用于檢測小麥條銹菌的特異性scar標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測小麥條銹菌的特異性SCAR標(biāo)記，屬于生物技術(shù)和植物檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供的特異性SCAR標(biāo)記，其核苷酸序列的長度為180bp。所述SCAR標(biāo)記對小麥條銹菌的檢測具有高度的?；?，在檢測來自我國不同麥區(qū)的小麥條銹菌標(biāo)樣中，該標(biāo)記均穩(wěn)定顯現(xiàn)，而在小麥葉銹、稈銹及其它麥類病原真菌上均沒有“污染性”擴(kuò)增。因此，所述SCAR標(biāo)記可用于小麥條銹菌病害的診斷、檢測和測報(bào)調(diào)查。
【專利說明】用于檢測小麥條銹菌的特異性SCAR標(biāo)記

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測小麥條銹菌的特異性SCAR標(biāo)記，屬于生物技術(shù)和植物 檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥鎊病包括條鎊?。≒uccinia striiformis West. f. sp. tritici Eriks.)、 葉鎊?。≒uccinia recondita Rob. ex Desm. f. sp. tritici Erikss. Et Henn.)和桿鎊病 (Puccicinia graminis Pers. f. sp. tritici Erikss. Et Henn.)三種，是一類由鎊菌引致的 真菌性病害。該類病害是中國乃至全世界所有產(chǎn)麥國家的一類重要病害，世界上不同國家 或地區(qū)三種銹病發(fā)生的種類、分布與危害程度等各不相同。
[0003] 由小麥條銹菌Puccinia striiformis f. sp. tritici引起的小麥條銹病是世界性 的禾谷類病害，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其每年在全世界范圍內(nèi)就可造成約40%的損失（Ullerup，1991)。 我國是世界上最大的小麥條銹病流行區(qū)（萬安民，2000)，發(fā)生范圍涉及16個(gè)省市，病 害流行時(shí)，面積超過400X 104-500X 104hm2，造成10%-70%的產(chǎn)量損失，年均產(chǎn)量損失 100 X 107kg，嚴(yán)重情況甚至絕收（李振岐和曾士邁，2002 ;Chen，2005 ;Chen et al.，2009)。 建國以來，條銹病曾于1950、1964、1990和2002年大流行，分別引起產(chǎn)量損失達(dá)60 X ΙΟ8、 30 X 108、26 X 108 和 10 X 108kg (Chen et al.，2009)。近年來由于新的毒性小種 CY32 和 CY33 的發(fā)展，致使我國80%的小麥生產(chǎn)品種喪失抗性。21世紀(jì)以來，條銹病在2001年到2009 年在我國西南、西北片區(qū)連年流行，發(fā)生頻率越來越高，已成為制約我國小麥可持續(xù)發(fā)展的 影響因素。
[0004] 小麥條銹病的危害一直嚴(yán)重地影響著小麥生產(chǎn)，該類病害使谷物大量減產(chǎn)，品質(zhì) 降低，被條銹菌侵染的種子活力低，萌發(fā)率低，成活率減少。病原菌以無性孢子的形式隨高 空氣流傳播，廣泛分布于我國及世界上其它的小麥種植區(qū)，是危害最重的病害。若條銹菌在 小麥早期侵染，發(fā)生在生長季節(jié)，可造成小麥100%的損失。小麥條銹病曾于1950,1964， 1990和2002年四次大流行，給我國小麥生產(chǎn)造成沉重?fù)p失。當(dāng)前，小麥條銹病仍是威脅我 國西南、華北和淮北等冬麥區(qū)和西北春麥區(qū)的最重要病害之一，由于其流行頻率高、暴發(fā)性 強(qiáng)、發(fā)生范圍廣等特點(diǎn)，容易造成全國大面積流行。同時(shí)，近年來新小種和新致病類型的不 斷出現(xiàn)和發(fā)展使此病害流行的可能性更高，潛在威脅更大，涉及范圍更廣，嚴(yán)重威脅小麥高 產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2004年小麥條銹病發(fā)病面積近4000萬畝，2005年發(fā)病面積高達(dá)1億畝 次以上，2006年小麥條銹病有所緩和，但發(fā)病面積仍高達(dá)7000萬畝，2007年，發(fā)病早，流行 速度快，前期危害嚴(yán)重，因及時(shí)防治，后期干旱，同比下降23. 5%，發(fā)病面積累計(jì)約為5400 萬畝，雖有所緩和，仍為當(dāng)前病蟲害防治的重點(diǎn)。
[0005] 長期以來，小麥銹病的預(yù)測預(yù)報(bào)主要基于定期、大規(guī)模的田間病情調(diào)查和室內(nèi)病 菌小種的活體分離、培養(yǎng)和鑒定。不僅耗時(shí)費(fèi)工，而且其結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度也在很大程 度上取決于調(diào)查測報(bào)人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)，難以滿足快速、高通量診斷檢測的實(shí)際需求。 葉銹病和條銹病的苗期癥狀區(qū)別不甚明顯，一些基層植物保護(hù)人員常常將二者混淆，不能 準(zhǔn)確區(qū)分。在小麥葉銹菌的潛育階段，寄主的發(fā)病癥狀不易觀察，難以界定初侵染的時(shí)期和 規(guī)模。因此，有必要利用現(xiàn)代生物技術(shù)，研發(fā)簡單易行、靈敏準(zhǔn)確的小麥葉銹菌快速診斷和 檢測手段。
[0006] 近年來，隨著基因芯片和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的發(fā)展，基于特定基因序列開發(fā)的特異 PCR引物或探針，已被越來越多地用在病原菌的生物學(xué)、群體結(jié)構(gòu)、流行動態(tài)、基因漂移等 研究中。對病害診斷、病原菌鑒定而言，靶標(biāo)序列的獲得通常源自保守基因的序列比較或 染色體組的隨機(jī)探查。DNA/RNA探針技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)具有強(qiáng)?；?、高靈敏 度以及程序化試驗(yàn)操作等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于絲核菌Rhizoctonia solani、R. oryzae、 R. oryzaesativae、炭痕菌 Colletotrichum acutatum、多黏菌 Polymyxa betae、黑粉菌 Tilletia indic、T. walkeri、Ustilago hordei、鎌刀菌 Fusarium oxysporum、F. culmorum、 F. graminearum、F. avenaceum、葉枯菌 Stagonospora nodorum、Septoria tritici 等多種植 物病原真菌的鑒定檢測。鑒于癥狀診斷的局限性以及形態(tài)學(xué)鑒定的復(fù)雜性，已有學(xué)者成功 研發(fā)出基于PCR技術(shù)的三種銹病的診斷檢測技術(shù)。在小麥條銹菌的研究方面，中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院植物保護(hù)研究所采用PCR方法，建立了以β -微管蛋白序列為基礎(chǔ)的小麥條銹菌和葉 銹菌特異性分子診斷檢測技術(shù)（曹麗華等，2007 ;Cao et al.，2008)。此外，美國明尼蘇達(dá) 大學(xué)的學(xué)者采用RT-PCR的方法，建立了以ITS1序列為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)的小麥三種銹菌的檢測技 術(shù)（Barnes and Szabo, 2007);西北農(nóng)林科技大學(xué)亦采用PCR方法，建立了直接從受感染的 小麥葉片中區(qū)別條銹菌的檢測技術(shù)（Wang et al.，2008)。該類技術(shù)體系均是建立在核酸技 術(shù)基礎(chǔ)上，依靠病原菌基因組中的特異性DNA序列進(jìn)行檢測，包括樣品提取、PCR擴(kuò)增以及 擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，用于病害診斷檢測的準(zhǔn)確性和可靠性均較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明基于上述領(lǐng)域的需求，提供一種檢測小麥條銹菌的SCAR標(biāo)記、引物及方 法，技術(shù)方案如下：
[0008] 小麥條銹菌（Puccinia striiformis)的SCAR標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
[0009] 用于小麥條銹菌（Puccinia striiformis)檢測的SCAR標(biāo)記引物，其核苷酸序列 為：
[0010] TF144G :5, -CCTGCGATGGTGTAGACTCA-3,，
[0011] TF323G : 5 ' -CGGCGTGTATGTTCGTGTTG-3 '，
[0012] 其特征條帶的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] 一種檢測小麥感染條銹菌（Puccinia striiformis)的方法，包括如下步驟：
[0014] (1)以待測小麥為材料，提取樣品DNA ;
[0015] (2)以樣品DNA為模板，采用上述SCAR標(biāo)記引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0016] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)SEQ ID NO: 1所示的180bp 特征條帶，則所述樣品DNA中含有小麥條銹菌；若擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQ ID NO: 1所示的 180bp條帶，則樣品DNA中不含有小麥條銹菌。
[0017] 所述PCR 反應(yīng)的體系為：20ng/y L模板DNA1 μ L，10μ Μ 引物 TF144G1 μ L，10μ Μ 引 物 TF323G1μ L，2 X EasyTaq PCR SuperMixl2. 5 μ L，ddH209. 5 μ L。
[0018] 所述PCR反應(yīng)的條件為：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、54. 5°C退火30s、72°C延 伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min。
[0019] 用于檢測小麥條銹菌的試劑盒，其特征在于：包括液態(tài)的或粉狀的用于小麥條銹 菌（Puccinia striiformis)檢測的SCAR標(biāo)記引物，其核苷酸序列為：
[0020] TF144G : 5，-CCTGCGATGGTGTAGACTCA-3，，
[0021] TF323G : 5 ' -CGGCGTGTATGTTCGTGTTG-3 '。
[0022] 本研究根據(jù)真菌的保守基因合成的引物Bt2a/Bt2b，其核苷酸序列為：
[0023] 5, -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3, /5, -ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3，，以小麥 條銹菌、小麥葉銹菌、小麥桿銹菌等病原菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR比較擴(kuò)增。擴(kuò)增及 測序結(jié)果顯示，該引物在小麥條銹菌的DNA中擴(kuò)增出361bp長度的片段，在小麥葉銹菌、小 麥桿銹菌的DNA中擴(kuò)增出的條帶都是495bp片段。為了獲得能夠特異地將條銹菌從葉銹、 桿銹菌及其它類似麥類病原真菌中鑒別出來，需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異引物。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)計(jì)出了?；詸z測引物TF144G/TF323G，對條銹菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得了小麥條銹菌的特異性SCAR(sequence characterized amplified region)標(biāo)記，其核 苷酸序列的長度為180bp。所述SCAR標(biāo)記對小麥條銹菌的檢測具有高度的?；?，在檢測 來自我國不同麥區(qū)的小麥條銹菌標(biāo)樣中，該標(biāo)記均穩(wěn)定顯現(xiàn)，而在小麥葉銹、桿銹及其它麥 類病原真菌上均沒有"污染性"擴(kuò)增。因此，所述SCAR標(biāo)記可用于小麥條銹菌病害的診斷、 檢測和測報(bào)調(diào)查。
[0025] 本發(fā)明還提供一種特異性檢測小麥條銹菌的方法，采用?；颰F144G/TF323G， 以待測樣品的基因組DNA為模板，按照優(yōu)選的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，瓊脂 糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，若擴(kuò)增產(chǎn)物中含有180bp特征條帶，則待測樣品中含有 小麥條銹菌，反之亦然。所述方法在小麥條銹菌的檢測中具有較高的特異性、靈敏度和可靠 性，其靈敏度可達(dá)lfg/ μ L模板DNA濃度水平。
[0026] 本發(fā)明還提供用于檢測小麥條銹菌的試劑盒，用于小麥條銹菌的分子診斷，供我 國縣級以上植保植檢部門推廣應(yīng)用。小麥條銹菌成功侵染寄主小麥后，一般需要9?14天 甚至更長時(shí)間才能產(chǎn)生新的傳播體（病菌夏孢子）。室內(nèi)接種試驗(yàn)表明，小麥條銹菌侵入寄 主后9h，即可利用該SCAR標(biāo)記檢測到小麥條銹菌的特異性DNA片段。因此，在小麥生產(chǎn)實(shí) 踐中，可以在病害潛育階段進(jìn)行PCR檢測，根據(jù)條銹菌特異性SCAR標(biāo)記的出現(xiàn)概率進(jìn)行病 害早期預(yù)警，以提早開展病害流行測報(bào)和及時(shí)指導(dǎo)病害防治。這對于降低小麥條銹病的防 治成本、阻斷病害的擴(kuò)散蔓延、確保我國小麥安全生產(chǎn)具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1.小麥條銹菌、葉銹菌和桿銹菌的gDNA的PCR比較擴(kuò)增結(jié)果，
[0028] 其中，點(diǎn)樣孔中的樣品從左至右依次為2個(gè)條銹、2個(gè)葉銹、2個(gè)桿銹;Marker條帶 大小從下往上依次為 l〇〇bp，250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp。
[0029] 圖2.小麥桿銹菌與葉銹菌的特異性DNA片段比對結(jié)果，
[0030] 其中，6-1片段為小麥桿銹菌的特異性DNA片段，3-1片段為小麥葉銹菌的特異性 DNA片段，其同源性為100%。
[0031] 圖3.小麥條銹菌與葉銹菌的特異性DNA片段比對結(jié)果，
[0032] 其中，1-5片段為小麥條銹菌的特異性DNA片段，3-1片段為小麥葉銹菌的特異性 DNA片段，其同源性為31. 23%。
[0033] 圖4.小麥條銹菌SCAR標(biāo)記的特異性驗(yàn)證，
[0034] 其中，點(diǎn)樣孔中的樣品從左至右依次為5個(gè)小麥條銹菌CY17, CY18, CY19, CY32， CY33 ;3個(gè)小麥葉銹菌PHT，THT，PHP ;3個(gè)小麥桿銹菌34C1，MFM，MFC ;2個(gè)小麥白粉菌；2個(gè) 小麥赤霉菌PH-1，PH-2 ;1個(gè)光腥黑粉菌TFL ;1個(gè)網(wǎng)腥黑粉菌TCT ;滅菌水（對照）；Maker 條帶大小從下往上依次為100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，750bp，1000bp。圖5.小麥條 銹菌SCAR標(biāo)記的靈敏度檢測結(jié)果，
[0035] 其中，點(diǎn)樣孔中小麥條銹菌模板DNA的濃度從左至右依次為lOng/μ LUng/μ L、 100pg/ μ L、10pg/ μ L、lpg/ μ L、100fg/ μ L、10fg/ μ L、lfg/ μ L、ddH20 ;Maker 條帶大小從下 往上依次為 l〇〇bp，200bp，300bp，400bp，500bp，750bp，1000bp。
[0036] 圖6.感病小麥葉片內(nèi)條銹菌的檢測結(jié)果，
[0037] 其中，點(diǎn)樣孔中的樣品從左至右依次為健康葉片gDNA，接種小麥條鎊囷后9h、 12h、20h、24h、48h、72h、96h、120h 的小麥葉片 gDNA ;Maker 條帶從下往上依次為 100bp， 200bp，300bp，400bp，500bp，750bp，1000bp。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下參考具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅作為解釋 和說明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0039] 生物材料：
[0040] 小麥品種：
[0041] 銘賢169、鄭麥5389,已知品種，均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。
[0042] 小麥病原真菌菌種及來源：
[0043] 小麥條銹菌菌種：CY33, CY32, CY17, CY18, CY19,均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保 護(hù)研究所；
[0044] 小麥葉銹菌菌種：PHT，THT，THD，PHK，PHP，PHJ，均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù) 研究所；
[0045] 小麥桿銹菌菌種：34C1，MFM，MFC，21C3, 34C2均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù) 研究所；
[0046] 小麥白粉菌菌種：1，10,均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所；
[0047] 小麥赤霉菌菌種：PH-1，PH-2,均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所；
[0048] 光腥黑粉菌菌種：TFL，來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所；
[0049] 網(wǎng)腥黑粉菌菌種：TCT，來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。
[0050] 上述生物材料本實(shí)驗(yàn)室亦有保存，可自申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí) 驗(yàn)。
[0051] 供試小麥病原真菌的繁殖與保藏：
[0052] 供試小麥條銹菌真菌在銘賢169 (已知小麥品種）上進(jìn)行；
[0053] 小麥葉銹菌、小麥桿銹菌的夏孢子以及小麥白粉菌的菌絲、分生孢子均在鄭麥 5389上繁殖；
[0054] 其它小麥病原真菌在鋪墊有賽璐玢膜的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
[0055] 備用菌種在4°C冰箱內(nèi)暫存，或真空封存后于液氮內(nèi)長期保存。
[0056] 試劑耗材：深圳依諾金生物有限公司Catcher Sp in GEK2050凝膠回收試劑盒。
[0057] 儀器設(shè)備：M J Research, Inc.的 PTC2220 型 PCR 儀、ULTRA-URLET PRODUCTS 凝膠 成像系統(tǒng)。
[0058] 本發(fā)明未特別說明的實(shí)驗(yàn)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，或采用本領(lǐng)域常規(guī)方法配制 而得，可商購獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級即可。
[0059] 實(shí)施例1.小麥病原真菌基因組DNA(gDNA)的提取 [0060] 采用Villar0a丨等的方法。
[0061] 小麥3種銹菌和白粉菌gDNA分別提取自潛育期的感病小麥葉片和病原菌夏孢子 或分生孢子，其它小麥病原真菌的gDNA則來源于營養(yǎng)體菌絲。感病小麥葉片或營養(yǎng)體菌絲 直接用液氮冷凍研磨至粉狀，銹菌、白粉菌孢子則采用玻璃珠震蕩法破壁，其余DNA提取操 作按照常規(guī)方法進(jìn)行。以適量RNase消化RNA后，采用紫外分光光度法測定gDNA的質(zhì)量與 濃度。
[0062] 實(shí)施例2. PCR比較分析及小麥條銹菌特異性核酸序列的克隆、測序
[0063] 參照"Glass and Donaldson, 1995. "在真菌的保守基因的報(bào)道，合成引 物 Bt2a/Bt2b，其核苷酸序列為：Bt2a :5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'，Bt2b : 5' -ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。
[0064] PCR 分析均在 M J Research, Inc.的 PTC2220 型 PCR 儀上進(jìn)行。
[0065] 小麥條銹菌、葉銹菌和桿銹菌gDNA的PCR比較擴(kuò)增體系為25yL，其中包 括 10XPCR Buffer(Mg2+Plus)2yL，dNTP Mixture (各 2.5mmol/L)0.3yL，Bt2a/ Bt2b(10ymol/L)ly L,模板 DNA (20ng/μ L) 1. 0 μ L，TaKaRa Taq (5U/μ L) 0· 3 μ L， ddH2016. 9μ L。
[0066] ?0?反應(yīng)條件為：941：21^11，1個(gè)循環(huán)；941：158,551：3〇8,721：9〇8,30個(gè)循環(huán) ； 72°C lOmin，1 個(gè)循環(huán)。
[0067] 擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5的瓊脂糖凝膠、0. 5XTBE電泳緩沖液電泳分離，以 ULTRA-URLET PRODUCTS凝膠成像系統(tǒng)記錄分析電泳譜型。在紫外燈下快速切取小麥條銹菌 的特異性PCR條帶，以深圳依諾金生物有限公司Catcher Sp in GEK2050凝膠回收試劑盒回 收純化，交上海生工技術(shù)公司雙向測序。測序結(jié)果以NCBI的BasicLocalAlignment Search Tool進(jìn)行序列拼接，得到特異性PCR片段的序列全長，繼而以BLASTN程序與Gen2Bank、 EMBL、DDBJ、PDB中的序列進(jìn)行同源性比對。
[0068] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：用引物Bt2a和Bt2b組合對小麥條銹菌、葉銹菌和桿銹菌的gDNA進(jìn)行 PCR比較擴(kuò)增。結(jié)果表明，小麥條銹菌具有長度為361bp的特異性DNA片段，而小麥葉銹菌 和小麥桿銹菌具有長度為495bp的特異性DNA片段（圖1)。研究發(fā)現(xiàn)，小麥葉銹菌和小麥 桿銹菌的特異性DNA片段同源性為100% (圖2)，而小麥條銹菌與其同源性為31. 23% (圖 3)。
[0069] 實(shí)施例3.小麥條銹菌SCAR標(biāo)記的獲得及其特異性驗(yàn)證
[0070] 根據(jù)PCR比較擴(kuò)增獲得的小麥條銹菌特異性DNA片段序列，設(shè)計(jì)并篩選獲得特異 性引物TF144G/TF323G，其核苷酸序列為：
[0071] TF144G : 5，-CCTGCGATGGTGTAGACTCA-3，，
[0072] TF323G : 5 ' -CGGCGTGTATGTTCGTGTTG-3 '，
[0073] 交北京賽百盛基因技術(shù)有限公司進(jìn)行化學(xué)合成。通過進(jìn)一步優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系 及循環(huán)條件，獲得了長度為180bp的小麥條銹菌特異性SCAR標(biāo)記。
[0074] PCR 反應(yīng)體系為：20ng/ μ L 模板 DNA1 μ L，10 μ Μ 引物 TF144G1 μ L，10 μ Μ 引物 TF323G1μ L,2 X EasyTaq PCR SuperMixl2. 5 μ L, ddH209. 5 μ L〇
[0075] PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、54. 5°C退火30s、72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 8min。
[0076] 以小麥主要病原真菌即小麥條鎊菌Puccinia striiformis、葉鎊菌Puccinia triticinia、桿鎊菌Puccinia graminis、赤霉菌Fusarium gram inearum、白粉菌Erysiphe graminis、光渥黑粉菌 Tilletia foetida (Wallr.) Liro、網(wǎng)渥黑粉菌 Tilletia caries 為 對照，檢測小麥條銹菌標(biāo)樣。結(jié)果表明，該SCAR標(biāo)記對小麥條銹菌的檢測具有高度的?；?性，在所有參檢的5個(gè)小麥條銹菌標(biāo)樣中均呈現(xiàn)陽性擴(kuò)增，而在對照的3個(gè)小麥葉銹菌菌 株、3個(gè)小麥桿銹菌株及其它檢測的小麥病原真菌（赤霉菌Fusarium gram inearum、白粉 菌Erysiphe graminis、光渥黑粉菌Tilletia foetida(Wallr. )Liro、網(wǎng)渥黑粉菌Tilletia caries)中則沒有擴(kuò)增到該標(biāo)記（圖4)。
[0077] 實(shí)施例4.小麥條銹菌SCAR標(biāo)記的靈敏度檢測
[0078] 梯度稀釋小麥條銹菌模板DNA濃度為10ng/ μ L、lng/ μ L、100pg/ μ L、10pg/ μ L、 lpg/ μ L、100fg/ μ L、10fg/ μ L、lfg/ μ L。以稀釋的小麥條銹菌gDNA為模板，采用特異性引 物TF144G/TF323G，按照實(shí)施例3中優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增。
[0079] 結(jié)果表明，從lfg/ μ L的模板DNA中還能檢測到長度為180bp的SCAR標(biāo)記（圖 5) 。
[0080] 實(shí)施例5.感病小麥葉片內(nèi)條銹菌的檢測
[0081] 以小麥條銹菌菌株室內(nèi)苗期接種銘賢169,接種菌量為5mg每盆，對照處理噴滑石 粉。接種9h后開始取小麥葉片樣品，以無菌水清洗葉面后，液氮速凍，儲存于-80°C冰箱中， 用于小麥銹病顯癥前條銹菌的檢測。分別提取小麥條銹菌接種后9h、12h、20h、24h、48h、 72h、96h、120h的小麥葉片gDNA，采用特異性引物TF144G/TF323G，按照實(shí)施例3中優(yōu)化的 PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，在銹病顯癥前的小麥葉片中均成功地檢測到 相應(yīng)的小麥條銹菌SCAR標(biāo)記，最早于接種后9h可檢測出相應(yīng)的小麥條銹菌SCAR標(biāo)記（圖 6) 。
[0001] SEQUENCE LISTING <110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 <120>用于檢測小麥條銹菌的特異性SCAR標(biāo)記 <130> P140617/ZWB <160> 8 <170> Palcntln version 3.5 <210> 1 <211> 180 <212> DNA <213〉 Arlillcial Sequence <220〉 <223> 小麥條銹菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici)特異性 SCAR 標(biāo)記 <400> I cctgcgatgg igtagactca gtatglgcgc ctaggaagtg cgtgtgcgga Igcctcgaag 60 ggUataccl caltgaaata gacgttcalg cgctccagcl ggaggtcaga igtgccaltg 120 ialciagcag algllagagl gclgilclgc aggallcglc cnacacgaac alacacgccg i 80 <210〉 2 <211〉 20 <212> DNA <213> Arlificial Sequence <220〉 <223>用于小麥條銹菌（Pucciniastriiibrmis)檢測的SCAR標(biāo)記引物TF144G <400〉 2 eelgegatgg igtagactca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence
[0002] <220 <223>用于小麥條銹菌（Pxicciniastriiformis)檢測的SCAR標(biāo)記引物TF323G <400> 3 cggcglglat gilcgiglig 20 <210> 4 <211〉 24 <212> DNA <213> AniHcial Sequence <220> <223>用于擴(kuò)增特異件DNA片段的引物Bt2a <400> 4 ggtaaccaaa tcggtgctgc ttic 24 <210> 5 <211> 24 <212〉DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>用于擴(kuò)增特異性DNA片段的引物Bt2b <400> 5 accclcaglg tagtgaccct tgge 24 <210> 6 <211> 361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>小麥條銹菌（Pucciniastriiformis)的特異性DNA片段 <400> 6 IgagaigUg ccggcgccag actggccgga laegaagieg icgggacgga agagclgacc 60 gaaggggccl gcacgaacgg cglclatggc accgggclcc aaategaega ggacggcacg 120
[0003] cgggacgtac tlaltgicag aggcctgcga tgglglagac tcagtatgtg cgcctaggaa 180 glgcglgtgc ggalgcclcg aagggtlaia cctcatigaa atagacgllc atgcgclcca 240 gctggaggic agatgigcca Uglatctag cagatgtiag agtgctgitc Lgcaggaitc 300 glccaacacg aacalacacg ccggaagcgl cgaliccatg Ucgccagaa alggiclgcc 360 a 36 i <210〉 7 <211> 495 <212〉DNA <213> Arlillciai Sequence <220> <223>小麥葉銹菌（Pucciniatriticinia)的特異性DNA片段 <400> 7 tggtatgtll tcggcaattg ggagaatcag ggcgclacgg ggttcagtag aaaalactgg 60 acUUgggg glcgctclgi Ualigcggi gigacatgcl gacaalgtu acaggcagac 120 catctclggl gagcacggcc Ugaeggege cggtgtgtaa gtgcaagccg ccatlcgact 18U allcgctall cgagaglgaa allagaaacg aaagaalcga llglclgalg ggallgcagl 240 tacaatggct cctccgacct ccagctggag eggatgaaeg Ictaclttaa cgaggltcgt 300 glclUgccc IgggaLataa acxgltaccg igaUclgac ctcltcatla ggclagcggc 360 cagaagtacg Uccccglgc cglcctgglt gaccltgagc ciggtaccal ggalgccglc 420 cgtgccggtc cailcggtca gclcllccgt cccgacaacl tcglcttcgg ccagictggi 480 gclgglaaca aclgg 495 <2I0> 8 <211> 495 <212〉DNA <213> Artificial Sequence
[0004] <220〉 <223>小麥桿銹菌（Puccicinia graminis)的特異性DNA片段 <400> 8 tggtalglU Icggcaattg ggagaalcag ggcgctacgg ggltcaglag aaaalaclgg 60 acltltgggg gicgctctgl Uattgcggt gtgacatgci gacaatgllt acaggcagac 120 catctctggt gagcacggcc tlgacggcgc cggtglglaa glgcaagccg ccattcgacl 180 attcgctalt cgagagtgaa allagaaacg aaagaatcga ttgtctgatg ggatlgcagl 240 tacaatggct cctccgaccl ccagclggag cggatgaacg tctactUaa cgaggttcgt 300 gtctltgccc igggatataa accgtlaccg IgaUctgac ctcticalla ggciagcggc 360 cagaagtacg ilccccglgc cglcclggtl gaccttgagc clgglaccai. ggatgccgtc 420 cgtgccgglc catlcggtca gctcltccgt cccgacaact tcgtcttcgg ccagtctggt 480 gctggtaaca actgg 495
【權(quán)利要求】
1. 小麥條銹菌（Puccinia striiformis)的SCAR標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1 所示。
2. 用于小麥條銹菌（Puccinia striiformis)檢測的SCAR標(biāo)記引物，其核苷酸序列 為： TF144G :5' -CCTGCGATGGTGTAGACTCA-3'， TF323G :5' -CGGCGTGTATGTTCGTGTTG-3'， 其特征條帶的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. -種檢測小麥感染條銹菌（Puccinia striiformis)的方法，包括如下步驟： (1) 以待測小麥為材料，提取樣品DNA ; (2) 以樣品DNA為模板，采用權(quán)利要求2所述的SCAR標(biāo)記引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到擴(kuò)增 產(chǎn)物； ⑶瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，若擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)SEQ ID NO: 1所示的180bp特 征條帶，則所述樣品DNA中含有小麥條銹菌；若擴(kuò)增產(chǎn)物不含有SEQ ID NO: 1所示的180bp 條帶，則樣品DNA中不含有小麥條銹菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，所述PCR反應(yīng)的體系為：20ng/ μ L模板DNA1 μ L， ΙΟμΜ 弓I 物 TF144GlyL，10yM 弓I 物 TF323GlyL，2XEasyTaq PCR SuperMixl2.5yL， ddH209. 5 μ L〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，所述PCR反應(yīng)的條件為：94°C預(yù)變性4min;94°C變 性 30s、54. 5°C退火 30s、72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 8min。
6. 用于檢測小麥條銹菌的試劑盒，其特征在于：包括液態(tài)的或粉狀的用于小麥條銹菌 (Puccinia striiformis)檢測的SCAR標(biāo)記引物，其核苷酸序列為： TF144G :5' -CCTGCGATGGTGTAGACTCA-3'， TF323G :5' -CGGCGTGTATGTTCGTGTTG-3'。
【文檔編號】C12N15/11GK104120125SQ201410334568
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】高利, 陳萬權(quán), 劉太國, 劉博
申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所