U代替T的指定序列的RNA分子，除非上下文在其他方面要求。[0175]用于在各種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是眾所周知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、真菌、酵母和轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物。本領(lǐng)域可用的用于表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CH0)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NS0小鼠黑素瘤細(xì)胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、人胚視網(wǎng)膜細(xì)胞以及許多其他細(xì)胞。常用的、優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。[0176]抗體和抗體片段在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中的表達(dá)是本領(lǐng)域中良好建立的。關(guān)于綜述，參見(jiàn)例如Plilckthun，A.Bio/Technology這：545-551(1991)。在培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是可用的，這可作為用于生產(chǎn)特異性結(jié)合成員的一個(gè)選擇，例如ChaddHE和ChamowSM(2001)llOCurrentOpinioninBiotechnology12:188-194：AndersenDC和KrummenL(2002)CurrentOpinioninBiotechnologyl3:117；LarrickJff和ThomasDW(2001)CurrentOpinioninBiotechnologyl2：411~418〇[0177]可以選擇或構(gòu)建合適的載體，其包含合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、多腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因以及其他合適序列。適當(dāng)?shù)?，載體可以是質(zhì)粒，病毒例如噬菌體或噬菌粒、或腺病毒、AAV、慢病毒等。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)例如MolecularCloning：ALaboratoryManual,第三版,Sambrook和Russell,2001，ColdSpringHarborLaboratoryPress。用于操作核酸的許多已知技術(shù)和規(guī)程，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測(cè)序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)，以及蛋白質(zhì)分析在CurrentProtocolsinMolecularBiology,第二版，Ausubel等人（編者），JohnWiley&Sons，1986；ShortProtocolsinMolecularBiology：ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人（編者），JohnWiley&Sons，第四版，1999中詳細(xì)描述。Sambrook等人和Ausubel等人（兩者）的公開(kāi)內(nèi)容引入本文作為參考。[0178]因此，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供了包含本文所公開(kāi)的核酸的宿主細(xì)胞。此類宿主細(xì)胞可以處于體外或者可以是培養(yǎng)的。此類宿主細(xì)胞可以處于體內(nèi)。所述宿主細(xì)胞的體內(nèi)存在可以允許本發(fā)明的特異性結(jié)合成員作為"胞內(nèi)抗體"或細(xì)胞內(nèi)抗體進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)。胞內(nèi)抗體可以用于基因治療（MarascoWA(1997)GeneTherapy,丑（1):11)。[0179]一個(gè)再進(jìn)一步的方面提供了包括將此類核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法。所述導(dǎo)入可以采用任何可用的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、和使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒（例如牛痘，或?qū)τ诶ハx(chóng)細(xì)胞來(lái)說(shuō)是桿狀病毒）的轉(zhuǎn)導(dǎo)。將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，特別是真核細(xì)胞中，可以使用病毒系統(tǒng)或基于質(zhì)粒的系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可以保持游離狀態(tài)或可以引入宿主細(xì)胞中或人工染色體中（CsonkaE等人（2000)JournalofCellScience，113:3207-3216;VanderbylS等人(2002)MolecularTherapy，豆(5):10。所述引入可以是將一個(gè)或多個(gè)拷貝隨機(jī)地或靶向整合在單個(gè)或多個(gè)基因座上。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可以包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和使用噬菌體的轉(zhuǎn)染。[0180]導(dǎo)入之后可以是引起或允許從所述核酸的表達(dá)，例如通過(guò)在用于表達(dá)該基因的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。[0181]在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的核酸整合到宿主細(xì)胞的基因組（例如染色體）中?？梢砸罁?jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)包含促進(jìn)與基因組重組的序列來(lái)促進(jìn)整合。[0182]本發(fā)明還提供了方法，其包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用如上所述的構(gòu)建體，以便表達(dá)如上的特異性結(jié)合成員或多肽。[0183]本發(fā)明的核酸分子可以經(jīng)由基因療法施用給有此需要的患者。該療法可以是體內(nèi)的或離體的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將編碼重鏈和輕鏈的核酸分子施用給患者。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子是這樣施用的，即使得它們穩(wěn)定整合到B細(xì)胞的染色體中，因?yàn)檫@些細(xì)胞專門(mén)用于產(chǎn)生抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，前體B細(xì)胞是離體轉(zhuǎn)染或感染的，并再移植到有此需要的患者中。在另一實(shí)施方案中，前體B細(xì)胞或其他細(xì)胞使用已知感染目的細(xì)胞類型的病毒進(jìn)行體內(nèi)感染。用于基因療法的通常載體包括脂質(zhì)體、質(zhì)粒和病毒載體。示例性病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。體內(nèi)或離體感染后，抗體表達(dá)的水平可以通過(guò)從接受治療的患者獲取樣品并使用本領(lǐng)域已知或本文討論的任何免疫測(cè)定法進(jìn)行監(jiān)控。在基因治療中使用抗-TGF0抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利5,824,655(Border)，其整體引入本文作為參考。[0184]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，基因治療方法包括施用分離的核酸分子并表達(dá)所述核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼抗-TGF0抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分。在另一實(shí)施方案中，基因治療方法包括施用分離的核酸分子和表達(dá)所述核酸分子的步驟，所述核酸分子編碼抗-TGF0抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分。在一個(gè)更優(yōu)選的方法中，基因治療方法包括下列步驟：施用編碼抗_TGFi3抗體的重鏈或其抗原結(jié)合部分的分離的核酸分子和編碼抗_TGFi3抗體的輕鏈或其抗原結(jié)合部分的分離的核酸分子，以及表達(dá)所述核酸分子。[0185]物種與物種之間的劑量校正一般只需要對(duì)于體重進(jìn)行調(diào)整，如果活性劑是在血管系統(tǒng)中或附近起作用的抗體。在急性情況下，本發(fā)明抗體的有效劑量在大鼠和小鼠中為0.5-5mg/kg。因此，對(duì)于長(zhǎng)期按劑量給藥，可能考慮以半衰期（預(yù)期在人中為21天）施用0.3-10mg/kg。優(yōu)選的劑量對(duì)于功效是足夠的，但對(duì)于促進(jìn)最佳施用來(lái)說(shuō)足夠低。例如，少于50mg的劑量有利于皮下施用。靜脈內(nèi)施用在早期臨床試驗(yàn)中是優(yōu)選的，并且可以用作嚴(yán)重疾病的遞送途徑，如果劑量高并且給藥間隔長(zhǎng)。皮下注射一般比靜脈內(nèi)遞送更方便，因?yàn)樗试S自我施用。然而，皮下注射有可能增加針對(duì)產(chǎn)物的任何免疫應(yīng)答。對(duì)于局限性疾病，局部施用可以最小化所需產(chǎn)物的量并最大化作用位點(diǎn)的濃度。通過(guò)局部施用可以賦予顯著的安全性（治療窗口）優(yōu)點(diǎn)，避免可能由長(zhǎng)期全身施用發(fā)展出的任何潛在的副作用。[0186]根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容（包括下列實(shí)驗(yàn)性例證），本發(fā)明的進(jìn)一步的方面和實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。本說(shuō)明書(shū)任何地方提及的所有文件引入作為參考。[0187]實(shí)施例1[0188]抗-TGFβScFvs的產(chǎn)牛[0189]ScFv幼稚（naive)抗.體文庫(kù)[0190]將從20個(gè)供體的脾臟淋巴細(xì)胞獲得并克隆到噬菌粒載體中的大單鏈Fv(SCFv)人抗體文庫(kù)（Hutchings等人，2001)用于選擇。[0191]ScFv指*導(dǎo)的誅.擇文庫(kù)[0192]構(gòu)建1D11.16VH-人VL文庫(kù)并用于選擇具有所需結(jié)合特性的小鼠-人嵌合抗體。然后，將來(lái)自這些嵌合抗體的人輕鏈克隆到人VH-VL和人VH(1D11⑶R3)-VL受者文庫(kù)中。在這些文庫(kù)中篩選具有所需結(jié)合特性的人抗體。[0193]ScFv噬菌體f庫(kù)的詵擇[0194]重組人TGFβ1和TGFβ2由GenzymeCorp.(Framingham,MA)供應(yīng)，并且TGFβ3購(gòu)自R&DSystems。[0195]從scFv指導(dǎo)的選擇文庫(kù)中分離出識(shí)別TGFP的ScFvs,隨后基本上如Vaughan等人（1996)中描述的在重組人TGF0上進(jìn)行一系列反復(fù)選擇循環(huán)。簡(jiǎn)言之，在與文庫(kù)孵育后，已預(yù)偶聯(lián)至順磁性珠且結(jié)合噬菌體的固定化抗原通過(guò)磁性分離進(jìn)行回收，同時(shí)洗掉未結(jié)合的噬菌體。然后，結(jié)合的噬菌體如Vaughan等人（1996)所述進(jìn)行營(yíng)救，并且重復(fù)選擇過(guò)程。[0196]根據(jù)制造商的建議使用與DynabeadsM-270胺（Dynal)偶聯(lián)的TGFi3l、TGFi32或TGF03進(jìn)行選擇。備選地，選擇使用生物素化的TGF01或TGF02,其根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(EZlinkNHSLCBiotin，Pierce)使用伯胺特異性試劑琥拍酰亞胺基-6_(biotinannido)己酸酯來(lái)制備。[0197]來(lái)自選擇過(guò)程的輸出作為周質(zhì)制備物在基于競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法的高通量篩選中進(jìn)行測(cè)試，所述競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法測(cè)量所述周質(zhì)制備物中存在的scFvs與1D11.16或重組人TGF0可溶性受體Π-Fc嵌合體（sRII，R&DSystems)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGFP的能力。[0198]如Vaughan等人（1996)和Osbourn等人（1996)中所述，對(duì)在高通量篩選中與1D11.16或sRII競(jìng)爭(zhēng)的樣品實(shí)施DNA測(cè)序?？寺”槐磉_(dá)并純化為scFvs或IgGs，并且分別如實(shí)施例4和5中所述評(píng)估其在MLEC和/或NHLF測(cè)定法中中和TGFβs的能力。如W001/66754的實(shí)施例3中所述制備純化的scFv制備物。使用BCA法（Pierce)測(cè)定純化的scFv制備物的蛋白質(zhì)濃度。如下文實(shí)施例3中所述，制備純化的IgG制備物。[0199]實(shí)施例2[0200]抗.-TGFβscFvs的優(yōu)化[0201]如實(shí)施例1中所述產(chǎn)生出結(jié)合并中和TGFβ的ScFvs。使用DNA誘變和/或組合技術(shù)來(lái)增加這些抗體對(duì)TGFβ1和/或TGFβ2和/或TGFβ3的中和效力?；旧先鐚?shí)施例1中所述，通過(guò)選擇和篩選噬菌體抗體文庫(kù)產(chǎn)生出對(duì)TGFβ1和/或TGFβ2和/或TGFβ3的效力明顯改善的抗體。產(chǎn)生的scFvs在MLEC增殖測(cè)定法中與1D11.16進(jìn)行比較。[0202]發(fā)現(xiàn)特定種系在高效力的TGFβ中和性scFvs群體中具有高度代表性。這些對(duì)于重鏈來(lái)說(shuō)為DP-10/1-69和DP-88/l-e(兩者都是VH1種系家族的成員），和對(duì)于輕鏈來(lái)說(shuō)為DPK22/A27(VK3家族）。這些種系似乎提供了特別適合于高效力的TGFi3泛中和性抗體的結(jié)構(gòu)框架。這是不可預(yù)測(cè)的，因?yàn)?D11.16VH基因區(qū)段最接近人種系DP-7,并且1D11.16VL基因區(qū)段最接近人種系L16。[0203]在MLEC增殖測(cè)定法中，PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10scFvs顯示的效力接近或超過(guò)1D11.16對(duì)所有3種TGF0同種型的效力。[0204]將PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10VH和VL基因區(qū)段的衍生氨基酸序列與VBASE數(shù)據(jù)庫(kù)（Tomlinson等人，1997)中已知的人種系序列進(jìn)行比對(duì)，并且通過(guò)序列相似性鑒定出了最接近的人種系。對(duì)于PET1073G12和PET1074B9的VH基因區(qū)段來(lái)說(shuō)最接近的人種系基因被鑒定為DP-10/1-69(VH1種系家族），和對(duì)于PET1287A10的VH基因區(qū)段來(lái)說(shuō)最接近的人種系基因被鑒定為DP-88/l-e(VH1種系家族）。對(duì)于PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10的VL基因區(qū)段來(lái)說(shuō)最接近的人種系基因被鑒定為DPK22/A27(VK3種系家族）。使用定點(diǎn)誘變來(lái)將不同于種系的框架殘基改變?yōu)榉N系殘基，條件是此類改變不引起所得到的抗體在MLEC增殖測(cè)定法中對(duì)任何TGFβ同種型的效力喪失超過(guò)3倍。如果觀察到此類效力喪失，那么將非種系框架氨基酸保留在最終抗體中。[0205]在種系化的PET1073G12和種系化的ΡΕΤ1074Β9中，所有框架殘基是種系，除了VH中的兩個(gè)殘基和VL中的一個(gè)殘基外。對(duì)于種系化的PET1073G12的氨基酸序列，關(guān)于VH在SEQIDΝ0:2中描述，和關(guān)于VL在SEQIDΝ0:7中描述。對(duì)于種系化的ΡΕΤ1074Β9的氨基酸序列，關(guān)于VH在SEQIDN0:12中描述，和關(guān)于VL在SEQIDN0:17中描述。[0206]在種系化的PET1287A10中，所有VH和VL框架殘基是種系。對(duì)于種系化的PET1287A10的氨基酸序列，關(guān)于VH在SEQIDN0:22中描述，和關(guān)于VL在SEQIDN0:27中描述。[0207]實(shí)施例3[0208]IgG4s的產(chǎn)牛[0209]通過(guò)將它們的VH和VL結(jié)構(gòu)域分別亞克隆到表達(dá)完整抗體重鏈和輕鏈的載體中，而將種系化的scFvsPET1073G12、PET1074B9和PET1287A10從scFv形式轉(zhuǎn)化為IgG4形式。從pCantab6這一表達(dá)scFv的載體擴(kuò)增出VH基因區(qū)段，并克隆到包含人γ4重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)元件的pEU8.1(+)載體中，以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)完整的重鏈。類似地，從pCantab6這一表達(dá)scFv的載體擴(kuò)增出VL基因區(qū)段，并克隆到包含人κ輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)元件的pEU3.1(-)載體中，以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)完整的輕鏈。pEU3.1(-)和pEU8.1(+)載體基于Persic等人（1987)描述的載體，并進(jìn)行修飾以導(dǎo)入oriP序列以增加產(chǎn)生的抗體的產(chǎn)量（Shen.等人，1995;Langle-Rouault等人，1998)?？寺『螅?種抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)在克隆過(guò)程中沒(méi)有導(dǎo)入突變。[0210]將用于表達(dá)PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10重鏈和輕鏈的載體轉(zhuǎn)染到EBNA-293細(xì)胞（Invitrogen)中。在細(xì)胞上清液中基因表達(dá)和分泌后，PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10IgG4通過(guò)A蛋白親和層析（Amersham)進(jìn)行純化。將純化的抗體制備物無(wú)菌過(guò)濾，并在評(píng)估前于4°C貯存于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)中。使用基于如Mach等人（1992)中描述的IgG氨基酸序列的消光系數(shù)，采用分光光度測(cè)定法來(lái)測(cè)定IgG濃度。使用Bios印-SEC-S2000柱（Phenomenex)通過(guò)SEC-HPLC來(lái)分析純化的IgG以檢查蛋白質(zhì)的聚集或降解。分別如實(shí)施例4和5中所述，將重定格式的人IgG4完整抗體在基于MLEC和NHLF細(xì)胞的測(cè)定法中與1D11.16抗體進(jìn)行比較。[0211]實(shí)施例4[0212]在TGFβ依賴件MLEC增葙測(cè)定法中抗-TGFβ抗體的中和效力[0213]使用貂肺上皮細(xì)胞（MLEC)增殖測(cè)定法來(lái)評(píng)估純化的抗體制備物針對(duì)人TGF0生物活性的中和效力。[0214]MLEC增殖測(cè)定法基于Danielpour等人（1989a)描述的測(cè)定法。該測(cè)定法根據(jù)下述原理工作：當(dāng)將TGFi31、TGF02或TGF03加入貂肺上皮細(xì)胞中時(shí)，這引起血清誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的抑制。測(cè)試抗體中和TGF01、TGF02或TGF03從而致使細(xì)胞增殖恢復(fù)。通過(guò)[3H]-胸苷的攝入來(lái)測(cè)量增殖。抗體的效力定義為以50%(IC5Q)的水平中和單一濃度的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的抗體濃度，單位為nM。[0215]MLEC增葙測(cè)定法規(guī)稈[0216]MLEC鋪板[0217]MLEC系從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（Cat.#CCL_64)獲得。細(xì)胞在包含10%FBS(Gibco)、l%青霉素/鏈霉素（Gibco)和1%MEM非必需氨基酸溶液（Gibco)的極限必需培養(yǎng)基（MEM，Gibco)中生長(zhǎng)。將來(lái)自T-175燒瓶的匯合細(xì)胞從燒瓶上脫離，旋轉(zhuǎn)下來(lái)，洗滌，并重懸浮于MLEC測(cè)定法培養(yǎng)基中，所述MLEC測(cè)定法培養(yǎng)基由包含1%FBS、1%青霉素/鏈霉素和1%MEM非必需氨基酸溶液的MEM制成。然后，將細(xì)胞的等分試樣用臺(tái)盼藍(lán)標(biāo)記，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)，并使用測(cè)定法培養(yǎng)基將細(xì)胞儲(chǔ)液稀釋至1.75X105細(xì)胞/ml。將100μ1這種懸浮液加到組織培養(yǎng)平底96孔板的每個(gè)孔中，并孵育3-5小時(shí)。[0218]TGFβ/抗體溶液的制各[0219]在MLEC測(cè)定法培養(yǎng)基中制備6ng/ml(最終測(cè)定法濃度的6倍）的TGFβ1、TGFβ2或TGFi33的工作溶液，以及為最終最大測(cè)定法濃度的3倍的抗體（包括對(duì)照例如1D11.16)的工作溶液。測(cè)定法中TGFi3的終濃度（lng/ml或40pM)相應(yīng)于與沒(méi)有TGFi3的對(duì)照相比誘導(dǎo)大約80%細(xì)胞增殖抑制的濃度（即EC8(I值）。[0220]稀釋板的律立[0221]將測(cè)試和對(duì)照抗體的樣品在MLEC測(cè)定法培養(yǎng)基中以3倍稀釋梯級(jí)進(jìn)行滴定，并在TGFi31、TGFi32或TGFi33存在或不存在下孵育。在每次實(shí)驗(yàn)中包括所有相關(guān)對(duì)照：測(cè)試1D11.16和/或合適的參照抗體，并進(jìn)行TGF01、TGF02或TGF03滴定。完成的平板在濕潤(rùn)的組織培養(yǎng)孵育箱中放置1小時(shí)±15分鐘。[0222]向鋪板的細(xì)朐中加入TGFβ/抗體溶液[0223]在適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間后，將來(lái)自稀釋板每個(gè)孔的100μ1轉(zhuǎn)移至鋪板的MLEC，并將平板放回孵育箱44±2小時(shí)。[0224]添加Phi-胸苷[0225]向每個(gè)孔中加入25μ1的10yCi/ml[3H]_胸苷（在PBS中稀釋）（0.25yCi/細(xì)胞）。然后將平板放回孵育箱4小時(shí)±30分鐘。[0226]細(xì)朐收獲[0227]向每個(gè)孔中加入100yL胰蛋白酶-EDTA(0.25%，Gibco)，將平板在孵育箱中孵育10分鐘，并且使用Tomtec或Packard96孔細(xì)胞收獲器來(lái)收獲細(xì)胞。[0228]數(shù)據(jù)積累和分析[0229]使用β-平板閱讀器（TopCount，Packard)閱讀來(lái)自收獲的細(xì)胞的數(shù)據(jù)。分析數(shù)據(jù)以獲得IC5Q和標(biāo)準(zhǔn)差值。使用Prism2.0(GraphPad)軟件獲得IC5Q值。[0230]結(jié)果[0231]將純化的PET1073G12、PET1074B9和FET1287A10種系化的IgG4s在MLEC增殖測(cè)定法中與1D11.16-起進(jìn)行測(cè)試。如實(shí)施例3中所述產(chǎn)生IgG4s。IC5(I算術(shù)平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（其中IC5Q是中和50%40pMTGFP1、TGFP2或TGFP3所需的抗體濃度）顯示于表1中。[0232]關(guān)于PET1073G12和PET1287A10IgG4s的IC5(I平均值數(shù)據(jù)顯示，這些抗體具有的效力類似或接近1D11.16對(duì)TGF01、TGF02或TGF03的那些。[0233]IC5Q平均值數(shù)據(jù)暗示，PET1074B9IgG4明顯對(duì)于TGFβ1更有效（盡管在MLEC測(cè)定法中沒(méi)有獲得完全劑量應(yīng)答曲線）。作為用于比較的手段，1D11.16在91ρΜ的濃度上顯示出對(duì)TGFP1的12%中和，并且ΡΕΤ1074Β9在92ρΜ的類似濃度上顯示出78%中和。此夕卜，ΡΕΤ1074Β9還在正常人肺成纖維細(xì)胞（NHLF)纖連蛋白產(chǎn)生測(cè)定法中與1D11.16-起進(jìn)行測(cè)試（實(shí)施例5)。NHLF測(cè)定法中獲得的結(jié)果證實(shí)了在MLEC測(cè)定法中獲得的那些結(jié)果：ΡΕΤ1074Β9具有的效力類似于1D11.16對(duì)TGFP2和TGFP3的效力，并且ΡΕΤ1074Β9比1D11.16對(duì)于TGFP1更具效力。[0234]實(shí)施例5[0235]在TGFβ3依賴件NHLF細(xì)朐測(cè)定法中抗-TGFβ抗體的中和效力[0236]使用正常人肺成纖維細(xì)胞（NHLF)纖連蛋白產(chǎn)生測(cè)定法來(lái)評(píng)估純化的抗體制備物針對(duì)人TGFi3生物活性的中和效力。該測(cè)定法測(cè)量抗體中和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM)糖蛋白(纖連蛋白）的產(chǎn)生的能力。TGFi3s是培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中纖連蛋白產(chǎn)生的有效刺激物(Ignotz和Massaoue，1986)，經(jīng)由激活c-JunN-末端激酶途徑發(fā)揮其效應(yīng)（Hocevar等人，1999)。[0237]NHLF細(xì)朐測(cè)定法規(guī)稈[0238]NHLF細(xì)胞從Clonetics?獲得，并于37°C在包含5%C02的濕潤(rùn)氣氛中維持在完全成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基-2$611-2)中。在90-100%匯合時(shí)，將成纖維細(xì)胞在1.51111?6皿-2培養(yǎng)基中鋪板（1.5X105/孔，24孔形式），并允許于37°C貼壁24小時(shí)。細(xì)胞用無(wú)血清的成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（FBM)洗滌，和在補(bǔ)充有人胰島素（100μg/ml)、慶大霉素/兩性霉素(50μg/ml)和抗壞血酸（50μg/ml)的1.5mlFBM中血清饑餓過(guò)夜，并于37°C孵育24小時(shí)。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)傳代3-6次之間的細(xì)胞進(jìn)行。[0239]TGF3和抗體溶液的制各[0240]在測(cè)定法培養(yǎng)基中制備25ng/ml(ΙηΜ)的TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3的工作溶液，以及抗體（包括對(duì)照例如1D11.16)的工作溶液。測(cè)定法中TGFi3的終濃度（250pg/ml或10pM)相應(yīng)于與沒(méi)有TGFβ的對(duì)照相比誘導(dǎo)大約80%纖連蛋白產(chǎn)生刺激的濃度（即EC8(l值）。[0241]稀釋板的律立[0242]將測(cè)試和對(duì)照抗體的樣品在測(cè)定法培養(yǎng)基中以10倍稀釋梯級(jí)進(jìn)行系列稀釋，并在TGFβ1、TGFβ2或TGFβ332存在或不存在下預(yù)孵育30分鐘。NHLF細(xì)胞在2ml/孔的測(cè)定法培養(yǎng)基中于37°C孵育48小時(shí)。48小時(shí)后，取0.5ml培養(yǎng)基上清液的等分試樣用于通過(guò)ELISA進(jìn)行纖連蛋白分析。[0243]人纖連蛋白ELISA[0244]使用Technoclone?人纖連蛋白抗原ELISA試劑盒來(lái)分析新鮮或冷凍的（_20°C)NHLF上清液樣品，所述試劑盒包括人抗纖連蛋白捕獲單克隆抗體（克隆6FN)和綴合有HRP的單克隆抗纖連蛋白二抗。方法如下：[0245]Nunc-Immuno?Maxisorp?96孔板用在包被緩沖液（在蒸饋水中的12mMNa2C03、35mMNaHC03、0.01%(w/v)硫柳汞，ρΗ9·6)中的抗纖連蛋白捕獲抗體（lyg/孔）于4°C包被16小時(shí)。去除捕獲抗體，并且每個(gè)孔用100μ1稀釋緩沖液（在PBS中的1%(w/v)BSA)于37°C封閉1小時(shí)。用洗滌緩沖液（250μg/孔在PBS中的0·5%(v/V)Tween20)洗滌3次后，將人血漿纖連蛋白標(biāo)準(zhǔn)和樣品加入平板，并于37°C孵育1小時(shí)。然后，將平板洗滌3次，并與抗纖連蛋白HRP二抗（100yg/孔，在稀釋緩沖液中）一起于37°C孵育30分鐘。平板用洗滌緩沖液洗滌3次，并向平板中加入100μg/孔的四甲基聯(lián)苯胺（TMB)底物。平板在室溫下孵育20分鐘后，用100μg/孔的2M硫酸中止反應(yīng)。然后使用DynexMRX平板閱讀器測(cè)定450nm處的吸光度。[0246]數(shù)據(jù)分析[0247]將數(shù)據(jù)提供為在測(cè)試下對(duì)TGFi3同種型的對(duì)照應(yīng)答的百分比（100%)。使用四參數(shù)邏輯曲線擬合（Prism2，GraphPadSoftware，SanDiego,USA)來(lái)評(píng)估pIC50幾何平均值和95%置信界限。當(dāng)四參數(shù)擬合失敗時(shí)，通過(guò)保持曲線頂端和/或底部值恒定來(lái)進(jìn)行三或二參數(shù)擬合。[0248]結(jié)果[0249]將純化的PET1073G12、PET1074B9和PET1287A10種系化的IgG4s在NHLF纖連蛋白產(chǎn)生測(cè)定法中與1D11.16-起進(jìn)行測(cè)試。如實(shí)施例3中所述生產(chǎn)IgG4s。IC5(I算術(shù)平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（其中IC5Q是中和50%10pMTGFP1、TGFP2或TGFP3所需的抗體濃度）顯不于表2中。[0250]實(shí)施例6[0251]在IL-11誘導(dǎo)測(cè)定法中的效力[0252]我們使用A549細(xì)胞（人肺上皮癌細(xì)胞）IL-11誘導(dǎo)測(cè)定法來(lái)評(píng)估純化的抗體制備物針對(duì)人TGFβ生物活性的中和效力。[0253]我們?cè)谏L(zhǎng)/測(cè)定法培養(yǎng)基（435mLDMEM，50mL胎牛血清（FBS)，5mL青霉素/鏈霉素，5mL改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基非必需氨基酸，5mL100XL-谷氨酰胺；全部來(lái)自Gibco/Invitrogen)中維持A549細(xì)胞（ATCC，Part#:CCL-185)。在大約90%匯合時(shí)，我們將細(xì)胞在100μL生長(zhǎng)/測(cè)定法培養(yǎng)基中鋪板，并讓細(xì)胞在37°C、5%C02下貼壁24小時(shí)。[0254]TGF3和抗體溶液的制各[0255]我們?cè)谏L(zhǎng)/測(cè)定法培養(yǎng)基中制備TGFPl(1.8ng/ml)、TGFe2(4.2ng/ml)或TGFi33(4.2ng/ml)和抗體（包括對(duì)照）的工作溶液。[0256]稀釋板的律立[0257]我們?cè)谏L(zhǎng)/測(cè)定法培養(yǎng)基中以5倍（TGFβ2或TGFβ3)或10倍（TGFβ1)的稀釋梯級(jí)對(duì)測(cè)試和對(duì)照抗體樣品進(jìn)行系列稀釋，并在TGFi31、TGFi32或TGFi33存在或不存在下于37°C預(yù)孵育75分鐘。我們?cè)?00μ1/孔的測(cè)定法培養(yǎng)基中于37°C孵育A549細(xì)胞18-24小時(shí)。18-24小時(shí)后，取100μ1培養(yǎng)基上清液的等分試樣用于通過(guò)ELISA進(jìn)行IL-11分析。[0258]實(shí)施例7[0259]為了測(cè)定人泛中和性（pan-neutralizing)TGF-β單克隆抗體用于治療特征為致病性纖維化的慢性腎病及其他臨床適應(yīng)癥的生物學(xué)功效，我們?cè)诖笫髥蝹?cè)尿道阻塞（UU0)模型中研究所述抗體的效應(yīng)。[0260]重250-280克（約6周）的成年SpragueDawley大鼠（TaconicFarms,Germantown，NY)在控制空氣、溫度和光照的環(huán)境中飼養(yǎng)。經(jīng)歷UU0的大鼠接受小腹中線剖腹術(shù)以暴露左腎和上輸尿管。我們用絲縫線在腎較低一端的位置處結(jié)扎輸尿管，并且在第一個(gè)之下約0.2cm處進(jìn)行第二次結(jié)扎。經(jīng)假手術(shù)的大鼠接受相同的手術(shù)方案，但不進(jìn)行輸尿管結(jié)扎。[0261]經(jīng)阻塞的大鼠用PBS、鼠類泛中和性單克隆抗體（1D11)、同種型匹配的對(duì)照抗體(13C4)或本發(fā)明的人泛中和性TGF-β單克隆抗體如下進(jìn)行處理。我們從輸尿管結(jié)扎當(dāng)天開(kāi)始給大鼠腹膜內(nèi)施用所述抗體，療程為3周。13C4和1D11以5mg/kg施用（3次/周），并且將人泛中和性抗體以5mg/kg給予大鼠（每5天）。在3周結(jié)束時(shí)，我們處死大鼠，用PBS灌注腎3分鐘，并收獲經(jīng)灌注的腎用于分析mRNA、測(cè)定膠原含量和組織學(xué)檢查。[0262]為了評(píng)估組織纖維化的程度，我們根據(jù)Kivirikko等人所述通過(guò)在水解提取物中羥脯氨酸的生物化學(xué)分析來(lái)測(cè)定組織膠原的總含量。該測(cè)定法基于動(dòng)物組織中基本上所有的羥脯氨酸均在膠原中發(fā)現(xiàn)這一觀察。[0263]對(duì)于總膠原含量我們還進(jìn)行了Sircol膠原測(cè)定法。Sircol膠原測(cè)定法基于Siriusred染料與組織膠原側(cè)鏈的特異性結(jié)合來(lái)測(cè)量全部的酸/胃蛋白酶可溶性膠原的量。[0264]當(dāng)與經(jīng)PBS處理的組（3.5±0.3μg/mg干組織，p〈0.05)比較時(shí)，用人泛中和性單克隆抗體處理的UU0大鼠顯示出羥脯氨酸含量減少43.4%(1.98±0.26μg/mg干組織）。如通過(guò)基于Siriusred染料的測(cè)定法所測(cè)定的，在受影響的腎中總?cè)芙饽z原的減少進(jìn)一步支持了腎纖維化的減輕（假的：18.5±2.6,PBS:69.3±3.8,和人泛中和性單克隆抗體：35.6±5·2μg/100mg組織，ρ〈0·05對(duì)PBS)。[0265]我們還通過(guò)免疫組織化學(xué)檢查評(píng)估了人泛中和性抗TGF-β單克隆抗體減少組織纖維化的能力。[0266]在對(duì)照動(dòng)物中，尿道阻塞3周導(dǎo)致腎臟管狀結(jié)構(gòu)的廣泛破壞，伴隨著顯著的膨脹、細(xì)胞萎縮和壞死/凋亡、組織炎癥和腎小管間質(zhì)擴(kuò)張（伴隨明顯纖維化）。關(guān)于腎小球損害的證據(jù)很少。另一方面，如通過(guò)減弱的腎小管擴(kuò)大和解體、減少的炎性浸潤(rùn)物（細(xì)胞構(gòu)成）和減少的腎小管間質(zhì)擴(kuò)張和纖維化所判斷的，用1D11或人泛中和性單克隆抗體處理的大鼠顯示出腎結(jié)構(gòu)的保存。[0267]我們還測(cè)量了用人泛中和性抗TGF-β單克隆抗體進(jìn)行處理對(duì)于受TGF-β調(diào)節(jié)的基因表達(dá)的影響。[0268]與經(jīng)PBS處理或經(jīng)13C4對(duì)照抗體處理的動(dòng)物相比，在經(jīng)人泛中和性單克隆抗體處理的UU0動(dòng)物中TGF-βImRNA顯著減少。與用PBS或13C4處理的那些相比，在用人和鼠類抗TGF-β抗體處理的阻塞的腎中還可見(jiàn)III型膠原的mRNA水平顯著減少，這表明膠原合成減少。[0269]我們通過(guò)測(cè)量總腎TGF-β1蛋白進(jìn)一步證實(shí)了人泛中和性抗TGF-β單克隆抗體減少自誘導(dǎo)的TGF-β合成的功效。[0270]與進(jìn)行假手術(shù)的動(dòng)物相比，阻塞的腎顯示出總組織TGF-β1明顯增加。然而用人泛中和性單克隆抗體進(jìn)行給藥的阻塞的大鼠顯示出組織TGF-β1水平減少75%，明顯低于關(guān)于兩個(gè)對(duì)照組所記錄的水平。通過(guò)比較，與對(duì)照組相比，鼠類1D11抗體使組織TGF-β1水平減少45%。[0271]上述結(jié)果證實(shí)，用人泛中和性抗TGF-β單克隆抗體中和TGF-β有效地中斷了TGF-β自分泌-調(diào)節(jié)環(huán)，并伴隨著防止TGF-β1產(chǎn)生和膠原IIImRNA表達(dá)。[0272]我們進(jìn)一步測(cè)定了人泛中和性抗TGF-β單克隆抗體對(duì)于作為T(mén)GF-β抑制的間接指示物的平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SM)表達(dá)的影響。平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)是激活的肌成纖維細(xì)胞的指示物，所述激活的肌成纖維細(xì)胞與組織纖維化相關(guān)并產(chǎn)生纖維結(jié)締組織。TGF-β是基質(zhì)成纖維細(xì)胞和定居上皮細(xì)胞的活化以及至肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變的重要誘導(dǎo)劑。[0273]我們通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)了a-SMA蛋白。[0274]如通過(guò)組織勻漿物的蛋白質(zhì)印跡法所測(cè)量的，當(dāng)與進(jìn)行假手術(shù)的動(dòng)物相比較時(shí)，具有阻塞的腎的大鼠顯示出a-SMA蛋白顯著上調(diào)（數(shù)據(jù)未顯示）。用人泛中和性抗TGF-β單克隆抗體進(jìn)行給藥的阻塞的大鼠顯示出在可測(cè)量的α-SM表達(dá)方面的顯著減少（75%，與PBS對(duì)照相比）。[0275]這些結(jié)果證實(shí)，人泛中和性抗TGF-β單克隆抗體在纖維化腎中減少膠原沉積的功效，這清楚地表明，在這種嚴(yán)重腎損傷和腎小管間質(zhì)性纖維化模型中所述抗體是腎膠原產(chǎn)生和沉積的有效抑制劑。因?yàn)槠鞴倮绶?、肝或腎中的組織纖維化過(guò)程具有共同的機(jī)制或途徑，所以技術(shù)人員將理解，所述抗體可用于治療特征為致病性纖維化的慢性腎病以及其他臨床適應(yīng)癥。[0276]本發(fā)明的某些優(yōu)選權(quán)利要求的描述如下。[0277]SEQIDN01[0278]編碼PET1073G12VH的核苷酸序列[0279]CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCATCCCTATTGTTGATATTGCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACTAGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCACACTTGGTCTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCCTCA[0280]SEQIDN02[0281]PET1073G12VH的氨基酸序列[0282]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSS[0283]SEQIDN03[0284]PET1073G12HCDR1的氨基酸序列[0285]SNVIS[0286]SEQIDN04[0287]PET1073G12HCDR2的氨基酸序列[0288]GVIPIVDIANYAQRFKG[0289]SEQIDN05[0290]PET1073G12HCDR3的氨基酸序列[0291]TLGLVLDAMDY[0292]SEQIDN06[0293]編碼PET1073G12VL的核苷酸序列[0294]GAAACGGTACTCACGCAGTCTCCAGGTACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATCAGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA[0295]SEQIDN07[0296]PET1073G12VL的氨基酸序列[0297]ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK[0298]SEQIDN08[0299]PET1073G12LCDR1的氨基酸序列[0300]RASQSLGSSYLA[0301]SEQIDN09[0302]PET1073G12LCDR2的氨基酸序列[0303]GASSRAP[0304]SEQIDN010[0305]PET1073G12LCDR3的氨基酸序列[0306]QQYADSPIT[0307]SEQIDN011[0308]編碼PET1074B9VH的核苷酸序列[0309]CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCATCCCTATTGTTGATATTGCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACTAGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCTGCCACGCGCTTTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGTTGGTGACCGTCTCCTCA[0310]SEQIDN012[0311]PET1074B9VH的氨基酸序列[0312]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCALPRAFVLDAMDYWGQGTLVTVSS[0313]SEQIDN013[0314]PET1074B9HCDR1的氨基酸序列[0315]SNVIS[0316]SEQIDN014[0317]PET1074B9HCDR2的氨基酸序列[0318]GVIPIVDIANYAQRFKG[0319]SEQIDN015[0320]PET1074B9HCDR3的氨基酸序列[0321]PRAFVLDAMDY[0322]SEQIDN016[0323]編碼PET1074B9VL的核苷酸序列[0324]GAAACGGTACTCACGCAGTCTCCAGGTACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATCAGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA[0325]SEQIDN017[0326]PET1074B9VL的氨基酸序列[0327]ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK[0328]SEQIDN018[0329]PET1074B9LCDR1的氨基酸序列[0330]RASQSLGSSYLA[0331]SEQIDN019[0332]PET1074B9LCDR2的氨基酸序列[0333]GASSRAP[0334]SEQIDN020[0335]PET1074B9LCDR3的氨基酸序列[0336]QQYADSPIT[0337]SEQIDN021[0338]編碼PET1287A10VH的核苷酸序列[0339]CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAAGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCACCTCTTTCATCAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGATATAACAAACTACGCACAGAAATTTCAGAGCAGAGTCACTATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGCGCACGCGGAAATGGTAACTACGCCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACGTTGGTCACCGTCTCCTCA[0340]SEQIDN022[0341]PET1287A10VH的氨基酸序列[0342]QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTSFINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDITNYAQKFQSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNGNYALDAMDYWGQGTLVTVSS[0343]SEQIDN023[0344]PET1287A10HCDR1的氨基酸序列[0345]TSFIN[0346]SEQIDN024[0347]PET1287A10HCDR2的氨基酸序列[0348]GIIPIFDITNYAQKFQS[0349]SEQIDN025[0350]PET1287A10HCDR3的氨基酸序列[0351]GNGNYALDAMDY[0352]SEQIDN026[0353]編碼PET1287A10VL的核苷酸序列[0354]GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTTGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCTGACAGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCCGCCTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATGATAGTCCCATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA[0355]SEQIDN027[0356]PET1287A10VL的氨基酸序列[0357]EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYFAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYDSPITFGQGTRLEIK[0358]SEQIDN028[0359]PET1287A10LCDR1的氨基酸序列[0360]RASQSVSSSYFA[0361]SEQIDN029[0362]PET1287A10LCDR2的氨基酸序列[0363]GASSRAT[0364]SEQIDN030[0365]PET1287A10LCDR3的氨基酸序列[0366]QQYYDSPIT[0367]SEQIDN031[0368]WGQGTLVTVSS[0369]注：CDRs根據(jù)Kabat等人（1991)進(jìn)行定義[0370]表1[0371]【權(quán)利要求】1.結(jié)合人TGFβl、TGFβ2和TGFβ3的分離的抗體，其包括包含SEQIDN0:2中所示的PET1073G12VH結(jié)構(gòu)域和人IgG4恒定區(qū)的重鏈，和包含SEQIDN0:7中所示的PET1073G12VL結(jié)構(gòu)域和人κ輕鏈恒定區(qū)的輕鏈。2.組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1的抗體。3.分離的核酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1的抗體的核苷酸序列。4.宿主細(xì)胞，其用根據(jù)權(quán)利要求3的核酸轉(zhuǎn)化。5.生產(chǎn)抗體的方法，其包括在用于生產(chǎn)所述抗體的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，并分離和/或純化所述抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其進(jìn)一步包括將所述抗體配制到包含至少一種另外的活性組分的組合物中。7.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療特征為致病性纖維化的慢性腎病?！疚臋n編號(hào)】C12N15/13GK104151427SQ201410332384【公開(kāi)日】2014年11月19日申請(qǐng)日期:2006年2月8日優(yōu)先權(quán)日:2005年2月8日【發(fā)明者】史蒂文·R·萊德貝特,西莉亞·P·哈特,羅伯特·G·霍爾蓋特,盧茨·U·杰爾穆圖斯,卡特里昂納·L·布坎南,亞歷山大·R·鄧肯,唐訥·K·芬奇申請(qǐng)人:根茨美公司,奧普泰恩公司