一株產(chǎn)d-阿拉伯糖醇的魯氏酵母菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的魯氏酵母菌株及其應(yīng)用，涉及微生物工業(yè)菌株開(kāi)發(fā)及應(yīng)用領(lǐng)域。從天然荊條花蜜中分離到一株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的耐高滲酵母菌Zygosaccharomycesrouxii。本發(fā)明所提供的菌株保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CCTCC NO：M 2014205。5L發(fā)酵罐試驗(yàn)跟蹤表明，該菌株代謝正常，發(fā)酵性能穩(wěn)定。利用該酵母菌株轉(zhuǎn)化底物D-葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，工藝簡(jiǎn)單，節(jié)約環(huán)保，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)40%，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，是一株優(yōu)良的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌株。CCTCC NO：M 20142052014.05.14
【專利說(shuō)明】—株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的魯氏酵母菌株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物工業(yè)菌株開(kāi)發(fā)及應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌的篩選及其轉(zhuǎn)化D-葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的技術(shù)方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003]D-阿拉伯糖醇是一種天然存在的五碳多元糖醇，又稱D_( + )_阿拉伯醇，D( + )_樹(shù)膠糖醇，其分子式為C5H12O5，與木酮糖和木糖醇是同分異構(gòu)體。常溫下，D-阿拉伯糖醇純品外觀為白色晶體，有甜味，吸濕性強(qiáng)。D-阿拉伯糖醇是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的天然低熱值甜味物質(zhì)，抗齲齒，在生物機(jī)體內(nèi)的代謝作用不影響胰島素水平，可作為糖尿病人的營(yíng)養(yǎng)齊U、治療劑，兒童防齲食品，食品添加劑，同時(shí)也是一種重要的神經(jīng)性藥物的合成中間體。因此，D-阿拉伯糖醇在食品，化工，醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]目前，D-阿拉伯糖醇的制備方法主要采用化學(xué)合成和生物合成法?；瘜W(xué)合成法即通過(guò)催化還原D-阿拉伯糖醇或者D-來(lái)蘇糖獲得，該法工藝復(fù)雜，設(shè)備要求高，環(huán)境污染嚴(yán)重，尚未實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。生物合成法是利用微生物體內(nèi)的酶系將葡萄糖轉(zhuǎn)化為D-阿拉伯糖醇，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，操作粗放，投資小收益大。Spencer等人最早發(fā)現(xiàn)耐高滲酵母可產(chǎn)多元醇，開(kāi)辟了生產(chǎn)多元糖醇的新途徑。Onishi等人報(bào)道了轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇是可行的。隨后，利用微生物制備D-阿拉伯糖醇的研究受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。
[0005]目前制約D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量的主要因素是副產(chǎn)物的產(chǎn)生和低轉(zhuǎn)化率，從自然環(huán)境直接分離篩選高產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的優(yōu)良酵母是最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的獲得生產(chǎn)出發(fā)菌株的方法。本發(fā)明從天然荊條花蜜樣品中分離到一株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的耐高滲魯氏接合酵母(.Zygosaccharomyces rouxii )0所提供菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為:CCTCC M 2014205。利用該酵母菌株轉(zhuǎn)化底物D-葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，工藝簡(jiǎn)單，節(jié)約環(huán)保，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)40%，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，是一株優(yōu)良的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇酵母菌株。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株新的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的耐高滲魯氏酵母菌株，及其在葡萄糖發(fā)酵方面的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明先利用高滲液體培養(yǎng)基對(duì)所采集的天然花蜜樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，隨后涂布于高滲平板，挑取疑似菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，采用薄層(微晶纖維素)層析法對(duì)發(fā)酵液中的糖醇類物質(zhì)進(jìn)行初步定性檢測(cè)和粗定量檢測(cè)，初步篩選出D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量高、甘油等其他副產(chǎn)物產(chǎn)量低且葡萄糖殘留量少的菌株，將其發(fā)酵液再次通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行定量復(fù)篩檢測(cè)，選育優(yōu)良的酵母菌株。
[0009]1、本發(fā)明所提供的魯氏接合酵母菌株JM-C46 (,Zygosaccharomyces rouxiiJM-C46)，已于2014年5月14日保藏于位于中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCCNO: M 2014205。
[0010]2、本發(fā)明利用所提供酵母菌株，采用250ml三角瓶進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，首先通過(guò)響應(yīng)面法(RSM)對(duì)試驗(yàn)菌株轉(zhuǎn)化底物葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，然后通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化；最后采用5L發(fā)酵罐試驗(yàn)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)該菌株的發(fā)酵性能及其生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力。
[0011]發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明:該菌株葡萄糖耐受濃度可達(dá)到500g/L。最適發(fā)酵條件為:底物D-葡萄糖濃度20-25%、酵母提取物1.07%、胰蛋白胨0.72%、發(fā)酵溫度30°C、自然pH、搖床轉(zhuǎn)速200rpm、轉(zhuǎn)化時(shí)間4天、接種量10%。
[0012]5L發(fā)酵罐試驗(yàn)結(jié)果表明:該菌株在最適發(fā)酵條件下發(fā)酵結(jié)束后:葡萄糖殘量為:3.89 g/L、D-阿拉伯糖醇含量為:79.16 g/L、甘油含量為:9.43 g/L、乙醇含量為:3.21g/L。該菌株的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇能力較高。
[0013]有益效果:
I)本發(fā)明采用高糖富集培養(yǎng)技術(shù)、薄層層析技術(shù)以及高效液相色譜技術(shù)篩選到了產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的優(yōu)良菌株CCTCC M 2014205。該菌株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力較高。對(duì)發(fā)展生物轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的技術(shù)路線有一定的促進(jìn)作用。
[0014]2)發(fā)酵罐試驗(yàn)跟蹤的各項(xiàng)性能指標(biāo)表明:該菌株代謝正常，產(chǎn)D-阿拉伯糖醇能力強(qiáng)，甘油、乙醇等副產(chǎn)物含量較低，葡萄糖殘?zhí)橇枯^低，是一株優(yōu)良的D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)菌株。

【具體實(shí)施方式】
[0015]下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域研究人員更全面地了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0016]1、本發(fā)明所提供的魯氏接合酵母菌株JM-C46 (,Zygosaccharomyces rouxiiJM-C46)，已于2014年5月14日保藏于位于中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCCNO: M 2014205。
[0017]該菌株特點(diǎn)如下:
在顯微鏡下觀察，該菌株的細(xì)胞為圓形，多端芽殖；在固體培養(yǎng)基上，該菌株菌落特征為:奶油色，凸起，表面光滑濕潤(rùn)，粘稠，邊緣整齊，菌落較小。
[0018]本發(fā)明酵母菌株采用下述流程進(jìn)行選育:
花蜜樣品采集、高滲液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、梯度稀釋、涂布高滲平板、劃線分離疑似菌落、進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)、薄層層析法初篩、高效液相色譜法復(fù)篩、5L發(fā)酵罐試驗(yàn)、獲得目的菌株、鑒定、保藏。
[0019]實(shí)施例1:
具體操作過(guò)程如下:
1、高滲富集培養(yǎng)
配制富集培養(yǎng)基:40% D-glucose, 1% yeast extract, 1% peptone。
[0020]不同花蜜樣品分別稱取1.0 g，加入到含有20ml富集培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，渦旋均勻。30°C，200r/min，搖瓶培養(yǎng)3d。
[0021]將最終富集培養(yǎng)物梯度稀釋后，分別吸取200 μ I涂布到高滲平板，30°C培養(yǎng)3d。
[0022]挑選生長(zhǎng)良好的疑似酵母的單菌落劃線分離純化，斜面保存于4°C冰箱。
[0023]2、采用TLC法初篩
配制發(fā)酵培養(yǎng)基:20% D-glucose, 1% yeast extract, 1% peptone。
[0024]在超凈工作臺(tái)，將分離到的不同酵母菌株，各取一環(huán)接入含有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。30°C，200r/min,搖瓶培養(yǎng)4d。
[0025]發(fā)酵液處理方法:取不同菌株的發(fā)酵液各1ml, 1000r離心lOmin。
[0026]以微晶纖維素板為層析介質(zhì)，展開(kāi)劑及其配比為:乙酸乙酯:吡啶:冰醋酸:水=16:10:2:3。層析前，層析劑需要預(yù)飽和Ih0
[0027]配制2%D_葡萄糖和2%D_阿拉伯糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液以及二者等比例的混合標(biāo)樣，層析上樣量為I μ L，點(diǎn)樣線位于距離層析板下邊緣1.8厘米處，點(diǎn)樣結(jié)束后晾干，方可放入層析缸，層析時(shí)間為80min，重復(fù)層析3?4次。
[0028]層析結(jié)束后自然晾干，或置于50°C烘箱中加快殘留試劑的蒸發(fā)。
[0029]顯色劑的配制:硝酸銀丙酮溶液A-飽和氫氧化鈉酒精溶液B
A:取0.1mL飽和硝酸銀溶液,用丙酮稀釋至20mL,再逐滴加水至硝酸銀溶解即可將NaOH飽和水溶液用酒精稀釋至0.5mol/L。
[0030]用三角噴壺先將硝酸銀-丙酮溶液均勻噴于層析板上，充分晾干后再噴氫氧化鈉-乙醇溶液。
[0031]顯色完畢后標(biāo)記D-阿拉伯糖醇含量較高的菌株，等待后續(xù)的進(jìn)一步篩選。
[0032]3、采用HPLC法復(fù)篩
配制發(fā)酵培養(yǎng)基:20% D-glucose, 1% yeast extract, 1% peptone。
[0033]在超凈工作臺(tái)，將初篩得到的酵母菌株，各取一環(huán)接入含有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。30°C，200r/min,搖瓶培養(yǎng)4d。
[0034]發(fā)酵液處理方法:取不同菌株的發(fā)酵液各1ml，用等體積的三氯乙酸沉淀蛋白3h，12000r離心20min,經(jīng)0.45 μ m水膜過(guò)濾處理,進(jìn)樣量20 μ L。
[0035]1%質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取D-葡萄糖、D-阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、乙醇、甘油各0.lg，用乙腈水溶液(V⑶:V水=1:1)定容至10ml。
[0036]樣品測(cè)定的分析條件:采用示差折光檢測(cè)器(RID，ShodexRIlOO)，色譜柱型號(hào):，柱溫35°C，流動(dòng)相為乙腈水溶液(Vill =V*=80:20)，流速0.8mL/min，檢測(cè)器溫度35°C，泵壓 43bar。
[0037]樣品測(cè)定方法:打開(kāi)檢測(cè)器，預(yù)熱使穩(wěn)定；設(shè)定分析程序；安裝色譜柱，打開(kāi)液相色譜儀，通入流動(dòng)相，設(shè)定流速0.lmL/min，平衡2h ;使流動(dòng)相流過(guò)樣品池，待基線穩(wěn)定后，在樣品表輸入樣品信息，按設(shè)定程序測(cè)樣，根據(jù)相同的保留時(shí)間來(lái)分析產(chǎn)物和底物的濃度。
[0038]4、搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)
I)在超凈工作臺(tái)上取保藏于試管斜面上的酵母菌一環(huán)，接入裝有10ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)16h，以此作為種子發(fā)酵液。
[0039]2)葡萄糖濃度的優(yōu)化
配置不同葡萄糖濃度(15、20、25、30、35、40%)的發(fā)酵培養(yǎng)基50ml于250ml三角瓶中，其它成分相同，包括1%酵母提取物，1%蛋白胨。以接種量5%接入已配置好的各培養(yǎng)基中，30°C、200rpm、培養(yǎng)4天后，發(fā)酵液1000r離心lOmin，利用TLC法和HPLC法檢測(cè)發(fā)酵液上清中的殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量。
[0040]3)接種量的優(yōu)化
以不同接種量(5、8、10、12、15%)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖濃度25%)中，30°C、200rpm、培養(yǎng)4天后，檢測(cè)發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上。[0041 ] 4)培養(yǎng)溫度的確定
以最佳接種量(10%)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖濃度25%)中，在不同培養(yǎng)溫度(25、28、30、33、37 °C )條件下，200rpm培養(yǎng)4天后，檢測(cè)發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上。
[0042]5 )培養(yǎng)時(shí)間的確定
以最佳接種量(10%)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖濃度25%)中，30°C、200rpm培養(yǎng)6天，每隔24h取樣1ml，檢測(cè)不同時(shí)期發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上。
[0043]6)搖床轉(zhuǎn)速的確定
以最佳接種量(10%)將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖濃度25%)中，在不同轉(zhuǎn)速(100、150、200、250rpm)下，30°C培養(yǎng)96h后，檢測(cè)發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上。
[0044]5、5L發(fā)酵罐試驗(yàn)
I)在超凈工作臺(tái)上取保藏于試管斜面上的酵母菌一環(huán)，接入裝有10ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)16h，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。
[0045]2)將處于對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有2L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，30°C、200rpm培養(yǎng)4_6天，整個(gè)生長(zhǎng)期容氧控制10% (通氣速率為0.5L/min)。
[0046]3)發(fā)酵結(jié)束后:葡萄糖殘量為:3.89 g/L、D_阿拉伯糖醇含量為:79.16 g/L、甘油含量為:9.43 g/L、乙醇含量為:3.21 g/L。該菌株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力較高，轉(zhuǎn)化率可達(dá) 40% ο
【權(quán)利要求】
1.魯氏接合酵母菌株JM-C46Zygosaccharomyces rouxi i JM-C46，保藏編號(hào)為:CCTCCNO: M 2014205。
2.權(quán)利要求1所述的魯氏接合酵母菌株的應(yīng)用，按照下述步驟進(jìn)行: 1)在超凈工作臺(tái)上取保藏于試管斜面上的酵母菌一環(huán)，接入裝有10ml發(fā) 酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)16h，以此作為種子發(fā)酵液； 2)葡萄糖濃度的優(yōu)化 配置葡萄糖濃度為15-40%的發(fā)酵培養(yǎng)基50ml于250ml三角瓶中，其它成分相同，包括質(zhì)量濃度為1%酵母提取物，質(zhì)量濃度為1%蛋白胨；以接種量5%接入已配置好的各培養(yǎng)基中，3(TC、200rpm、培養(yǎng)4天后，發(fā)酵液1000r離心1min ； 3)接種量的優(yōu)化 以體積比為5-15%接種量將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖質(zhì)量濃度為25%發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、200rpm、培養(yǎng) 4 天后； 4)培養(yǎng)溫度的確定 以體積比為10%接種量將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖質(zhì)量濃度為25%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度25-37°C條件下，200rpm培養(yǎng)4天后； 5)培養(yǎng)時(shí)間的確定 以體積比為10%接種量將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖質(zhì)量濃度為25%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C,200rpm培養(yǎng)6天，每隔24h取樣1ml，檢測(cè)不同時(shí)期發(fā)酵液上清中殘?zhí)橇亢虳-阿拉伯糖醇量的方法同上； 6)搖床轉(zhuǎn)速的確定 以體積比為10%接種量將種子發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入葡萄糖質(zhì)量濃度為25%發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)基中，在100-250rpm轉(zhuǎn)速下，30°C培養(yǎng)96h后， 7)5L發(fā)酵罐試驗(yàn) A.在超凈工作臺(tái)上取保藏于試管斜面上的酵母菌一環(huán)，接入裝有10ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30°C、200rpm培養(yǎng)16h，使菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期； B.將處于對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有2L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中； 接種量為10%，30°C、200rpm培養(yǎng)4_6天，整個(gè)生長(zhǎng)期容氧控制10%，通氣速率為0.5L/min ； C.發(fā)酵結(jié)束后:葡萄糖殘量為:3.89 g/L、D-阿拉伯糖醇含量為:79.16 g/L、甘油含量為:9.43 g/L、乙醇含量為:3.21 g/L ;該菌株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的能力較高，轉(zhuǎn)化率可達(dá)40%。
【文檔編號(hào)】C12N1/16GK104342377SQ201410337503
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】齊向輝, 王旭, 林靜, 朱靜斐, 羅艷, 王亮, 孫文敬 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)