一種矮化小麥標(biāo)記基因的分子標(biāo)記及其引物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，公開一種矮化小麥標(biāo)記基因的分子標(biāo)記及其引物和應(yīng)用。本發(fā)明確定了小麥矮化基因Rht‐x的分子標(biāo)記GWM122、WMC296，兩者與Rht‐x的距離分別為4.7cM、5.5cM。同時，本發(fā)明還公開了兩個分子標(biāo)記引物對序列，通過該引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、多態(tài)性統(tǒng)計分析以及Joinmap4.0作圖軟件確定分子標(biāo)記的方法。上述分子標(biāo)記及其引物可以在分子水平上快速篩選出矮化基因，從而用于矮化小麥育種，簡便、快速，可大大提高育種效率。
【專利說明】一種矮化小麥標(biāo)記基因的分子標(biāo)記及其引物和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，涉及一種矮化小麥標(biāo)記基因的分子標(biāo)記及其引物和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)侨蛐缘闹匾Z食作物，全世界有35% - 40%的人以小麥為主食。株高是禾本科作物的重要農(nóng)藝性狀，其不僅影響了植株表型，還會影響作物產(chǎn)量。隨著小麥生產(chǎn)條件的不斷改善，小麥品種的倒伏仍是小麥減產(chǎn)的重要因素，因此，通過矮化育種提高小麥的單位面積產(chǎn)量就成了全球育種家們的研究熱點(diǎn)。
[0003]普通小麥(Triticum aestivum L.)有21對染色體,每對染色體包含兩條一樣的染色體，這 21 條染色體分別為 1A, IB, 1D，2A，2B，2D，3A，3B，3D，4A，4B，4D，5A，5B，5D，6A，6B，6D，7A，7B，7D，普通小麥常用AABBDD表示。
[0004]近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，通過分子標(biāo)記輔助育種，進(jìn)行小麥優(yōu)良性狀選育育種已進(jìn)行了較多研究，但主要集中于小麥抗病性選育工作中，如中國專利CN102618638A中獲得了小麥基因Xbarcl096、Xwmc310的特異性片段以此作為分子標(biāo)記選育小麥抗條銹病基因Yr50 ;中國專利CN101935654A中獲得小麥黃花葉病主效基因QTL的分子標(biāo)記Xwmc327 - 180,Xgwml54 - 105進(jìn)行小麥抗病品系選育。但少有報道通過分子標(biāo)記在分子水平上進(jìn)行矮化小麥選育工作。
[0005]目前，小麥中定名的矮桿基因已有34個(Ji, Y.，M.Miao, and X.Chen, Progresseson the molecular genetics of dwarf character in plants.Molecular PlantBreeding, 2006.14.)，分布于小麥染色體的不同位置，這些矮桿基因可以引入或聚合到高桿品種中，選育出矮化、高產(chǎn)品種。但傳統(tǒng)育種方法費(fèi)時、費(fèi)力、表型鑒定困難、育種效率低，通過分子標(biāo)記輔助選擇育種可以有效解決這一問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是確定一種經(jīng)過誘變的矮桿小麥連鎖遺傳圖譜，從而對該小麥矮桿基因進(jìn)行定位確定，尋找出與該基因緊密相連的分子標(biāo)記，可用于小麥矮化育種、矮化性狀的早期分子輔助選擇，以提高育種效率。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下方案:
[0008]獲得突變矮桿小麥即本發(fā)明所利用的對象，具體方法為:(I)用0.35%的EMS(甲基磺酸乙酯)處理南農(nóng)9918 ；⑵對叫代按單穗收獲；(3)播種M2代穗行，對其田間農(nóng)藝性狀進(jìn)行全生育期觀察，尋找矮桿突變體；(4)該突變體按單株收獲；(5)將此單株種植M3代株系，進(jìn)行表型鑒定，M3R株系突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳，命名為NM9。(6) M4R重復(fù)鑒定其表型，其矮桿突變性狀能穩(wěn)定遺傳，從而獲得該矮桿小麥，命名為NM9，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014.5.22，保藏號為CCTCC P201408。
[0009]確定該種矮桿小麥的矮化基因:通過利用矮化突變體NM9(早)和其野生型南農(nóng)9918( ? )雜交獲得F1,自交獲得F2分離群體，提取分離群體各單株的DNA，通過遺傳分析明確NM9矮桿小麥的矮化由一對部分隱性基因控制，命名為Rht - X。
[0010]小麥矮化基因Rht -X連鎖的分子標(biāo)記，選自分子標(biāo)記GWM122或WMC296中的任意一種；
[0011]用上游引物GWM122-F:SEQ ID N0.1,下游引物 GWM122-R: SEQ ID N0.2 對矮化小麥NM9基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條150bp的特異性片段為分子標(biāo)記GWM122，利用Joinmap4.0作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，測得該標(biāo)記與矮化基因Rht-χ距離為4.7cM ；
[0012]或用上游引物WMC296-F:SEQ ID N0.3，下游引物 WMC296-R:SEQ ID N0.4 對矮化小麥NM9基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條170bp特異性片段為分子標(biāo)記WMC296，利用Joinmap4.0作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，測得該標(biāo)記與矮化基因Rht-χ距離為5.5cM。
[0013]本發(fā)明所述的矮化基因Rht -X連鎖的分子標(biāo)記在小麥種質(zhì)資源中矮化基因Rht - X鑒定中的應(yīng)用，其中Rht - X位于小麥2A染色體GWM122和GWM71之間，利用分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物對小麥矮化突變體NM9或其衍生品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，如果能夠擴(kuò)增到所述分子標(biāo)記對應(yīng)的目標(biāo)條帶，則說明待鑒定小麥品種中含有矮化基因Rht - X，反之，則不含該基因；所述的小麥矮化突變體NM9衍生品種是指以小麥矮化突變體NM9為親本，通過雜交或遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種。
[0014]本發(fā)明所述的矮化基因Rht -X連鎖的分子標(biāo)記在篩選矮化小麥中的應(yīng)用，利用分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物對小麥矮化突變體NM9或其衍生品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，通過判斷能否擴(kuò)增到所述分子標(biāo)記對應(yīng)的目標(biāo)條帶，預(yù)測待篩選品種是否屬于矮化小麥； 所述的小麥矮化突變體NM9衍生品種是指以小麥矮化突變體NM9為親本，通過雜交或遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種。
[0015]用于擴(kuò)增所述的分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物，分子標(biāo)記GWM122引物如下:GWM122 - F:5' GGGTGGGAGAAAGGAGATG3' (SEQ ID N0.1)；
[0016]GWM122 - R:5，AAACCATCCTCCATCCTGG3，(SEQ ID N0.2)。
[0017]分子標(biāo)記WMC296引物如下:
[0018]WMC296 - F:5，GAATCTCATCTTCCCTTGCCAC3，(SEQ ID N0.3)；
[0019]WMC296 - R:5’ATGGAGGGGTATAAAGACAGCG3’ (SEQ ID N0.4)。
[0020]本發(fā)明所述的分子標(biāo)記引物在克隆小麥矮化基因Rht - X中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明所述的分子標(biāo)記引物在鑒定小麥矮化基因Rht-X中的應(yīng)用，其特征在于利用分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物對小麥矮化突變體NM9或其衍生品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，如果能夠擴(kuò)增到所述分子標(biāo)記對應(yīng)的目標(biāo)條帶，則說明待鑒定小麥品種中含有矮化基因Rht - X，反之，則不含該基因；所述的小麥矮化突變體NM9衍生品種是指以小麥矮化突變體NM9為親本，通過雜交或遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種。
[0022]本發(fā)明所述的分子標(biāo)記引物在篩選矮化小麥中的應(yīng)用，利用分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物對小麥矮化突變體NM9或其衍生品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，通過判斷能否擴(kuò)增到所述分子標(biāo)記對應(yīng)的目標(biāo)條帶，預(yù)測帶篩選品種是否屬于矮化小麥；所述的小麥矮化突變體NM9衍生品種是指以小麥矮化突變體NM9為親本，通過雜交或遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種。
[0023]本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的確定方法，包括如下步驟:
[0024](I)利用矮化突變體NM9和高桿品種蘇麥3號雜交獲得F2后代單株；
[0025](2)取矮化突變體NM9、高桿品種蘇麥3號以及步驟⑴中雜交后代小麥樣品，用CTAB法提取各組小麥樣品基因組DNA ；
[0026](3)利用其他圖譜中SSR和EST標(biāo)記，以步驟2)中提取的小麥基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對NM9和蘇麥3號及其雜交后代基因組DNA進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型，構(gòu)建NM9矮化小麥的遺傳連鎖圖譜，確定與矮化基因緊密連鎖分子標(biāo)記。
[0027]其中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中PCR試劑組成為:含20 -1OOngDNA的I μ L DNA模板，
1.0 μ LlO X PCR buffer, 0.8μ L MgCl2,0.8μ L dNTP，左右引物各 0.2 μ L，0.15 μ L Taq DNApolymerase, 4.85 μ L ddH20 ;PCR 程序為:94°C預(yù)變性 3min ;然后 94°C變性 30s,55°C復(fù)性50s，72°C延伸lmin，36個循環(huán)；最后72°C延伸1min ;10°C保存；PCR擴(kuò)增反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比19:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測。
[0028]本發(fā)明的有益效果為:
[0029](I)本發(fā)明不受環(huán)境條件影響，通過獲得的與矮化基因Rht - X連鎖的分子標(biāo)記GWM122.WMC296預(yù)測小麥矮化性，在已知的分子標(biāo)記中GWM122與Rht - x最為緊密，距離僅為4.7cM，為準(zhǔn)確鑒定矮化基因Rht -X從而篩選出矮桿品系提供可能，這將大大提高產(chǎn)矮化小麥育種效率。
[0030](2)矮化基因Rht -X為一對部分隱性基因控制，而位于小麥2A染色體上的分子標(biāo)記GWM122和WMC296與該矮桿基因緊密連鎖，從而可以在篩選出該矮桿基因基礎(chǔ)上，通過簡單雜交和農(nóng)藝性狀觀察選擇，便可在低世代選育出穩(wěn)定的矮化小麥品系，這可以大大減少育種中操作過程，降低育種成本。
[0031](3)本發(fā)明另一個貢獻(xiàn)是提供了該矮化小麥的連鎖遺傳圖譜，從而為接下來該矮化基因Rht - X精細(xì)定位、克隆研究提供方便。此外，本發(fā)明提供的2個最為緊密連鎖遺傳的分子標(biāo)記即GWM122、WMC296均為SSR標(biāo)記，較之其他類型使用更為方便、快速。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1NM9及其野生型表型；
[0033]圖2為2個共顯性SSR標(biāo)記WMC296，GWM122對NM9 X蘇麥3號F2代部分單株的擴(kuò)增結(jié)果；
[0034]由圖2可見，SSR共顯性標(biāo)記WMC296、GWM122在矮桿親本NM9 (Pd)、矮桿DNA混合池(Bd)及純合矮桿單株(D)中均能分別擴(kuò)增出一條170bp、150bp的PCR特異條帶。而WMC296、GWM122在高桿親本蘇麥3號(Pt)、高桿DNA混合池(Bt)及純合高桿單株⑴中分別擴(kuò)增出了 180bP和170bP的特異條帶，未能擴(kuò)增出150bp的特異條帶。WMC296、GWM122在重組體中擴(kuò)增出雜合帶型。以上結(jié)果表明，SSR共顯性標(biāo)記WMC296、GWM122與Rht - x緊密連鎖。
[0035]M:Marker ；Pd:矮桿親本NM9 ；Pt:高桿親本蘇麥3號；Bd:矮桿DNA池；Bt:高桿DNA池；D:純合矮桿株；T:純合高桿株；*:重組體基因型。
[0036]圖3在2Α染色體上Rht - χ的圖譜位置；
[0037]圖42個共顯性SSR標(biāo)記WMC296，GWM122在21份普通小麥中國春缺體-四體材料上的擴(kuò)增結(jié)果；
[0038]I, Marker ;2，水對照；3，中國春；4，NM9 ；5,蘇麥 3 號；6，NlATlD ;7，NlBTlD ；8，NlDTlB ;9，N2AT2D ；10, N2BT2D ;11，N2DT2A ;12，N3AT3D ;13，N3B/T3D ;14，N3DT3B ；15，N4AT4D ；16, N4BT4D ；17, N4DT4B ；18, N5AT5D ；19, N5BT5A ；20, N5DT5B ；21, N6AT6D ；22，N6BT6A ;23，N6DT6B ;24，N7AT7D ;25，N7BT7D ;26，N7DT7B.
[0039]圖5共顯性SSR標(biāo)記GWM122在含不同小麥矮桿基因的小麥品種DNA中的擴(kuò)增；
[0040]M =Maker ；1:NM9 ；2:蘇麥3號(Rht8) ；3:中國春(不含小麥矮桿基因);4:鄭9405 (Rht - Bib, Rht - Dlb) ；5:煙農(nóng) 19 (Rht - Dlb) ；6:矮蘇麥 3 號(Rht - Blc) ；7:揚(yáng)麥 5 號(Rht8) ;8:西農(nóng) 04(Rht - Die) ;9:煙農(nóng) 23 (Rht - Bib, Rht - Dlb) ；10:XN0004 (Rht21)。
[0041]生物樣品保藏信息
[0042]小麥種子NM9 (Triticum aestivum NM9)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014.5.22，保藏號為CCTCC P201408，保藏地址為中國武漢大學(xué)。

【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細(xì)描述。
[0044]實施例1
[0045]1.矮化小麥獲得:
[0046]2007年，于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所用0.35%的EMS (甲基磺酸乙酯)處理南農(nóng)9918，2008年M1代按單穗收獲。2008年11月播種M2代穗行，2009年對其田間農(nóng)藝性狀進(jìn)行全生育期觀察,發(fā)現(xiàn)一個矮桿突變體,將該突變體按單株收獲。2009年將此單株種植M3代株系，并于2010年進(jìn)行表型鑒定，發(fā)現(xiàn)M3代株系突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳，命名為NM9，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2014.5.22，保藏號為CCTCC P201408。
[0047]2.NM9X南農(nóng)9918和NM9X蘇麥3號雜交后代群體構(gòu)建及表型鑒定:
[0048](I)雜交后代群體構(gòu)建:通過利用矮化突變體NM9 (早)和其野生型南農(nóng)9918 (古)雜交獲得F1,自交獲得匕，每個F2單株自交獲得F2:3株系，用于矮桿基因的遺傳分析。通過利用矮化突變體NM9(早)和高桿品種蘇麥3號(? )雜交獲得F1,自交獲得F2，每個F2單株自交獲得F2:3株系，用于矮桿基因的遺傳圖譜的構(gòu)建。
[0049](2)表型鑒定:用于遺傳分析的材料于2010 - 2011年種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦農(nóng)場塑料大棚中。用于遺傳圖譜構(gòu)建的材料于2011 - 2012年種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓試驗站。播種期為每年的11月5至10日，行長1.2m，行距20cm，每行播10粒，二葉一心期間苗，每行保留長勢一致的6株(株距16cm)。塑料大棚在冬季氣溫較低時，棚內(nèi)外環(huán)境隔離，以提升棚內(nèi)的溫度，提高材料的生長速度；在氣溫較高的3月中旬至成熟，打開大棚兩側(cè)通風(fēng)降溫。所有種植于塑料大棚的F2、F2:3均正常成熟。在成株期測量小麥株高，以從植株基部到穗頂(不包括芒)的距離為株高。
[0050]3.矮化基因確定
[0051]利用矮化突變體NM9(早)和其野生型南農(nóng)9918( ^ )雜交獲得F1,自交獲得F2分離群體，用于遺傳分析，明確NM9的矮化由一對部分隱性基因控制，命名為Rht - X。
[0052]4.標(biāo)記多態(tài)性篩選
[0053]利用CTAB法提取親本NM9、蘇麥3號以及矮化突變體NM9 (早)和高桿品種蘇麥3號(? )雜交獲得F2后代單株的DNA，以上述提取的DNA模板，用GrainGenes2.0網(wǎng)站上公布的小麥 SSR標(biāo)記(http://wheat, pw.usda.gov/GG2/index, shtml)進(jìn)行引物設(shè)計，利用設(shè)計好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對NM9、蘇麥3號及其雜交后代基因組DNA進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型，篩選可能的標(biāo)記分子。
[0054]其中引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
[0055]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系:PCR試劑組成為:含20 -1OOngDNA的I μ L DNA模板，LOyLlOXPCR buffer,0.8μ L MgCl2,0.8μ L dNTP，上下游引物各 0.2 μ L，0.15 μ L TaqDNA polymerase, 4.85 μ L ddH20 ;PCR 程序為:94°C預(yù)變性 3min ;然后 94°C變性 30s, 55°C復(fù)性50s，72°C延伸lmin，36個循環(huán)；最后72°C延伸1min ;10°C保存；PCR擴(kuò)增反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比19:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測。
[0056]5.分子標(biāo)記獲得
[0057]根據(jù)F2:3家系的鑒定結(jié)果，從F2代分離群體中選取10株矮桿單株和10株株高正常的單株DNA，等量混合建立株高矮化型池和株高正常型池，用混合分組分析法(bulkedsegregant analysis, BSA)對多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行篩選,分析其與株高矮化性狀之間的關(guān)系。如果某標(biāo)記在高桿池電泳結(jié)果與其高桿親本一致，矮桿池電泳結(jié)果與其矮桿親本一致，則說明該標(biāo)記可能與矮桿基因緊密連鎖，最終獲得連鎖遺傳的分子標(biāo)記GWM122和GWM71。
[0058]6.緊密連鎖分子標(biāo)記驗證
[0059]將與矮桿基因連鎖的標(biāo)記分子在利用矮化突變體NM9 (早)和高桿品種蘇麥3號(古)雜交獲得F1,自交獲得&分離群體中進(jìn)行連鎖分析，利用Joinmap4.0作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得NM9矮化小麥的遺傳連鎖圖譜。最終確定矮化基因Rht -χ位于小麥2A染色體GWM122和GWM71之間，與GWM122的遺傳距離最近為4.7cM,與GWM71的遺傳距離為26.3cM。
[0060]實施例2
[0061]利用中國春及其21個缺體四體系對Rht -χ連鎖標(biāo)記WMC296、GWM122進(jìn)行缺體四體定位。21份普通小麥中國春缺體-四體材料(N1AT1B, N1BT1A, N1DT1A, N2AT2D, N2BT2D, N2DT2A, N3AT3D, N3BT3D, N3DT3B, N4AT4D, N4BT4D, N4DT4B, N5AT5D, N5BT5A, N5DT5B, N6AT6D, N6BT6D)，從美國堪薩斯州立大學(xué)引進(jìn)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所保存。
[0062]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系:PCR試劑組成為:含20 -1OOngDNA的I μ L DNA模板，LOyLlOXPCR buffer,0.8μ L MgC12,0.8μ L dNTP，上下游引物各 0.2 μ L，0.15 μ L TaqDNA polymerase, 4.85 μ L ddH20 ;PCR 程序為:94°C預(yù)變性 3min ;然后 94°C變性 30s, 55°C復(fù)性45s，72°C延伸50s，36個循環(huán)；最后72°C延伸1min ;10°C保存；PCR擴(kuò)增反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測。
[0063]由圖4可見，SSR標(biāo)記WMC296、GWM122除了在N2AT2D中未能擴(kuò)增出特異條帶外，其在作圖群體親本NM9、蘇麥3號、中國春及其他20個缺體四體系均能擴(kuò)增出特異條帶，結(jié)果表明標(biāo)記WMC296、GWM122及與其緊密連鎖的Rht - χ定位于小麥2Α染色體上。
[0064]實施例3
[0065]利用與Rht - χ緊密連鎖的SSR標(biāo)記GWM122在含有不同Rht基因的小麥材料NM9、蘇麥3號(Rht8)、中國春(不含小麥矮桿基因)、鄭9405 (Rht - Bib, Rht - Dlb)、煙農(nóng) 19 (Rht - Dlb)、矮蘇麥 3 號(Rht - Blc)、揚(yáng)麥 5 號(Rht8)、西農(nóng) 04 (Rht - Dlc)、煙農(nóng)23 (Rht - Bib, Rht - Dlb)、XN0004 (Rht21)的 DNA 中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
[0066]PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系:PCR試劑組成為:含20 -1OOngDNA的I μ L DNA模板，LOyLlOXPCR buffer,0.8μ L MgC12,0.8μ L dNTP，上下游引物各 0.2 μ L，0.15 μ L TaqDNA polymerase, 4.85 μ L ddH20 ;PCR 程序為:94°C預(yù)變性 3min ;然后 94°C變性 30s, 55°C復(fù)性45s，72°C延伸50s，36個循環(huán)；最后72°C延伸1min ;10°C保存；PCR擴(kuò)增反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比19:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測。
[0067]由圖5可見，與Rht - χ緊密連鎖的SSR標(biāo)記GWMl22在含有Rht - χ的小麥矮桿材料ΝΜ9中能擴(kuò)增出150bp的特異條帶。在不含小麥矮桿基因的中國春，及含不同已知小麥矮桿基因的材料蘇麥3號(Rht8)、鄭9405 (Rht - Bib, Rht - Dlb)、煙農(nóng)19 (Rht - Dlb)、矮蘇麥 3 號(Rht - Blc)、西農(nóng) 04 (Rht - Dlc)、煙農(nóng) 23 (Rht - Bib, Rht - Dlb)、XN0004 (Rht21)中擴(kuò)增出了 160bp的片段，在揚(yáng)麥5號(Rht8)中擴(kuò)增出了 130bp的片段。GWM122在這些不含Rht -χ的小麥品種中均不能擴(kuò)增出150bp的特異條帶。以上結(jié)果表明，SSR標(biāo)記GWM122在含有Rht - χ的小麥材料中能擴(kuò)增出150bp的特異條帶,可應(yīng)用于對Rht - χ分子標(biāo)記輔助選擇育種中，加快育種進(jìn)程。
[0068]可以知道，上述實施例僅為了說明發(fā)明原理而采用的示例性實施方式，然而本發(fā)明不僅限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實質(zhì)情況下，可以做出各種改進(jìn)和變更，這些改進(jìn)和變更也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.小麥矮化基因Rht-X連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于:選自分子標(biāo)記GWM122或WMC296中的任意一種； 用上游引物GWM122-F:SEQ ID N0.1,下游引物GWM122-R:SEQ ID N0.2對矮化小麥NM9基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條150bp的特異性片段為分子標(biāo)記GWM122，利用Joinmap4.0作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，測得該標(biāo)記與矮化基因Rht-χ距離為4.7cM ； 或用上游引物WMC296-F:SEQ ID N0.3，下游引物WMC296-R:SEQ ID N0.4對矮化小麥NM9基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條170bp特異性片段為分子標(biāo)記WMC296，利用Joinmap4.0作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，測得該標(biāo)記與矮化基因Rht-χ距離為5.5cM。
2.權(quán)利要求1所述的矮化基因Rht-x連鎖的分子標(biāo)記在小麥種質(zhì)資源中矮化基因Rht-x鑒定中的應(yīng)用，其中Rht-x位于小麥2A染色體GWM122和GWM71之間，其特征在于利用分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物對小麥矮化突變體NM9或其衍生品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，如果能夠擴(kuò)增到所述分子標(biāo)記對應(yīng)的目標(biāo)條帶，則說明待鑒定小麥品種中含有矮化基因Rht-x，反之，則不含該基因；所述的小麥矮化突變體NM9衍生品種是指以小麥矮化突變體NM9為親本，通過雜交或遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種。
3.權(quán)利要求1所述的矮化基因Rht-x連鎖的分子標(biāo)記在篩選矮化小麥中的應(yīng)用，其特征在于:利用分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物對小麥矮化突變體NM9或其衍生品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，通過判斷能否擴(kuò)增到所述分子標(biāo)記對應(yīng)的目標(biāo)條帶，預(yù)測待篩選品種是否屬于矮化小麥；所述的小麥矮化突變體NM9衍生品種是指以小麥矮化突變體NM9為親本，通過雜交或遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種。
4.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物，其特征在于:分子標(biāo)記 GWMl22 上游引物 GW Ml22-F:SEQ ID N0.1,下游引物 GWM122-R: SEQ ID N0.2 ;分子標(biāo)記 WMC296 上游引物 WMC296-F:SEQ ID N0.3，下游引物 WMC296-R:SEQ ID N0.4。
5.權(quán)利要求4所述的分子標(biāo)記引物在克隆小麥矮化基因Rht-x中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述的分子標(biāo)記引物在鑒定小麥矮化基因Rht-x中的應(yīng)用，其特征在于利用分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物對小麥矮化突變體NM9或其衍生品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，如果能夠擴(kuò)增到所述分子標(biāo)記對應(yīng)的目標(biāo)條帶，則說明待鑒定小麥品種中含有矮化基因Rht-x，反之，則不含該基因；所述的小麥矮化突變體NM9衍生品種是指以小麥矮化突變體NM9為親本，通過雜交或遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種。
7.權(quán)利要求4所述的分子標(biāo)記引物在篩選矮化小麥中的應(yīng)用，其特征在于:利用分子標(biāo)記GWM122或WMC296的引物對小麥矮化突變體NM9或其衍生品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離，通過判斷能否擴(kuò)增到所述分子標(biāo)記對應(yīng)的目標(biāo)條帶，預(yù)測待篩選品種是否屬于矮化小麥；所述的小麥矮化突變體NM9衍生品種是指以小麥矮化突變體NM9為親本，通過雜交或遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的小麥品種。
8.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的確定方法，其特征在于包括如下步驟: (1)利用矮化突變體NM9和高桿品種蘇麥3號雜交獲得F2后代單株； (2)取矮化突變體NM9、高桿品種蘇麥3號以及步驟(1)中雜交后代小麥樣品，用CTAB法提取各組小麥樣品基因組DNA ； (3)利用其他圖譜中SSR和PLUG標(biāo)記，以步驟2)中提取的小麥基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對NM9和蘇麥3號及其雜交后代基因組DNA進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計分析在親本間具有多態(tài)性的位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型，構(gòu)建NM9矮化小麥的遺傳連鎖圖譜，確定與矮化基因緊密連鎖分子標(biāo)記。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的確定方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中PCR試劑組成為:含20-100叩0嫩的1“1^ DNA 模板，1.0 μ LlO X PCR buffer,0.8μ L MgCl2,0.8μ L dNTP,上、下游引物各0.2 μ L，0.15 μ L Taq DNA聚合酶，4.85 μ L ddH20 ;PCR程序為:94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性30s，55°C復(fù)性50s，72°C延伸lmin，36個循環(huán)；最后72°C延伸1min ；10°C保存；PCR擴(kuò)增反應(yīng)后擴(kuò)增產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比19:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離 ，再用銀染法檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073488SQ201410340571
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】曹愛忠, 盧媛, 邢莉萍, 陳佩度, 王秀娥, 張瑞奇, 王海燕, 張守忠, 肖進(jìn) 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)