一種乙醇積累減少的釀酒酵母基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乙醇積累減少的釀酒酵母基因工程菌及其應(yīng)用，屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。本發(fā)明在敲除PDC1的基礎(chǔ)上敲除ADH1基因，獲得pdc1adh1雙缺失株，通過測定酶活，缺失PDC1后，丙酮酸脫羧酶的酶活下降了57.1％，進一步缺失ADH1基因后，乙醇脫氫酶的酶活下降了38.2％。經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化后，pdc1adh1雙缺失株較對照菌株，乙醇產(chǎn)量下降了57.3％。本發(fā)明可以有效減少碳流的損失，為構(gòu)建工程酵母高效生產(chǎn)C4二元羧酸創(chuàng)造了條件，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價值和前景。
【專利說明】-種乙醇積累減少的釀酒酵母基因工程菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種乙醇積累減少的釀酒酵母基因工程菌及其應(yīng)用，屬于遺傳工程和 發(fā)酵工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作為一種真核模式微生物，因具有：遺傳 信息豐富，代謝改造操作方便；營養(yǎng)需求簡單，分離提取工藝成本低廉；在低pH條件下（甚 至pH〈3. 0)生長良好；能夠耐受高濃度的底物；被FDA認(rèn)證為GRAS (General Regarded As Safe)微生物，發(fā)酵產(chǎn)品具有安全性等優(yōu)點而成為發(fā)酵生產(chǎn)羧酸（乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延 胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等）的潛在最適微生物。然而，釀酒酵母在高濃度糖及通風(fēng) 的條件分批發(fā)酵產(chǎn)生大量的乙醇，對于以羧酸為目標(biāo)產(chǎn)物來說，乙醇的大量積累使得碳流 大量的損失，成為代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)羧酸面臨的一大難題。
[0003] 作為糖酵解的末端產(chǎn)物，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（Pyruvate dehydrogenase complex, Pdh)的作用下，丙酮酸經(jīng)脫氫轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進而參與TCA循 環(huán)。釀酒酵母的旁路代謝（Pyruvate dehydrogenase bypass, FOH bypass)也具有重要的 生理作用，包括：（1)促進NAD+的再生，維持胞內(nèi)氧化還原平衡；（2)合成胞質(zhì)乙酰輔酶A， 為合成細(xì)胞組成成分和氨基酸代謝提供前體物質(zhì)；（3)產(chǎn)生乙醇。因此，乙醇的產(chǎn)生導(dǎo)致了 碳代謝流及NADH輔因子的損失，從而嚴(yán)重影響了釀酒酵母對羧酸的積累效率。任何以羧酸 為目標(biāo)產(chǎn)物的釀酒酵母發(fā)酵工藝，都將面臨同樣一個問題：如何減少通往乙醇的碳代謝流， 從而減少碳流的損失？本發(fā)明通過基因工程手段構(gòu)建了一株乙醇產(chǎn)量大幅下降的釀酒酵 母工程菌，對于利用釀酒酵母生產(chǎn)羧酸具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種乙醇積累減少的釀酒酵母基因工程 菌，以減少釀酒酵母生產(chǎn)羧酸過程中乙醇的積累，為代謝工程改造釀酒酵母高效生產(chǎn)羧酸 打下基礎(chǔ)。
[0005] 所述工程菌是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，敲除乙醇途徑中的關(guān)鍵酶基因丙酮酸脫羧 酶基因 roci和乙醇脫氫酶基因 ADH1。
[0006] 所述丙酮酸脫羧酶基因 roci的核苷酸序列如NCBI Gene ID:850733所示。所述 乙醇脫氫酶基因 ADH1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:854068所示。
[0007] 所述工程菌優(yōu)選釀酒酵母CEN. PK2-1C為出發(fā)菌株，購自EUROSCARF (http: // web.uni-frankfurt.de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen.html);其基因型為：MATa ; ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3, 112 ;his3A 1 ;MAL2-8G ;SUC2。敲除丙酮酸脫羧酶基因 PDC1 和 乙醇脫氫酶基因 ADH1;所述丙酮酸脫羧酶基因 roci的核苷酸序列如NCBI Gene ID:850733 所示。所述乙醇脫氫酶基因 ADH1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:854068所示。
[0008] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供構(gòu)建所述釀酒酵母工程菌的的方法，以 PUG27質(zhì)粒為模板通過PCR方法擴增得到敲除盒roCl (1692bp)和ADH1 (1544bp)，轉(zhuǎn)化釀酒 酵母，敲除乙醇途徑中的關(guān)鍵酶基因丙酮酸脫羧酶基因 roci和乙醇脫氫酶基因 ADH1，篩選 驗證得到陽性轉(zhuǎn)化菌株。
[0009] 所述釀酒酵母優(yōu)選釀酒酵母CEN. PK2-1C。
[0010] 所述丙酮酸脫羧酶基因 roci的核苷酸序列如NCBI中Gene ID :850733所示。
[0011] 乙醇脫氫酶基因 ADH1的核苷酸序列如NCBI中Gene ID :854068所示。
[0012] 所述 pUG27 質(zhì)粒的構(gòu)建方法參見"Guldener U, HeckS, Fielder T, et al. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res, 1996,24(13):2519-2524" 和"Guoqiang Xu, Qiang Hua，et al. Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production. Yeast, 2012, 29:209-217"。
[0013] 所述PCR使用的引物為：
[0014] PDC1-F(5/ -3; ) ：GGCTCTTTCACTCTCCTTGCAATCAGATTTGGGTTTGTTCCCTTTCAGCTGA AGCTTCGTA CGC
[0015] PDC1-R(5， -3， ） ： ：TTATTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCAGTCAACTTAGCTTGTTCAACGCATA GGCCACTAGT GGATCTG
[0016] ADH1-F(5/ -3; ) ：CCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAGCA TACAATCAA CTATCTCATATACACAGCTGAAGCTTCGTACGC
[0017] ADH1-R(5/ -3; ) ：TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCTACCAACGATTTGACCCTTTTCCATC TTTTCGTAA ATTTCTGGCAAGGTAG-GCATAGGCCACTAGTGGATCTG
[0018] 本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)羧酸 的方法，能減少釀酒酵母副產(chǎn)物乙醇積累。
[0019] 所述羧酸包括乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、α -酮戊二酸等。
[0020] 所述方法優(yōu)選以下步驟：將30°C、220rpm下培養(yǎng)24h的基因工程菌種子以5%的 接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)60h。
[0021] 種子培養(yǎng)基為Yro培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
[0022] 發(fā)酵培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源1. 7g/L、（NH4)2S045g/L、葡萄糖20g/L，添加碳酸隹丐 5g/L。
[0023] 采用釀酒酵母CEN. PK2-1C為出發(fā)菌株時，發(fā)酵培養(yǎng)基中還需添加亮氨酸100mg/ L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼陡20mg/L。
[0024] 本發(fā)明通過一種簡單的方法構(gòu)建了一株釀酒酵母基因工程菌，該菌能夠大量減少 副產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生，使其濃度從5. 86±0. 21g/L降低到2. 50±0. 18g/L，較改造前下降了 57. 3%。該菌可用于進一步構(gòu)建羧酸高產(chǎn)菌株，對改善釀酒酵母在有機酸工業(yè)化生產(chǎn)中的 應(yīng)用和羧酸的工業(yè)化生產(chǎn)水平有重要意義和價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1 roci敲除盒，大小為1692bp。
[0026] 圖2 ADH1敲除盒，大小為1544bp。
[0027] 圖3丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶的酶活。（a)丙酮酸脫羧酶的活性；(b)乙醇脫氫 酶的活性。
[0028] 圖4 pdcl缺失株、pdcladhl雙缺失株和野生型菌株的發(fā)酵特性比較。代表野 生型菌株BY4743, ·代表pdcl缺失株，▲代表pdcladhl雙缺失株。（a)菌體生長，在波長 為600nm條件下測定吸光值；(b)殘?zhí)菨舛?，用HPLC檢測；（c)乙醇濃度，用HPLC檢測。

【具體實施方式】
[0029] 高效液相色譜測定乙醇、殘?zhí)呛康姆椒ǎ喊l(fā)酵液中乙醇和殘?zhí)呛康臏y定采用 高效液相色譜儀（HPLC)檢測。發(fā)酵液經(jīng)處理且上清液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后，利用 RID (示差折光檢測器）進行檢測，液相色譜方法如下：色譜柱：BI〇-RAD有機酸柱；柱溫： 35? ;流動相：0. 0275% (v/v)稀硫酸，經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾并除氣；流速：0. 6mL/min ;檢測 時間：25min ;進樣量：20μ L。
[0030] 生物量的測定方法（Bio-Rid核酸儀）：用0. 1Μ HC1稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，設(shè)定波長為 600nm，取200 μ L測定其吸光值。
[0031] 乙醇的測定方法（HPLC法）：高效液相色譜儀為美國Waters公司產(chǎn)品，型號為 1515,色譜柱為 Aminex HPX-87H column (Bio-Rad)。乙醇用 RID 檢測器。
[0032] 種子培養(yǎng)基組成：葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去離子水定容，pH自 然，高壓滅菌（115°C，20min)。
[0033] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成：無氨基酵母氮源3. 4g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分 別添加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼陡20mg/L。添加碳酸|丐5g/L, 裝液量為40mL/250mL。
[0034] 實施例1低產(chǎn)乙醇釀酒酵母工程菌的構(gòu)建
[0035] 在野生型基礎(chǔ)上敲除了丙酮酸脫羧酶基因 roci和乙醇脫氫酶基因 ADH1。
[0036] 1、菌株和質(zhì)粒
[0037] 釀酒酵母（S. cerevisiae)CEN. PK2-1C 購自歐洲EUR0SCARF(http://web· uni-frankfurt. de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen. html),其基因型為 MATa ;ura3_52 ; trpl-289;leu2-3，112;his3Al ;MAL2-8G;SUC2。敲除盒模板 pUG27 質(zhì)粒（包含 HIS3 標(biāo) 記基因）、Cre表達質(zhì)粒pSH47(用來標(biāo)記回收）的構(gòu)建方法參見文獻"Guldener U，Heck S, Fielder T, et al. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast[J]· Nucleic Acids Res,1996,24(13):2519-2524"和"Guoqiang Xu, Qiang Hua, et al. Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production. Yeast, 2012, 29:209-217，'。
[0038] 2、基因的敲除
[0039] 以pUG27質(zhì)粒為模板通過PCR方法擴增得到敲除盒H)C1和ADH1。以質(zhì)粒pUG27 為模版，通過PCR擴增，獲得部分序列與待敲除基因 H)C1編碼區(qū)上下游同源的DNA片段，其 核酸電泳圖如圖1泳道1所示。以質(zhì)粒PUG27為模版，通過PCR擴增，獲得部分序列與待敲 除基因 ADH1編碼區(qū)上下游同源的DNA片段，其核酸電泳圖如圖2泳道1所示。所用到的引 物序列如表1 :
[0040] 表1. roci和ADH1基因敲除所用到的引物
[0041]

【權(quán)利要求】
1. 一種乙醇積累減少的釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，將釀酒酵母乙醇途徑中的 關(guān)鍵酶基因丙酮酸脫羧酶基因 roci和乙醇脫氫酶基因 ADH1敲除后得到。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，以釀酒酵母CEN. PK2-1C 為出發(fā)菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的釀酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述丙酮酸脫羧酶基 因 roci的核苷酸序列如Gene ID :850733所示，乙醇脫氫酶基因 ADH1的核苷酸序列如Gene ID :854068 所示。
4. 一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述釀酒酵母基因工程菌的方法，其特征在于，敲除乙醇途徑 中的關(guān)鍵酶基因丙酮酸脫羧酶基因 roci和乙醇脫氫酶基因 ADH1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，以釀酒酵母CEN. PK2-1C為出發(fā)菌株，以 PUG27質(zhì)粒為模板通過PCR方法擴增得到敲除盒roci和敲除盒ADH1，轉(zhuǎn)化釀酒酵母，敲除 乙醇途徑中的關(guān)鍵酶基因丙酮酸脫羧酶基因 roci和乙醇脫氫酶基因 ADH1，篩選驗證得到 敲除了兩基因的菌株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸脫羧酶基因 roci的核苷酸序 列如Gene ID:850733所示，乙醇脫氫酶基因 ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR使用的引物為： PDC1-F(5/ -3/ ) ：GGCTCTTTCACTCTCCTTGCAATCAGATTTGGGTTTGTTCCCTTTCAGCTGAAGCT TCGTA CGC ； PDC1-R(5/ -3/ ) ： ：TTATTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCAGTCAACTTAGCTTGTTCAACGCATAGGCC ACTAGT GGATCTG ； ADH1-F(5/ -3/ ) ：CCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACAATATTTCAAGCTATACCAAGCATACA ATCAA CTATCTCATATACACAGCTGAAGCTTCGTACGC ； ADH1-R(5/ -3/ ) ：TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATCTACCAACGATTTGACCCTTTTCCATCTTTT CGTAA ATTTCTGGCAAGGTAG-GCATAGGCCACTAGTGGATCTG 〇
8. 權(quán)利要求1或2所述釀酒酵母基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)羧酸中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1或2所述釀酒酵母基因工程菌在構(gòu)建羧酸高產(chǎn)菌株中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/865GK104099258SQ201410340560
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】徐國強, 吳滿珍, 蔣伶活 申請人:江南大學(xué)