一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法。利用末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）技術分析地震前后烏魯木齊10號泉水體細菌群落結(jié)構變化，選定最具代表性的地震地區(qū)震斷裂帶，取樣，應用酶解法提取樣品總DNA，以總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物直接利用HinfⅠ和MspⅠ限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切產(chǎn)物進行T-RFLP檢測，得到T-RFLP圖譜經(jīng)分析和數(shù)據(jù)處理后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其消長規(guī)律，表明理化性質(zhì)對地震的響應不靈敏，而細菌群落對地震的響應更為靈敏。利用細菌種群對地震具有突出的映震效果，對短臨地震監(jiān)測具有廣泛的使用價值。
【專利說明】一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及地震預警監(jiān)測【技術領域】，具體的說，本發(fā)明涉及一種基于細菌群落結(jié) 構多樣性的地震監(jiān)測方法，進一步講，本發(fā)明針對新疆地區(qū)為代表基于細菌群落結(jié)構多樣 性的地震監(jiān)測方法的【技術領域】。 【背景技術】
[0002] 新疆地震斷裂帶廣泛分布于阿爾泰山、天山、昆侖山一帶，其地震活動十分活躍。 新疆地震活動頻率高、破壞性強、震源淺，是我國地震災害極其嚴重的一個地區(qū)。破壞性地 震一旦發(fā)生，將會給人們的生命財產(chǎn)帶來巨大傷害。為提高地震監(jiān)測的準確性、實效性、靈 敏性和減少地震災害帶來的損害，創(chuàng)立一種行之有效的地震監(jiān)測方法具有十分重要的意 義。
[0003] 地震孕育發(fā)生的本質(zhì)是地殼內(nèi)部應變能不斷積累，一定條件下在斷裂帶處突然釋 放的全過程。地下流體不僅參與這一過程，還充當著地震信息的傳播媒介，因此對地震斷裂 帶處地下流體中水文地球化學元素的監(jiān)測向來是地震監(jiān)測的重要手段之一?；谶@一過 程，新疆地震局多年對5級以上的強地震進行了較準確的短臨預測。而水文地球化學元素 對弱震甚至是有感地震的響應并不靈敏。大多數(shù)破壞性地震的前震均為有感地震，而微生 物在地下流體中能夠?qū)Νh(huán)境的微小變化迅速產(chǎn)生反應，因而科學推測，應用細菌群落結(jié)構 多樣性能夠靈敏的進行地震監(jiān)測將具有重要的價值和作用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有地震監(jiān)測方法中未見有關利用微生物群落結(jié)構的變化監(jiān)測地震的現(xiàn)狀， 本發(fā)明旨在提供一種靈敏的、全新的、安全可靠的、地域針對性強的地震監(jiān)測方法。經(jīng)過實 驗驗證，采用本發(fā)明提供的利用的末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP)技術分析地震前后 烏魯木齊10號泉水體細菌群落結(jié)構變化，細菌種群對地震具有突出的映震效果，對短臨地 震監(jiān)測具有廣泛的使用價值。
[0005] 本發(fā)明采用主要的技術方案： 利用的末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP)技術分析地震前后烏魯木齊10號泉水體 細菌群落結(jié)構變化，具體選定最具代表性的地震地區(qū)震斷裂帶，取樣，應用酶解法提取樣品 總DNA，以總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物直接利用班/?/ I和 I限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切產(chǎn)物進行T-RFLP檢測，得到T-RFLP圖譜經(jīng)分析和數(shù)據(jù) 處理后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其消長規(guī)律，表明理化性質(zhì)對地震的響 應不靈敏，而細菌群落對地震的響應更為靈敏。利用細菌種群對地震具有突出的映震效果， 對短臨地震監(jiān)測具有廣泛的使用價值。
[0006] 本發(fā)明具體提供一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法，具體 方法步驟如下： (1)選中代表性的地震斷裂帶的泉水作為采樣對象，將樣品低溫避光帶回實驗室，并在 短時間內(nèi)將樣品經(jīng)微孔濾膜過濾、洗脫，置于_20°C保存?zhèn)溆糜诳侱NA提取。
[0007] (2)利用的末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP)技術分析地震前后采樣細菌群落 結(jié)構變化：應用酶解法提取樣品總DNA，以總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增， 將PCR產(chǎn)物直接利用限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切產(chǎn)物進行T-RFLP檢測，得到T-RFLP圖 譜經(jīng)分析和數(shù)據(jù)處理后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其消長規(guī)律，從而用于 地震的監(jiān)測。
[0008] 進一步，本發(fā)明具體提供一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方 法，具體方法步驟如下： (1)選中代表性的地震斷裂帶的泉水作為采樣對象，每隔5 d從地震斷裂帶的泉水中采 集泉水樣品，將樣品低溫避光帶回實驗室，并在3 h內(nèi)將樣品用孔徑為0. 22um的微孔濾膜 過濾，將濾膜放置于無菌離心管中再用GTE緩沖液進行洗脫，-20°C保存用于總DNA提取。
[0009] (2)將保存樣品的離心管置于渦旋震蕩儀上渦旋5-10次，使微孔濾膜上的泉水微 生物懸浮于GTE緩沖液中，取600-800uL樣品應用酶解法提取樣品總DNA。
[0010] (3)以上述提取的總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增，將上述PCR產(chǎn) 物直接利用Λ?/?/ I和I限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切產(chǎn)物送至上海生工進行T-RFLP 檢測，得到T-RFLP圖譜經(jīng)分析和數(shù)據(jù)處理后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其 消長規(guī)律，從而用于地震的監(jiān)測。
[〇〇11] 通過實施本發(fā)明具體的
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達到以下有益效果： (1)本發(fā)明提供了一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法，基于 T-RFLP分子技術手段監(jiān)測微生物的種群變化，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其 消長規(guī)律，表明理化性質(zhì)對地震的響應不靈敏，而細菌群落對地震的響應更為靈敏，利用細 菌種群對地震具有突出的映震效果，對短臨地震監(jiān)測具有廣泛的使用價值，進而應用于地 震的監(jiān)測。證明了本發(fā)明提供的一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法 為地震監(jiān)測提供一種靈敏、準確的新方法。
[0012] (2)本發(fā)明針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法選擇烏魯木齊10 號泉的細菌群落為代表，是基于多年來對于烏魯木齊10號泉的監(jiān)測數(shù)據(jù)，對其細菌群落組 成有所了解，即其中年動態(tài)中的優(yōu)勢細菌群落組成。采用本發(fā)明提供的地震監(jiān)測方法，在歷 次10次地震中，有9次地震前后發(fā)現(xiàn)泉水中出現(xiàn)與地震相關的部分特殊類群，而一次震中 距(震源與烏魯木齊10號泉之間的直線距離）為1114Km的遠場地震中，沒有發(fā)現(xiàn)特殊類群 的存在，說明細菌群落用以遠場地震的監(jiān)測不敏感。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為泉水樣品總DNA圖。
[0014] 圖2為泉水細菌16S rRNA擴增結(jié)果圖。
[0015] 圖3為I和班/?/ I酶切檢測結(jié)果圖。
[0016] 圖4為兩種酶切產(chǎn)物的T-RFLP圖譜。
[0017] 圖5為采樣期間水文理化性質(zhì)的5日均值圖。
[0018] 圖6為地震前后特殊細菌類群與水文理化因子的RDA排序圖。
[0019] 圖7采樣期間水文理化性質(zhì)5日均值變化圖。
[0020] 圖8地震前后新出現(xiàn)的泉水細菌類群與水文理化因子的CCA分析結(jié)果圖。 【具體實施方式】
[0021] 下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。
[0022] 本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設備： 樣品的采集源：選擇的烏魯木齊10號泉位于烏魯木齊南部柳樹溝-紅雁池斷裂帶（E 87° 37 7，N 43° 42 7 )，海拔1042 m。該泉水量豐富（水流量為2. 07 L/ s)，水溫年變 化甚微，常年維持在12°C左右，pH值大于7,屬于弱堿性礦化水。泉水來源于博格達山區(qū)的 大氣降水與高山積雪融水補給。由于其補給區(qū)較遠，滲流路徑較長，循環(huán)于地下深處，很少 受到外部氣象和人為因素的影響，從而使泉水能更多的攜帶來自地球內(nèi)部的多種信息，是 中國新疆與哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦兩國交換地下流體資料的監(jiān)測泉點之一，同時也是 探索地下水細菌群落響應地震的優(yōu)質(zhì)樣地。根據(jù)泉中微生物種群變化、水質(zhì)、氣體、氡、汞等 測項，較為準確地對新疆烏蘇、沙灣、石河子、和靜、和碩等6次5級以上地震進行了短臨預 測。新10泉是烏魯木齊目前最好的，也是監(jiān)測項目最全的，是國際交換與共享臺站，是國際 交換國家最多，映震最為靈敏，是最具能代表新疆地區(qū)的地震發(fā)生情況和規(guī)律，以新10泉 為代表的新疆地震情況如何將細菌群落結(jié)構多樣性用于地震監(jiān)測具有重要的現(xiàn)實意義。
[0023] 本發(fā)明中選用的所有原輔材料、試劑和儀器都為本領域熟知的，其他本領域熟知 的一些試劑和設備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。
[0024] 實施例一：基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法 一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法具體步驟如下： (1)選中代表性的地震斷裂帶的泉水作為采樣對象，將樣品低溫避光帶回實驗室，并在 短時間內(nèi)將樣品經(jīng)微孔濾膜過濾、洗脫，置于-20°c保存?zhèn)溆糜诳侱NA提取。
[0025] (2)利用的末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP)技術分析地震前后采樣細菌群落 結(jié)構變化：應用酶解法提取樣品總DNA，以總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增， 將PCR產(chǎn)物直接利用限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切產(chǎn)物進行T-RFLP檢測，得到T-RFLP圖 譜經(jīng)分析和數(shù)據(jù)處理后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其消長規(guī)律。
[0026] 實施例二：基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法 一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法具體步驟如下： (1)選中代表性的地震斷裂帶的泉水作為采樣對象，每隔5 d從地震斷裂帶的泉水中采 集泉水樣品，將樣品低溫避光帶回實驗室，并在3 h內(nèi)將樣品用孔徑為0. 22um的微孔濾膜 過濾，將濾膜放置于無菌離心管中再用GTE緩沖液進行洗脫，-20°C保存用于總DNA提取。
[0027] (2)將保存樣品的離心管置于渦旋震蕩儀上渦旋5-10次，使微孔濾膜上的泉水微 生物懸浮于GTE緩沖液中，取600-800uL樣品應用酶解法提取樣品總DNA。
[0028] (3)以上述提取的總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增，將上述PCR產(chǎn) 物直接利用/和/限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切產(chǎn)物送至上海生工進行T-RFLP 檢測，得到T-RFLP圖譜經(jīng)分析和數(shù)據(jù)處理后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其 消長規(guī)律。
[0029] 實施例三：基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法 從2011年9月1日至2012年7月2日，每日測定斷裂帶處烏魯木齊10號泉水體12項 理化指標，分別為氬、氡、氮、硫化物、甲烷、二氧化碳、氦、氟、水汞、流量、氣體總量、電導率。
[0030] 在此期間每隔5 d采集地震斷裂帶泉水樣品3 L，樣品低溫避光帶回實驗室。并在 3 h內(nèi)將樣品用孔徑為0. 22um的微孔濾膜過濾，將濾膜放置于無菌離心管中，再用lOmLGTE 緩沖液進行洗脫，_20°C保存用于總DNA提取。
[0031] 將樣品保存的離心管置于渦旋震蕩儀上渦旋5-10次，使微孔濾膜上的泉水微生 物懸浮于GTE緩沖液中。取800 μ L GTE洗脫液至2mLEP管中，加入溶菌酶（10 mg /mL) 30 yL至終濃度為10mg /mL，37°C水浴2 h，每隔15-20min顛倒混勻數(shù)次；加入蛋白酶K(20 mg /mL)10 yL 至終濃度為 0· 2 mg /mL，20% 的 SDS 17 yL和 5 mol /L 的 NaCl 10 yL， 53°C水浴2 h，每隔15-20min顛倒混合數(shù)次；加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1， V Λ)進行抽提，lOOOr/min離心；將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，再加入2 /3體積的氯仿抽 提，lOOOr/min離心；將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入0. 6倍的異丙醇，置4°C過夜沉降； 次日，12000r/min離心20min，棄上清，用預冷的70%乙醇(現(xiàn)配現(xiàn)用）清洗1次，風干；力口 入20 yL TE緩沖液，-20°C保存。
[0032] 以上述提取的總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增， 正向引物為 8F(5' -FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')， 反向引物為 926R(5' -CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3')。
[0033] PCR 反應體系為 30uL :Premix 15uL，正反引物各 0· 25uL，DNA 模板 0· 5 uL，Taq 酶 0. 05uL，ddH2014uL。擴增程序采用降落式PCR :預變性94°C 6min，前10個循環(huán)為94°C 45s、61°C 45s、72°C 90s、(每個循環(huán)遞減 0.5°C)，后 20 個循環(huán)為 94°C 45s、56°C 45s、72°C 90s，72°C再延伸7min。擴增產(chǎn)物利用1 %的瓊脂糖凝膠，DNA Marker II電泳檢測。
[0034] 將上述PCR產(chǎn)物直接利用班/?/ /和/限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切條件為 37°C水浴酶切10h左右后，利用2. 5%的瓊脂糖凝膠，lOObp Marker電泳檢測，隨即65°C水 浴終止反應15min。酶切產(chǎn)物送至上海生工進行T-RFLP檢測，得到T-RFLP圖譜。經(jīng)Mica 數(shù)據(jù)庫比對和分析后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其消長規(guī)律。
[0035] 上述實施例方法提取樣品總DAN、細菌PCR產(chǎn)物檢測參見附圖1和附圖2。雙酶切 樣品檢測參見附圖3,酶切片段大小均小于PCR產(chǎn)物，表明酶切條件可行。附圖4為雙酶切 的T-RFLP圖譜。
[0036] 由新疆地震局網(wǎng)可得表1，其信息為采樣期內(nèi)發(fā)生的10次地震資料。由采樣期內(nèi) 泉水理化性質(zhì)如附圖5,可知，在地震前后水體各個監(jiān)測值均未發(fā)生顯著異常。經(jīng)數(shù)據(jù)庫對 t匕，如果同一菌群在兩種酶切數(shù)據(jù)中均存在，則可確定該菌群存在于泉水樣品中，表2為泉 水樣品普遍存在的優(yōu)勢類群；表3為地震前后新出現(xiàn)的特殊類群所占的比例，在沒發(fā)生地 震的時期內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)有特殊類群的存在。
[0037] 表1: 2011年9月1日至2012年7月2日地震詳情表
【權利要求】
1. 一種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法，其特征在于，所述的基 于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法具體步驟如下： (1) 選中代表性的地震斷裂帶的泉水作為采樣對象，將樣品低溫避光帶回實驗室，并在 短時間內(nèi)將樣品經(jīng)微孔濾膜過濾、洗脫，置于-20°c保存?zhèn)溆糜诳侱NA提??； (2) 利用的末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP)技術分析地震前后采樣細菌群落結(jié) 構變化：應用酶解法提取樣品總DNA，以總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增，將 PCR產(chǎn)物直接利用限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切產(chǎn)物進行T-RFLP檢測，得到T-RFLP圖譜經(jīng) 分析和數(shù)據(jù)處理后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其消長規(guī)律，從而用于地震 的監(jiān)測。
2. -種針對新疆地區(qū)基于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法，其特征在于，所述的基 于細菌群落結(jié)構變化的地震監(jiān)測方法具體步驟如下： (1) 選中代表性的地震斷裂帶的泉水作為采樣對象，每隔5 d從地震斷裂帶的泉水中采 集泉水樣品，將樣品低溫避光帶回實驗室，并在3 h內(nèi)將樣品用孔徑為0. 22um的微孔濾膜 過濾，將濾膜放置于無菌離心管中再用GTE緩沖液進行洗脫，-20°C保存用于總DNA提?。? (2) 將保存樣品的離心管置于渦旋震蕩儀上渦旋5-10次，使微孔濾膜上的泉水微生物 懸浮于GTE緩沖液中，取600-800uL樣品應用酶解法提取樣品總DNA ; (3) 以上述提取的總DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增，將上述PCR產(chǎn)物直 接利用Hinf I和Msp I限制性內(nèi)切酶進行消化，酶切產(chǎn)物送至上海生工進行T-RFLP檢 測，得到T-RFLP圖譜經(jīng)分析和數(shù)據(jù)處理后，獲得泉水土著及地震前后細菌群落組成和其消 長規(guī)律，從而用于地震的監(jiān)測。
【文檔編號】C12Q1/04GK104109717SQ201410341243
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權日:2014年7月18日
【發(fā)明者】羅嬌, 張濤, 林青, 高小其, 婁愷 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所