一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法
【專利摘要】一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，屬于生物制劑檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。其包括：根據(jù)茶毛蟲核型多角體病毒的A13-1基因設(shè)計(jì)引物；從感染茶毛蟲核型多角體病毒的蟲體中提取茶毛蟲核型多角體病毒基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增得到A13-1基因片段；制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并測定其濃度；熒光定量PCR反應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣品檢測。本發(fā)明突破了傳統(tǒng)的生物測定技術(shù)，解決了茶毛蟲核型多角體病毒的準(zhǔn)確定性問題。與傳統(tǒng)生物測定方法相比，本發(fā)明毒力指標(biāo)檢測更為精細(xì)，毒力評價周期大大縮短，可廣泛用于病毒制劑質(zhì)量的評定，規(guī)范茶毛蟲核型多角體病毒的生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】-種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制劑檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量 檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 茶毛蟲核型多角體病毒nuclear polyhedrosis ν?η?8，/--/75·ΝΡν)屬桿狀病毒科，核型多角體病毒屬。是茶毛蟲的病原性天敵，通 過幼蟲取食后在蟲體內(nèi)迅速增殖，致使其感染發(fā)病而死亡。目前這種病毒已可以通過室內(nèi) 大量增殖，經(jīng)配制形成產(chǎn)品，進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，近年來，及//zsNPV作為一種高效病毒殺蟲劑在 各省茶區(qū)廣泛推廣使用，對茶毛蟲進(jìn)行有效的生物防治，產(chǎn)生了良好的社會、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效 益。因?yàn)檫@種病毒產(chǎn)品不同于一般的農(nóng)藥，它是一個活體，目前只有通過生物測定的方法進(jìn) 行檢測。即用病毒產(chǎn)品喂飼茶毛蟲幼蟲，觀察其是否發(fā)病來確定，因?yàn)椴《臼菍Ｒ坏?，茶?蟲病毒只能感染茶毛蟲幼蟲。這種傳統(tǒng)的生物測定的方法使得目前在及//^NPV病毒制劑的 生產(chǎn)、使用過程中存在毒力指標(biāo)檢測粗放、評價周期過長、制劑質(zhì)量難以有效監(jiān)控等問題。 為了快速有效檢測出生物殺蟲劑中的含量，建立靈敏、特異而又簡易的病毒檢測 方法至關(guān)重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種茶毛蟲核型多角體病 毒的定量檢測方法的技術(shù)方案。
[0004] 所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 根據(jù)茶毛蟲核型多角體病毒的J13-1基因設(shè)計(jì)引物及//zsNPV J13-1 F和引物 及//zsNPV J13-1 R，所述的引物及//zsNPV J13-1 F核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述的 引物及//zsNPV J13-1 R核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示； 2) 從感染茶毛蟲核型多角體病毒的蟲尸中提取茶毛蟲核型多角體病毒基因組DNA，獲 取目的片段，以目的片段為模板，用步驟1)中設(shè)計(jì)的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到J13-1基 因片段； 3) 將步驟2)擴(kuò)增獲得的J13-1基因片段與載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中， 挑單克隆菌株，搖菌，再采用PCR鑒定單菌落質(zhì)粒DNA，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序并測 定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，保存于_20°C冰箱中，備用，所述的重組質(zhì)粒核苷酸序列如SEQ ID N0: 3所示； 4) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋成不同濃度的模板，進(jìn)行熒光定量PCR，以其模板數(shù)的對數(shù) 值為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，建立檢測茶毛蟲核型多角體病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 5) 提取待測樣品基因組，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)步驟4)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出 待測樣品的拷貝數(shù)，確定待測樣品的濃度。
[0005] 1所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述的步驟2) 中PCR擴(kuò)增的程序：先94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性30s，60°C變性45s ;循環(huán)35次，最 后延伸72°C延伸7min。
[0006] 所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述的步驟4) 中熒光定量 PCR 采用 20ul 體系：質(zhì)粒模板 2μ?，SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 1〇μ?，R0X Reference Dyell 0·4μ?，引物及//7SNPVJ13-1 F 和引物及//7SNPVJ13-1 R 各 0·8μ?，加滅 菌雙蒸水6ul至2〇μ? ;反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 30s ;95°C 5s，60°C 34s ;共40個循環(huán)，陰性對照 使用滅菌雙蒸水。
[0007] 所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述的步驟4)中 梯度為 1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103 和 1. 0X102 拷貝 /ML。
[0008] 上述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，設(shè)計(jì)合理，突破了傳統(tǒng)的生 物測定技術(shù)，解決了茶毛蟲核型多角體病毒的準(zhǔn)確定性問題。與傳統(tǒng)生物測定方法相比，本 發(fā)明毒力指標(biāo)檢測更為精細(xì)，毒力評價周期大大縮短，可 廣泛用于病毒制劑質(zhì)量的評定，規(guī)范茶毛蟲核型多角體病毒的生產(chǎn)應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為J13-1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖； 圖 1 中：M-DL 2000 Marker ; 2- J13-1 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物； 圖2為重組質(zhì)粒pGEMTeasy- A3-1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖； 圖 2 中：M-DL 2000 Marker ; 2-重組質(zhì)粒 pGEMTeasy- A3-1PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物； 圖3為及識sNPV J13-1基因擴(kuò)增的熔解曲線圖； 圖4為及識sNPV PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線圖； 圖5為J13-1基因不同稀釋梯度的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0011] 實(shí)施例1 :及/ASNPV病毒樣品的獲得及其基因組DNA的提取 以茶毛蟲核型多角體病毒感染茶毛蟲幼蟲，收集蟲尸，以PBS溶液作緩沖液反復(fù)勻漿， 緩沖液體積與蟲尸體積比為10:1，l〇〇〇〇g離心l〇min，重復(fù)3次，上清液即為病毒粗提液； 病毒粗提液經(jīng)35000g離心2小時，沉淀即為經(jīng)純化的病毒粒子；用1 XPBS反復(fù)洗滌純化的 病毒粒子，至乳白色為止；用 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0 試劑盒進(jìn)行茶毛蟲核型多角體病毒基因組的提取。步驟如下：1)病毒的裂解①取200μ 1的 病毒原液。②加入 200 μ 1 的 Buffer VGB、20 μ 1 的 Proteinase Κ 和 1. 0 μ 1 的 Carrier RNA，充分混勻于56°C水浴溫浴10分鐘。③離心，取上清；向上清中加入200 μ 1無水乙醇， 充分吸打混勻。2)將Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中， 12.000 rpm離心2分鐘，棄濾液。3)將500μ1的Buffer RWA加入至Spin Column中， 12.000 rpm離心1分鐘，棄濾液。4)將700μ1的Buffer RWB加入至Spin Column中， 12.000 rpm離心1分鐘，棄濾液。注）請確認(rèn)Buffer RWB中已經(jīng)加入了指定體積的100% 乙醇。請沿Spin Column管壁四周加入Buffer RWB，這樣有助于完全沖洗沾附于管壁上的 鹽份。5)重復(fù)操作步驟 4)。6)將 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12, 000 rpm 離心 2 分鐘。7)將 Spin Column 安置于新的 1. 5ml RNase free collection tube 上，在 Spin Column膜的中央處加入30?50μ 1的RNase free dH20,室溫靜置5分鐘。8) 12，000 rpm離心2分鐘洗脫DNA/RNA。如需獲得更大收量，可將離下液重新加入到Spin (：〇11111111膜的中央或再加入30?5(^1的8似86^66(1!120，室溫靜置5分鐘后，12,000卬111 離心2分鐘洗脫DNA。4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0012] 實(shí)施例2 :目的片段PCR擴(kuò)增 根據(jù)及//zsNPV基因組序列（NC_012639. 1)的J13-1基因，采用DNAStar軟件，設(shè)計(jì) 了一對特異性引物及//^NPV X13-1 F和引物及識sNPV X13-1R，由上海生工生物技術(shù)有限 公司合成，引物序列分別為：5'_ GTCCCATGAAACCCAATCGC -3'（如SEQ ID N0:1所示）和 5'-CGATACTCGTTGTTGCTGCC -3'（如 SEQ ID N0:2 所示），擴(kuò)增 J13-1，PCR 反應(yīng)采用 25μ? 體 系（模板 2PL，10Xbuffer 2. 5PL，dNTP 2μ?，正反引物各(λ 5PL，Tag 酶(λ 25μ?，加滅菌雙蒸 水至25PL)，PCR擴(kuò)增使用兩步法，程序如下：先94°C預(yù)變性3min ;然后94°C 30s，62°C45s ; 循環(huán)35次，最后72°C延伸7min。取PCR產(chǎn)物10ul于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果見 圖1，與預(yù)計(jì)大小相一致。最后，用瓊脂糖凝膠DNA試劑盒純化回收擴(kuò)增片段，按說明書操作 進(jìn)行。
[0013] 實(shí)施例3 :質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)的制備及其濃度測定 將實(shí)施例2中擴(kuò)增的J13-1基因片段與載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中，挑 單克隆菌株，搖菌。使用試劑盒抽提單菌落質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定為陽性的重組 質(zhì)粒送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。與參考序列進(jìn)行比較，確認(rèn)構(gòu)建結(jié)果，構(gòu)建完畢 后用紫外分光光度計(jì)測定其濃度，將1KL陽性質(zhì)粒稀釋100倍測定其0D 26(I和0D28(I值，計(jì)算 重組質(zhì)粒濃度及0D26(i/0D 28(i比例，將重組質(zhì)粒稀釋至1(Γ1(Ι拷貝/>L，保存于-20°C冰箱中。
[0014] 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果見圖2,片段大小為130bp，與預(yù)期結(jié)果相符。重組質(zhì)粒的 測序結(jié)果如下： 5'-GTCCCATGAAACCCAATCGCTGTTATCGGTTTTTGGCTCAGCACGCTCTTCGTTGTGATCACGATTACGT TCCGCACGAAATAATTAGAATCGTTGAACCTTCGTACGTGGGCAGCAACAACGAGTATCG -3'（如 SEQ ID N0: 3所示)。
[0015] 實(shí)施例4 :突光定量PCR反應(yīng) 采用 2〇μ? 體系：模板 2μ?，SYBR Premix Ex Taq? (2 X) 1〇μ?，R0X Reference Dye II 0. 4μ?，引物及//zsNPV J13-1 F和引物及//zsNPV J13-1 R各0. 8μ?，加滅菌雙蒸水至2〇μ?。反 應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 30s;95°C 5s，60°C 34s;共40個循環(huán)，陰性對照使用滅菌雙蒸水。熒光定 量實(shí)驗(yàn)中的 SYBR Premix Ex Taq (2X)和 R0X Reference Dye II均為 Takara 公司產(chǎn)品， 熒光定量PCR儀型號為ABI PRISM 7500。
[0016] 實(shí)施例5 :標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及其靈敏性 將含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍系列稀釋成1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、 1. ΟΧ ΙΟ4、1. ΟΧ ΙΟ3、1. ΟΧ 102拷貝/>L的模板，將各濃度標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定 量PCR熔解曲線分析，結(jié)果見圖3,與預(yù)期完全相符，均為單峰，無非特異性擴(kuò)增，說明反應(yīng) 特異，表明該方法有良好的特異性。
[0017] 將以上各濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR，擴(kuò)增的熒光曲線見圖4,表明該方 法檢測靈敏度可達(dá)到1. οχ 1〇2拷貝/μ?。反應(yīng)結(jié)束后取PCR反應(yīng)液，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行鑒定。
[0018] 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以其實(shí)模板數(shù)的對數(shù)為X軸，CT值為Y 軸做回歸曲線，建立檢測及/AsNPV的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5,斜率為-3. 081，截距為 36. 534, R2=0. 9983,從而可以得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y = -3. 081x + 36. 534。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，可 以求出待測樣品的拷貝數(shù)。
[0019] 實(shí)施例6 :FQ_PCR重復(fù)性 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成3個濃度，模板DNA含量為1. OX 107、1. OX 106、1. OX 105拷貝/ μ?，對每個濃度的樣品經(jīng)熒光定量PCR進(jìn)行定量分析，分別重復(fù)3次檢測，批內(nèi)和批間重復(fù) 性通過計(jì)算CT值的標(biāo)準(zhǔn)差（SD)和變異系數(shù)（CV)進(jìn)行評價。

【權(quán)利要求】
1. 一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 根據(jù)茶毛蟲核型多角體病毒的J13-1基因設(shè)計(jì)引物及//zsNPV J13-1 F和引物 及//zsNPV J13-1 R，所述的引物及//zsNPV J13-1 F核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述的 引物及//zsNPV J13-1 R核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 2) 從感染茶毛蟲核型多角體病毒的蟲尸中提取茶毛蟲核型多角體病毒基因組DNA，獲 取目的片段，以目的片段為模板，用步驟1)中設(shè)計(jì)的一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到J13-1基 因片段； 3) 將步驟2)擴(kuò)增獲得的J13-1基因片段與載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中， 挑單克隆菌株，搖菌，再采用PCR鑒定單菌落質(zhì)粒DNA，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒測序并測 定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，保存于_20°C冰箱中，備用，所述的重組質(zhì)粒核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示； 4) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋成不同濃度的模板，進(jìn)行熒光定量PCR，以其模板數(shù)的對數(shù) 值為X軸，CT值為Y軸做回歸曲線，建立檢測茶毛蟲核型多角體病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 5) 提取待測樣品基因組，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)步驟4)中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出 待測樣品的拷貝數(shù)，確定待測樣品的濃度。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述 的步驟2)中PCR擴(kuò)增的程序：先94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性30s，60°C變性45s ;循 環(huán)35次，最后延伸72°C延伸7min。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述 的步驟4)中熒光定量PCR采用20ul體系：質(zhì)粒模板2PL，SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 1〇μ?，ROX Reference Dye Π 0·4μ?，引物及/psNPV J13-1 F 和引物及/psNPV J13-1 R 各 0. 8μ?，加滅菌雙蒸水6ul至2〇μ? ;反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 30s ;95°C 5s，60°C 34s ;共40個循 環(huán)，陰性對照使用滅菌雙蒸水。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種茶毛蟲核型多角體病毒的定量檢測方法，其特征在于所述 的步驟 4)中梯度為 1. ΟΧΙΟ7、1. ΟΧΙΟ6、1. ΟΧΙΟ5、1. ΟΧΙΟ4、1. 0X103 和 1. 0X102 拷貝/>L。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099429SQ201410340772
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】肖強(qiáng), 袁志軍, 付建玉, 唐美君, 葛超美 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所