一種向細胞內遞送物質的裝置和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種向細胞內遞送物質的裝置，該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面近似垂直于所述金剛石面層。本發(fā)明還提供了一種向細胞內遞送物質的方法，該方法包括如下步驟：(1)將細胞置于基板上的培養(yǎng)基中；(2)將向細胞內遞送物質的裝置置于所述培養(yǎng)基的液面上，形成夾心結構；(3)將所述夾心結構進行離心，離心的條件使得納米針的尖端刺入所述細胞。通過上述技術方案，本發(fā)明能夠對各種貼壁細胞(包括原代培養(yǎng)的神經元細胞)進行向細胞內遞送物質。
【專利說明】一種向細胞內遞送物質的裝置和方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體地，涉及一種向細胞內遞送物質的裝置和一種向細胞內遞送物質的方法，以及制備所述向細胞內遞送物質的裝置的方法。

【背景技術】
[0002]向活細胞內高效地遞送物質是細胞生物技術的重要課題，在細胞生物學的基礎研究、藥物制備和臨床治療方面都具有十分重要的應用價值。例如，在體細胞內遞送編碼特定的轉錄因子的基因、蛋白或mRNA就能將體細胞重新編程為誘導多能干細胞(iPS)狀態(tài)，這將解決再生醫(yī)學所用的移植細胞的來源問題。siRNA、多肽和納米顆粒等許多其它物質也具有潛在的醫(yī)學應用價值，但這些物質的向活細胞內的高效遞送是首先要解決的問題。
[0003]已經開發(fā)出來了多種促進物質跨膜遷移的方法。每個建立的方法在實際使用過程中都有自己的優(yōu)點和缺點，具體體現在效率、表達水平、毒性、細胞生存能力和設備要求等方面。例如，使用病毒載體的方法僅限于遞送核酸，但該方法的程序是勞動密集型的，并且常常涉及各種安全問題；如脂質體轉染的化學方法相對比較簡單，但對于后有絲分裂的細胞的效率通常很低(如對神經元細胞的效率僅有1-2% )，并且不適合蛋白和納米材料等的跨膜遞送；磷酸鈣沉淀方法的成本效益較高，但很難產生可重復的結果，轉染效率較低；電脈沖的方法通過施加電壓脈沖暫時改變細胞膜的特性來允許帶電材料進入細胞，但該方法通常需要細胞處于懸浮狀態(tài)，并且細胞毒性可能根據不同的細胞類型顯著不同。
[0004]最近，機械破壞細胞膜正在成為一種前景良好的向細胞內遞送物質的手段。例如，直徑800納米以下的單一納米針已被用于向細胞內遞送物質且沒有造成細胞的嚴重損害，但是使用這種單一納米針需要使用原子力顯微鏡并且該方法的通量極低。納米纖維或納米針的陣列可以用于提高效率，但現有的裝置和方法仍然需要將細胞懸浮起來，并且需要將待遞送的物質先固定在納米針上，還需要使用復雜的操作儀器，無法在貼壁細胞上使用，并且在非分裂期的細胞(如原代培養(yǎng)的神經元細胞)上無法使用。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服納米針的陣列無法在貼壁細胞上使用的缺陷，提供能夠在貼壁細胞上使用的一種向細胞內遞送物質的裝置和一種向細胞內遞送物質的方法。
[0006]為了實現上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種向細胞內遞送物質的裝置，該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層。
[0007]另一方面，本發(fā)明還提供了一種向細胞內遞送物質的方法，該方法包括如下步驟:(I)將細胞置于基板上的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有等待遞送的物質；(2)將向細胞內遞送物質的裝置置于所述培養(yǎng)基的液面上，形成夾心結構，所述向細胞內遞送物質的裝置包括基底和附著于基底表面上并彼此間隔的納米針，所述納米針為金剛石形成的納米針；所述納米針的尖端指向所述細胞；(3)將所述夾心結構進行離心，離心的條件使得所述納米針的尖％5刺入所述細胞。
[0008]再一方面，本發(fā)明還提供了一種制備向細胞內遞送物質的裝置的方法，該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，其中，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層；該方法包括如下步驟:(I)在硅底層上沉積形成納米金剛石膜，沉積的條件使得所述納米金剛石膜的厚度比期望得到的納米針的高度大0.5-5 μ m ; (2)對形成的納米金剛石膜進行偏壓輔助的反應離子刻蝕，其中，偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件包括:反應壓力為(4-8) X ΙΟ,οη.，反應時間為20分鐘至4小時；偏壓為-50V至-250V ;偏壓輔助的反應離子刻蝕的氣體包括H2、Ar與H2的混合氣和CH4與H2的混合氣中的至少一種。
[0009]通過上述技術方案，本發(fā)明能夠對貼壁細胞(特別是非分裂期的細胞，例如原代培養(yǎng)的神經元)進行向細胞內遞送物質。
[0010]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0012]圖1是本發(fā)明的向細胞內遞送物質的裝置的掃描電鏡圖。
[0013]圖2是本發(fā)明的向細胞內遞送物質的裝置的掃描電鏡圖的局部放大。
[0014] 圖3是現有技術中向細胞內遞送物質的裝置的掃描電鏡圖的局部放大。
[0015]圖4是制備實施例1的裝置在對神經元原代細胞遞送了 GFP的質粒DNA后，神經元原代細胞的特征性標志(MAP2和vGlutl)的表達情況的熒光顯微鏡照片。
[0016]圖5是作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實施方式的向細胞內遞送物質的方法的流程示意圖。

【具體實施方式】
[0017]以下結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0018]在本發(fā)明中，在未作相反說明的情況下，在向細胞內遞送物質的裝置中，使用的方位詞如“上、下”是指納米針沿高度延伸的方向而言的；在向細胞內遞送物質的方法中，使用的方位詞如“上、下”是指沿重力的方向而言的。
[0019]本發(fā)明提供了一種向細胞內遞送物質的裝置，該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層。
[0020]其中，本發(fā)明提供的向細胞內遞送物質的裝置中，所述納米針用于刺入細胞，使得等待遞送的物質隨著刺入得以遞送到細胞中。所述納米針豎立在所述金剛石面層上，形成納米針的陣列。
[0021]本文中術語“圓柱狀”還包括具有一定程度形變的圓柱體，例如，圓柱體在與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面的面積以及橫截面上兩點之間的最大距離的變異度可以均不超過10% ;與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面可以為近似的圓形，例如橫截面的邊緣上兩點之間的最大距離與最小距離的比值可以為1-1.3:1。
[0022]術語“垂直于所述金剛石面層”還包括近似垂直的情況，所述納米針的側面與所述金剛石面層的夾角可以為85-95度。
[0023]其中，所述納米針的直徑可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針的各種直徑，例如可以為10-800nm，優(yōu)選為50_600nm，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，更優(yōu)選為 200-450nm。
[0024]其中，所述納米針的高度可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針的各種高度，例如為3-8 μ m,優(yōu)選為3.5-6.5 μ m，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，更優(yōu)選為 3.8-5.3 μ m。
[0025]其中，所述納米針在所述金剛石面層上的分布密度可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針陣列中所用的密度，例如為(1-15) XlO6個/cm2，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，優(yōu)選為(4-8) X 16個/cm2。
[0026]其中，所述金剛石面層的厚度可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針陣列中所用的厚度，例如為0.5-5 μ m，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，優(yōu)選為1-4 μ m。
[0027]其中，所述硅底層的厚度可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針陣列中所用的厚度，例如為400-600 μ m，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，優(yōu)選為480-520 μm。
[0028]本發(fā)明還提供了一種向細胞內遞送物質的方法，該方法包括如下步驟:(1)將細胞置于基板上的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有等待遞送的物質；(2)將向細胞內遞送物質的裝置置于所述培養(yǎng)基的液面上，形成夾心結構，所述向細胞內遞送物質的裝置包括基底和附著于基底表面上并彼此間隔的納米針，所述納米針為金剛石形成的納米針；所述納米針的尖端指向所述細胞；(3)將所述夾心結構進行離心，離心的條件使得所述納米針的尖端刺入所述細胞。
[0029]其中，所述細胞可以直接以貼壁的方式生長在所述基板上，所述細胞也可以懸浮生長在所述基板上的培養(yǎng)基中，或者所述細胞可以由貼壁狀態(tài)改變?yōu)閼腋顟B(tài)。
[0030]其中，所述細胞可以在常規(guī)的生長培養(yǎng)基中生長，可以在臨遞送前將生長培養(yǎng)基替換為含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基。含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基可以通過向生長培養(yǎng)基中添加等待遞送的物質得到。所述生長培養(yǎng)基可以為常規(guī)使用的各種能用于培養(yǎng)細胞使其生長的培養(yǎng)基，例如可以為DMEM培養(yǎng)基、F-12培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基和Neural Basal培養(yǎng)基中的至少一種。所述生長培養(yǎng)基中可以添加血清，例如胎牛血清和/或小牛血清。
[0031]其中，將向細胞內遞送物質的裝置置于所述培養(yǎng)基的液面上之后，向細胞內遞送物質的裝置或者由于培養(yǎng)基的表面張力作用而漂浮在培養(yǎng)基液面上，或者沉入液面以下覆蓋在細胞上。
[0032]其中，所述向細胞內遞送物質的裝置可以為本發(fā)明如上所述的向細胞內遞送物質的裝置，即在向細胞內遞送物質的裝置中，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層。
[0033]本文中術語“圓柱狀”還包括具有一定程度形變的圓柱體，例如，圓柱體在與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面的面積以及橫截面上兩點之間的最大距離的變異度可以均不超過10% ;與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面可以為近似的圓形，例如橫截面的邊緣上兩點之間的最大距離與最小距離的比值可以為1-1.3:1。術語“垂直于所述金剛石面層”還包括近似垂直的情況，所述納米針的側面與所述金剛石面層的夾角可以為85-95度。
[0034]其中，所述納米針的直徑可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針的各種直徑，例如可以為10-800nm，優(yōu)選為50_600nm，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，更優(yōu)選為200-450nm。其中，所述直徑是指與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面的跨度。
[0035]其中，所述納米針的高度可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針的各種高度，例如為3-8 μ m,優(yōu)選為3.5-6.5 μ m,為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，更優(yōu)選為 3.8-5.3 μ m。
[0036]其中，所述納米針在所述金剛石面層上的分布密度可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針陣列中所用的密度，例如為(1-15) XlO6個/cm2，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，優(yōu)選為(4-8) X 16個/cm2。
[0037]其中，所述金剛石面層的厚度可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針陣列中所用的厚度，例如為0.5-5 μ m，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，優(yōu)選為1-4 μ m。
[0038]其中，所述硅底層的厚度可以為能夠用于向細胞內遞送物質的納米針陣列中所用的厚度，例如為400-600 μ m，為了進一步提高向細胞內遞送物質的效率，優(yōu)選為480-520 μ m。
[0039]其中，所述向細胞內遞送物質的裝置可以不限于如上所述的裝置，例如，所述向細胞內遞送物質的裝置中，所述納米針為錐體狀，且錐體狀的納米針的底面所述金剛石面層相連。其中，所述納米針可以為圓錐體狀，也可以為多邊形錐體狀。術語“錐體狀”是指所述納米針的側面與所述金剛石面層的夾角在45-80度之間。其中，錐體狀的納米針的高度可以為1-10 μ m，底面的直徑可以為0.5-2 μ m。其中，所述直徑是指與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面上兩點之間的最大距離。其中，錐體狀的納米針可以由兩段疊加而成，下段為臺體段，上段為錐體段，臺體段的上端的直徑為250-700nm，臺體段底部的直徑為1000-1900nm，臺體段的高度為6_9 μ m ;錐體段的直徑為100_150nm，錐體段的高度為300-500nm，所述納米針在所述金剛石面層上的分布密度為約(0.5-1.5) X 16個/cm2
[0040]其中，離心的條件能夠使得所述納米針的尖端刺入所述細胞即可，優(yōu)選情況下，離心的條件包括:相對離心力為10-15g，更優(yōu)選為12-13g。離心的時間可以為30-300S，優(yōu)選為 120-180s。
[0041]其中，相對于每cm2的貼壁細胞，含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基的使用量可以為20-250 μ I。
[0042]其中，所述細胞可以為懸浮細胞，也可以為貼壁細胞。所述細胞的來源可以為動物細胞、細菌細胞、真菌細胞和植物原生質體細胞中的至少一種。所述細胞可以為原代培養(yǎng)細胞，也可以為傳代培養(yǎng)的細胞。優(yōu)選地，所述細胞為ΝΙΗ3Τ3細胞、原代培養(yǎng)的海馬神經元細胞、成纖維細胞和Α549細胞中的至少一種。
[0043]其中，優(yōu)選情況下，離心在加速階段和減速階段在相對平緩的加減速條件下進行，更優(yōu)選地，所述離心在加速階段的相對離心力增加速率為0.001-0.003g/s ;所述離心在減速階段的相對離心力減少速率為0.003-0.006g/s。
[0044]其中，優(yōu)選情況下，離心結束后，可以繼續(xù)加入含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基使得向細胞內遞送物質的裝置浮起，從而進一步提高遞送的效率。相對于每cm2的貼壁細胞，浮起向細胞內遞送物質的裝置所用的含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基的使用量可以為250-650 μ I ο
[0045]其中，使得向細胞內遞送物質的裝置浮起并將其取出后，優(yōu)選在含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基繼續(xù)維持5-60分鐘，以進一步提高遞送的效率。
[0046]其中，優(yōu)選情況下，在進行了上述維持后可以將含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基更換為生長培養(yǎng)基。
[0047]其中，所述等待遞送的物質可以為細胞生物【技術領域】中常規(guī)使用的需要遞送到細胞中的物質，例如，所述等待遞送的物質可以包括DNA、RNA、PNA、染料、抗體和納米顆粒中的至少一種；其中，所述染料可以包括乙啡啶同型二聚體、FITC標記的葡萄聚糖和量子點中的至少一種，所述納米顆粒可以包括聚乙烯納米顆粒。其中，DNA是指脫氧核糖核酸，RNA是指核糖核酸，PNA是指肽核酸。FITC是指異硫氰酸熒光素。
[0048]其中，所述等待遞送的物質在培養(yǎng)基中的濃度可以為細胞生物【技術領域】中常規(guī)使用的濃度，例如，在培養(yǎng)基中，DNA的濃度可以為0.5-2 μ g/mL，抗體的濃度可以為
0.5-2μg/ml,乙啡啶同型二聚體的濃度可以為0.5-2 μ Μ, FITC標記的葡萄聚糖的濃度可以為0.2-0.8mg/ml，量子點的濃度可以為1_40ηΜ，聚乙烯納米顆粒的濃度可以為(3-5) X10_5% (w/v) ο
[0049]其中，作為本發(fā)明特別優(yōu)選的一種實施方式，所述等待遞送的物質包括DNA、RNA和PNA中的至少一種，所述培養(yǎng)基還含有核酸轉染助劑；其中，所述核酸轉染助劑包括陽離子脂質體；優(yōu)選地，所述陽離子脂質體包括Lipofectamine。其中，核酸轉染助劑的使用濃度可以為0.5-2 μ g/mL。
[0050]其中，本發(fā)明的向細胞內遞送物質的方法，可以僅用于處理體外培養(yǎng)的細胞，而不用于處理活的動物身上的細胞。并且，體外培養(yǎng)的細胞在使用本發(fā)明的向細胞內遞送物質的方法處理之后，可以不再移植進入活的動物體，可以不發(fā)育為活的動物體。體外培養(yǎng)的細胞在使用本發(fā)明的向細胞內遞送物質的方法處理之后，可以不排除再移植進入活的動物體的可能，可以不排除發(fā)育為活的動物體的可能。
[0051]其中，向細胞內遞送物質的裝置在完成一次遞送后，可以進行清洗以備下次使用。清洗液的成分可以為濃度大于98重量％的濃硫酸，相對于每cm2的金剛石面層，清洗液的用量為0.5-2ml。
[0052]本發(fā)明還提供了一種制備向細胞內遞送物質的裝置的方法，該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層；該方法包括如下步驟:(I)在硅底層上沉積形成納米金剛石膜，沉積的條件使得所述納米金剛石膜的厚度比所述納米針的高度大0.5-5 μ m ； (2)對形成的納米金剛石膜進行偏壓輔助的反應離子刻蝕，其中，偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件包括:反應壓力為(4-8) X 10_3Torr，反應時間為20分鐘至4小時；偏壓為-50V至-250V ;偏壓輔助的反應離子刻蝕的氣體包括H2、Ar與H2、的混合氣和CH4與H2的混合氣中的至少一種。
[0053]其中，所述硅底層可以為硅圓片。所述硅圓片的直徑可以為l-20cm，優(yōu)選為5-10cm。所述娃圓片的厚度可以為400-600 μ m,優(yōu)選為480-520 μ m。所述娃圓片可以經單晶硅切割得到。所述單晶硅可以為η型單晶硅，也可以為P型單晶硅。
[0054]其中，該方法還可以包括:在硅底層上沉積形成納米金剛石膜之前，可以用拋光劑對硅底層進行拋光；所述拋光劑可以含有納米金剛石顆粒和有機溶劑，所述納米金剛石顆粒的粒徑可以為3-8nm，所述有機溶劑為乙醇；相對于每毫升的有機溶劑。其中，拋光的時間為 30-90min。
[0055]其中，在硅底層上沉積形成納米金剛石膜可以使用本領域已知的方法實現，例如使用微波等離子體化學氣相沉積(microwave plasma chemical vapor cbposit1n，MPCVD)來實現，可以在商業(yè)購買的儀器中施行，例如購自ASTeX的微波等離子體化學氣相沉積儀。微波等離子體化學氣相沉積的條件可以包括:微波功率可以為0.8-1.6kff ;誘導形成等離子體的氣體可以為CH4和H2的混合氣體，其中CH4和H2的體積比可以為0.05-0.2:1 ;沉積所用的氣體壓力可以為20-40Torr，氣體流速可以為100-300sccm ;溫度可以為700-900°C。沉積得到的納米金剛石膜的厚度可以通過控制沉積的時間長短來實現，例如沉積形成7-10 μ m厚的納米金剛石膜所需的時間可以為15-20小時。
[0056]其中，對形成的納米金剛石膜進行偏壓輔助的反應離子刻蝕(bias-assistedreactive 1n etching, bias-assisted RIE)可以使用本領域已知的方法實現,例如使用電子回旋共振微波等離子體化學氣相沉積(electron cyclotron resonance microwaveplasma chemical vapor deposit1n, ECR MPCVD)來實現，可以在商業(yè)購買的儀器中施行，例如購自ASTeX的微波源使用外部磁力環(huán)的微波等離子體化學氣相沉積儀來實現，外部磁力環(huán)的磁場強度可以為800-950高斯。其中，偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件包括:反應壓力為(4-8) X 10_3Torr，反應時間為20分鐘至4小時；偏壓為-50V至-250V ;偏壓輔助的反應離子刻蝕的氣體包括H2、Ar與H2、的混合氣和CH4與H2的混合氣中的至少一種。由于控制了上述特定的反應壓力和反應時間，使得制備得到的向細胞內遞送物質的裝置中，所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層。其中，偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件還可以包括:反應氣體的流速可以為10-30sccm ;蝕刻時的微波功率可以為0.4-1.2kW。
[0057]其中，所述向細胞內遞送物質的裝置可以稱為“芯片”，可以在制備完成后根據需要切割至所需要的大小，例如，對于培養(yǎng)孔直徑為15mm的24孔培養(yǎng)板，可以將所述向細胞內遞送物質的裝置切割為直徑10-14_的圓片使用。
[0058]以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
[0059]制備實施例1
[0060]本制備實施例用于說明本發(fā)明的向細胞內遞送物質的裝置及其制備方法。
[0061]將直徑為7.5cm、厚度為500 μ m的η型單晶硅圓片用拋光劑在超聲波下進行60分鐘的拋光。所述拋光劑為粒徑為5nm的納米金剛石顆粒與乙醇的混合物。
[0062]將拋光后的硅圓片放入購自ASTeX的微波等離子體化學氣相沉積儀中，進行納米金剛石膜的沉積。微波等離子體化學氣相沉積的條件包括:微波功率為1.2kff ;誘導形成等離子體的氣體為CH4和H2的混合氣體，其中CH4和H2的體積比為0.11:1 ;沉積所用的氣體壓力為30Torr,氣體流速為200sccm ;溫度可以為800°C。沉積形成7 μ m厚的納米金剛石膜所需的時間為15小時。沉積結束后，得到了在硅圓片上形成的納米金剛石膜。納米金剛石膜的厚度經過掃描電子顯微鏡方法檢測為7 μ m。
[0063]將在硅圓片上形成的納米金剛石膜在購自ASTeX的微波源使用外部磁力環(huán)的微波等離子體化學氣相沉積儀中進行偏壓輔助的反應離子刻蝕。其中，外部磁力環(huán)的磁場強度為約875高斯。偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件包括:反應壓力為7X10_3Torr，反應時間為3小時；蝕刻使用的反應氣體為H2,反應氣體的流速為20SCCm ;蝕刻時所施加的偏壓為-200V ;蝕刻時的微波功率為0.8kW。蝕刻結束后，得到本發(fā)明的向細胞內遞送物質的裝置。
[0064]使用購自Philips的掃描電子顯微鏡(FEG SEM XL30)對上述得到的向細胞內遞送物質的裝置進行觀測，以測定其形態(tài)學特征，其照片如圖1和圖2所示，可見其具有如下形態(tài)特征:該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層。在與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面的面積以及橫截面的跨度的變異度均不超過10%。所述納米針的側面與所述金剛石面層的夾角在85-95度之間。所述納米針的直徑為326±110nm。所述納米針的高度為4.55±0.68 μ m,所述納米針在所述金剛石面層上的分布密度為約6.6 X 16個/cm2。蝕刻后，所述金剛石面層的厚度為1.2μηι。
[0065]制備對比例I
[0066]本制備對比例用于說明現有技術的向細胞內遞送物質的裝置及其制備方法。
[0067]將直徑為7.5cm、厚度為500 μ m的η型單晶硅圓片用拋光劑在超聲波下進行60分鐘的拋光。所述拋光劑為粒徑為5nm的納米金剛石顆粒與乙醇的混合物。
[0068]將拋光后的硅圓片放入購自ASTeX的微波等離子體化學氣相沉積儀中，進行納米金剛石膜的沉積。微波等離子體化學氣相沉積的條件包括:微波功率為1.2kff ;誘導形成等離子體的氣體為CH4和H2的混合氣體，其中CH4和H2的體積比為0.11:1 ;沉積所用的氣體壓力為30Torr,氣體流速為200sccm ;溫度可以為800°C。沉積形成8 μ m厚的納米金剛石膜所需的時間為16.5小時。沉積結束后，得到了在硅圓片上形成的納米金剛石膜。納米金剛石膜的厚度經過掃描電子顯微鏡方法檢測為8 μ m。
[0069]將在硅圓片上形成的納米金剛石膜在購自ASTeX的微波源使用外部磁力環(huán)的微波等離子體化學氣相沉積儀中進行偏壓輔助的反應離子刻蝕。其中，外部磁力環(huán)的磁場強度為約875高斯。偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件包括:反應壓力為6X10_3Torr，反應時間為7小時；蝕刻使用的反應氣體為H2,反應氣體的流速為20SCCm ;蝕刻時所施加的偏壓為-200V ;蝕刻時的微波功率為0.8kW。蝕刻結束后，得到現有技術的向細胞內遞送物質的
>j-U ρ?α裝直。
[0070]使用購自Philips的掃描電子顯微鏡(FEG SEM XL30)對上述得到的向細胞內遞送物質的裝置進行觀測，以測定其形態(tài)學特征，其照片如圖3所示，可見其具有如下形態(tài)特征:該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，所述納米針為錐體狀，所述納米針的側面與所述金剛石面層的夾角在65-75度之間。在與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面的面積以及橫截面的跨度的變異度均超過25%。所述納米針由兩段疊加而成，下段為臺體段，上段為錐體段，臺體段的上端的直徑為528±206nm，臺體段底部的直徑為1600±310nm，臺體段的高度為7.42± 1.35 μ m ;錐體段的直徑為135±20nm，錐體段的高度為413± 103nm，所述納米針在所述金剛石面層上的分布密度為約1.1 X 16個/cm2。蝕刻后，所述金剛石面層的厚度為1.1 μ m。
[0071]制備實施例2
[0072]本制備實施例用于說明本發(fā)明的向細胞內遞送物質的裝置及其制備方法。
[0073]將直徑為7.5cm、厚度為400 μ m的η型單晶硅圓片用拋光劑在超聲波下進行60分鐘的拋光。所述拋光劑為粒徑為5nm的納米金剛石顆粒與乙醇的混合物。
[0074]將拋光后的硅圓片放入購自ASTeX的微波等離子體化學氣相沉積儀中，進行納米金剛石膜的沉積。微波等離子體化學氣相沉積的條件包括:微波功率為0.Skff ;誘導形成等離子體的氣體為CH4和H2的混合氣體，其中CH4和H2的體積比為0.05:1 ;沉積所用的氣體壓力為20Torr,氣體流速為10sccm ;溫度可以為700°C。沉積形成10 μ m厚的納米金剛石膜所需的時間為20小時。沉積結束后，得到了在硅圓片上形成的納米金剛石膜。納米金剛石膜的厚度經過掃描電子顯微鏡方法檢測為10 μ m。
[0075]將在硅圓片上形成的納米金剛石膜在購自ASTeX的微波源使用外部磁力環(huán)的微波等離子體化學氣相沉積儀中進行偏壓輔助的反應離子刻蝕。其中，外部磁力環(huán)的磁場強度為約800高斯。偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件包括:反應壓力為4X10_3Torr，反應時間為20分鐘；蝕刻使用的反應氣體為Ar與H2, Ar與H2的體積比為0.4:1，反應氣體的流速為20SCCm ;蝕刻時所施加的偏壓為-50V ;蝕刻時的微波功率為0.4kW。蝕刻結束后，得到本發(fā)明的向細胞內遞送物質的裝置。
[0076]使用購自Philips的掃描電子顯微鏡(FEG SEM XL30)對上述得到的向細胞內遞送物質的裝置進行觀測，以測定其形態(tài)學特征，可見其具有如下形態(tài)特征:該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層。在與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面的面積以及橫截面的跨度的變異度均不超過10%。所述納米針的側面與所述金剛石面層的夾角在85-95度之間。所述納米針的直徑為287±101nm。所述納米針的高度為4.25±0.39 μ m，所述納米針在所述金剛石面層上的分布密度為約4.8X 16個/cm2。蝕刻后，所述金剛石面層的厚度為3.7 μ m。
[0077]制備實施例3
[0078]本制備實施例用于說明本發(fā)明的向細胞內遞送物質的裝置及其制備方法。
[0079]將直徑為7.5cm、厚度為600 μ m的η型單晶硅圓片用拋光劑在超聲波下進行60分鐘的拋光。所述拋光劑為粒徑為5nm的納米金剛石顆粒與乙醇的混合物。
[0080]將拋光后的硅圓片放入購自ASTeX的微波等離子體化學氣相沉積儀中，進行納米金剛石膜的沉積。微波等離子體化學氣相沉積的條件包括:微波功率為1.6kff ;誘導形成等離子體的氣體為CH4和H2的混合氣體，其中CH4和H2的體積比為0.18:1 ;沉積所用的氣體壓力為40Torr,氣體流速為300sccm ;溫度可以為800°C。沉積形成9 μ m厚的納米金剛石膜所需的時間為18小時。沉積結束后，得到了在硅圓片上形成的納米金剛石膜。納米金剛石膜的厚度經過掃描電子顯微鏡方法檢測為9 μ m。
[0081]將在硅圓片上形成的納米金剛石膜在購自ASTeX的微波源使用外部磁力環(huán)的微波等離子體化學氣相沉積儀中進行偏壓輔助的反應離子刻蝕。其中，外部磁力環(huán)的磁場強度為約950高斯。偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件包括:反應壓力為8X10_3Torr，反應時間為4小時；蝕刻使用的反應氣體為CH4與H2的混合氣，CH4與H2的體積比為0.12:1，反應氣體的流速為30SCCm ;蝕刻時所施加的偏壓為-250V ;蝕刻時的微波功率為1.2kW。蝕刻結束后，得到本發(fā)明的向細胞內遞送物質的裝置。
[0082]使用購自Philips的掃描電子顯微鏡(FEG SEM XL30)對上述得到的向細胞內遞送物質的裝置進行觀測，以測定其形態(tài)學特征，可見其具有如下形態(tài)特征:該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層。在與金剛石面層平行的方向上，所述納米針的橫截面的面積以及橫截面的跨度的變異度均不超過10%。所述納米針的側面與所述金剛石面層的夾角在85-95度之間。所述納米針的直徑為327±123nm。所述納米針的高度為4.67±0.59 μ m，所述納米針在所述金剛石面層上的分布密度為約4.5X106個/cm2。蝕刻后，所述金剛石面層的厚度為3.2μπι。
[0083]測試實施例1
[0084]本測試實施例使用制備實施例1-3和制備對比例I制備得到的向細胞內遞送物質裝置，用于說明本發(fā)明的向細胞內遞送物質的方法。
[0085](I)細胞培養(yǎng)
[0086]ΝΙΗ3Τ3成纖維細胞和Α549腫瘤細胞培養(yǎng)于添加了 L-谷氨酰胺和青鏈霉素以及10體積％的胎牛血清(FBS，購自HyClone)的DMEM培養(yǎng)基(購自Life Technology)。在進行遞送前，這些細胞接種于4孔板中(購自Thermo Scientific)生長于上述培養(yǎng)基中。
[0087]對于原代神經元培養(yǎng)，海馬神經元培養(yǎng)于12mm的Germen蓋玻片(購自BellcoGlass)上。其中,所述蓋玻片用70體積％的硝酸浸泡過夜并用雙蒸水潤洗；然后用100 μ g/ml的多聚賴氨酸(購自Sigma)過夜包被，并且在臨接種神經元細胞前用10 μ g/ml的層粘連蛋白(購自Invitrogen)包被4小時。從E18SD大鼠(E18Sprague Dawley)中分離海馬組織。磨碎酶解后的海馬組織用ImL含10體積％ FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮，得到神經元細胞懸液。然后將神經元細胞懸液以(3-5) X 1Vcm2的密度接種在放置于4孔板的上述蓋玻片上。接種后2小時，神經元細胞完成起始貼壁，將培養(yǎng)基更換為添加了 B27、L-谷氨酰胺和青鏈霉素的Neurobasal培養(yǎng)基,并且每3_4天更換一半的培養(yǎng)基。
[0088](2)等待遞送的物質
[0089]等待遞送的物質包括鈣黃綠素(Calcein-AM，I μ Μ)、乙啡啶同型二聚體(EthD-1, I μ Μ)、0.5mg/ml的FITC標記的葡萄聚糖(分子量為3k_5kDa,購自Sigma)、4X10_5% (w/v)的聚乙烯納米顆粒(粒徑為200nm,購自武漢家園)、1 μ g/ml的抗體(猴IgG,購自 Life Technology)。
[0090]對于量子點(購自武漢家園)，測試了 1.6nM、8nM和40nM的濃度對神經元細胞的遞送效率。該水溶性量子點具有基于CdSe/ZnS的核殼結構，并在625nm處具有發(fā)射波長，并且具有聚乙二醇的修飾。為了遞送綠色熒光蛋白(GFP)的質粒DNA，DNA的使用濃度為
Iμ g/mL,并且加入 Lipofectamine2000 (購自 Life Technology)至濃度為 I μ 1/mL 作為轉染助劑。
[0091](3)向細胞內遞送物質
[0092]參考圖5，為了向4孔板(孔直徑為15_)中的貼壁培養(yǎng)細胞進行向細胞內遞送物質，首先將生長培養(yǎng)基替換為50 μ I含有等待遞送的物質(分別為熒光染料、葡萄聚糖、熒光標記抗體(猴IgG)、納米顆粒和DNA等)的培養(yǎng)基。將制備實施例1-3和制備對比例I得到的向細胞內遞送物質的裝置置于含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基的液面上，并使納米針的尖端指向所述細胞，形成夾心結構，該夾心結構由下到上依次為培養(yǎng)器皿、貼壁細胞、含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基和向細胞內遞送物質的裝置。
[0093]將所述夾心結構整體置于離心機(型號Sorvall ST16R,購自Thermo Scientific)中，該離心機帶有多孔板轉頭(M-20轉頭,購自Thermo Scientific),并且能精確地控制離心速度?？刂齐x心機進行平緩的加速，離心在加速階段的相對離心力增加速率為0.002g/s,直至相對離心力增加為12.5g，維持30s后，進行平緩的減速，離心在減速階段的相對離心力減少速率為0.004g/s。離心結束后，加入450 μ I的含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基，使得向細胞內遞送物質的裝置浮起，取出向細胞內遞送物質的裝置。然后繼續(xù)維持30分鐘，接著加入生長培養(yǎng)基，并替換含有等待遞送的物質的培養(yǎng)基。由此，完成向細胞內遞送物質。
[0094] 完成向細胞內遞送物質后，對細胞進行繼續(xù)培養(yǎng)以觀察遞送的效率。對向細胞內遞送物質的裝置進行清洗，清洗液的成分為98重量％的硫酸，相對于每cm2的金剛石面層，清洗液的用量為1ml。。
[0095]按照文獻(Decherchia, P., et al.Dual staining assessment of Schwanncell viability within whole peripheral nerves using calcein—AM and ethidiumhomodimer.J.Neurosc1.Methods.71，205-213 (1997).)中的方法，分別計算制備實施例1-3和制備對比例I的裝置對乙啡啶同型二聚體的遞送的效率以及細胞存活率，結果如表1所示。
[0096]表1
[0097]

【權利要求】
1.一種向細胞內遞送物質的裝置，該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，其特征在于:所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層。
2.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于:所述圓柱狀納米針橫截面的直徑為10-800nm，優(yōu)選為50_600nm，更優(yōu)選為200_450nm ;所述納米針的高度為3-8 μ m，優(yōu)選為3.5-6.5 μ m,更優(yōu)選為 3.8-5.3 μ m。
3.根據權利要求1或2所述的裝置，其特征在于:所述納米針在所述金剛石面層上的分布密度為(1-15) X 16個/cm2，優(yōu)選為(4-8) X 16個/cm2。
4.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于:所述金剛石面層的厚度為0.5-5 μ m，所述硅底層的厚度為400-600 μ m。
5.一種向細胞內遞送物質的方法，其特征在于:該方法包括如下步驟: (1)將細胞置于基板上的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有等待遞送的物質； (2)將向細胞內遞送物質的裝置置于所述培養(yǎng)基的液面上，形成夾心結構，所述向細胞內遞送物質的裝置包括基底和附著于基底表面上并彼此間隔的納米針，所述納米針為金剛石形成的納米針；所述納米針的尖端指向所述細胞； (3)將所述夾心結構 進行離心，離心的條件使得所述納米針的尖端刺入所述細胞。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:所述向細胞內遞送物質的裝置為權利要求1-4中任意一項所述的向細胞內遞送物質的裝置。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:所述向細胞內遞送物質的裝置中，所述納米針為錐體狀，且錐體狀的納米針的底面所述金剛石面層相連。
8.根據權利要求5-7中任意一項所述的方法，其特征在于:離心的條件包括:相對離心力為10-15g，優(yōu)選為12-13g。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述離心在加速階段的相對離心力增加速率為0.001-0.003g/s ;所述離心在減速階段的相對離心力減少速率為0.003-0.006g/s。
10.根據權利要求5-7和9中任意一項所述的方法，其特征在于:所述等待遞送的物質包括DNA、RNA、PNA、染料、蛋白質、抗體、小分子藥物和納米顆粒中的至少一種；其中，所述染料包括乙啡啶同型二聚體和/或量子點，所述納米顆粒包括聚乙烯納米顆粒。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于:所述等待遞送的物質包括DNA、RNA和PNA中的至少一種，所述培養(yǎng)基還含有核酸轉染助劑；其中，所述核酸轉染助劑包括陽離子脂質體。
12.—種制備向細胞內遞送物質的裝置的方法，其特征在于:該裝置包括具有金剛石面層的基底和形成于金剛石面層上并彼此間隔的金剛石納米針，所述基底還具有在金剛石面層下的硅底層，其特征在于:所述納米針為圓柱狀納米針，且所述納米針的側面垂直于所述金剛石面層；該方法包括如下步驟: (1)在硅底層上沉積形成納米金剛石膜，沉積的條件使得所述納米金剛石膜的厚度比期望得到的納米針的高度大0.5-5 μ m ； (2)對形成的納米金剛石膜進行偏壓輔助的反應離子刻蝕，其中，偏壓輔助的反應離子刻蝕的條件包括:反應壓力為(4-8) X 10_3Torr，反應時間為20分鐘至4小時；偏壓為-50V至-250V ;偏壓輔助的反應離子刻蝕的氣體包括H2、Ar與H2的混合氣和CH4與H2的混合氣中的至少一種。
【文檔編號】C12N15/63GK104178414SQ201410337234
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權日:2014年7月15日
【發(fā)明者】史鵬, 陳獻峰, 張文軍 申請人:香港城市大學