利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，特別是指一種利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法。在有氧及避光條件下，含有碳源、氮源及無機(jī)組分的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)血紅密孔菌(Pycnoporus?sanguineus)CGMCC?No.2932，發(fā)酵培養(yǎng)基中由玉米粉、麩皮粉、酒石酸銨、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、琥珀酸鈉、五水合硫酸銅、六水合氯化鉀、七水合硫酸鋅、表面活性劑、消泡劑及水組成，發(fā)酵過程中調(diào)解通風(fēng)量并流加營養(yǎng)物質(zhì)，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的再現(xiàn)性差、酶活低等問題，具有方法再現(xiàn)性好，所產(chǎn)的漆酶酶活高，所產(chǎn)酶系較純，酶的溫度穩(wěn)定性好，pH適應(yīng)性能好等優(yōu)點(diǎn)。該漆酶可廣泛應(yīng)用于染料降解、生物漂白、木材膠合、生態(tài)修復(fù)等領(lǐng)域。
【專利說明】利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，特別是指一種利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 漆酶是一種含銅多酚氧化酶，能催化酚類物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)。漆酶具有底物非 特異性的特殊性能，對許多結(jié)構(gòu)不同、難降解的高分子有機(jī)物質(zhì)具有廣譜的降解能力，其 應(yīng)用涉及造紙、紡織、木材加工、飲料食品、土壤修復(fù)和生物能源等多個領(lǐng)域。漆酶作為生物 催化劑，與物理的和化學(xué)的方法相比，其生物催化更具有高效率、低能耗的優(yōu)點(diǎn)。
[0003] 當(dāng)前，國內(nèi)市場漆酶的主要來源是美國Sigma公司和丹麥諾維信公司，由于其價 格昂貴等原因嚴(yán)重制約了其在國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。自然菌種中漆酶產(chǎn)量普遍較低，遠(yuǎn)不 能滿足生產(chǎn)和研究的需要，能否獲得大量用于生產(chǎn)和研究的價格合理的漆酶制劑成為制約 漆酶應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。
[0004] 中科院微生物研究所在專利號為200910083514. 7的發(fā)明專利中公開了"一種漆 酶及其制備方法與專用生產(chǎn)菌株"，該專利中利用血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus) CGMCCNo. 2932發(fā)酵制備的漆酶酶活可達(dá)到300u/ml，但公布的配方和工藝均為搖瓶發(fā)酵參 數(shù)，在發(fā)酵罐上放大培養(yǎng)的可再現(xiàn)性較差，因此，研究適用于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，且產(chǎn)酶活較 高的漆酶生產(chǎn)工藝是目前存在的主要技術(shù)難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法，采用該 方法所制備的漆酶適于工業(yè)化生產(chǎn)，且酶活較高。
[0006] 本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：
[0007] 利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法，包括在有氧及避光條件下，含有碳 源、氮源及無機(jī)組分的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus)CGMCC No. 2932,還包括如下步驟：
[0008] 發(fā)酵培養(yǎng)基采用如下質(zhì)量份數(shù)的組分組成：
[0009] 玉米粉20-40,麩皮粉3-10,酒石酸銨1-5,磷酸二氫鉀1-1. 5,七水合硫酸鎂 0. 2-0. 2,琥珀酸鈉0. 8-1. 0,五水合硫酸銅0. 15-0. 25,六水合氯化鉀0. 01-0. 05,七水合硫 酸鋅0· 01-0. 04,表面活性劑0· 1-0. 5,消泡劑0· 01-0. 05,水1000, pH自然；
[0010] 發(fā)酵的條件是：
[0011]接種量為8%-10%，0-3天：通風(fēng)比為1:0.3-0.4-111，溫度301：-321：;4-6天 ：通 風(fēng)比為 1:0. 7-0. 9vvm，溫度 30°C -32°c ;7-9 天：通風(fēng)比為 1:1. 0-1. 4vvm，溫度 30°C -32°c ; 10-11天：通風(fēng)比為1:1. 0-1. 2vvm，溫度30°C -32°c ;第三天流加甲醇誘導(dǎo)劑8-15ul ;在第 3天、第5天、第7天、第9天每天流加補(bǔ)水500-1000ml，第5-8天每天流加濃度為5mg/l硫 酸銅溶液l_3ml，發(fā)酵周期為10-12天。
[0012] 本發(fā)明的具體技術(shù)內(nèi)容還有：
[0013] 所述的表面活性劑選用吐溫-80,消泡劑選用泡敵。
[0014] 為縮短發(fā)酵周期，常見且優(yōu)選的技術(shù)實現(xiàn)方式是，將血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus) CGMCC No. 2932保藏的試管斜面種子接入平皿，擴(kuò)大培養(yǎng)后再接入搖瓶制成種 子液；將種子液接種至發(fā)酵罐無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0015] 其中較為優(yōu)選的實現(xiàn)方式是，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是將斜面菌種直接制成克氏瓶種 子。
[0016] 為進(jìn)一步縮短培養(yǎng)周期，更為優(yōu)選的實現(xiàn)方式是，擴(kuò)大培養(yǎng)中克氏瓶培養(yǎng)基采用 如下方法制備：將麥芽汁培養(yǎng)基稀釋至12柏林，加入瓊脂15克。
[0017] 所述的擴(kuò)大培養(yǎng)方法如下：將斜面菌種室溫活化2-4小時后接種至滅菌后的克氏 瓶培養(yǎng)基，在28°C -32°C條件在培養(yǎng)3-4天制成克氏瓶種子。
[0018] 本發(fā)明漆酶活力的測定是用2, 2'-連氮-雙- (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（英 文簡稱 ABTS) {2, 2，-azin〇-bis-[3-ethylthiazoline-6_sulphonate]}來測定的。一個酶 活力單位U的定義：在下述條件下，每分鐘內(nèi)催化1 μ Μ底物的酶量。
[0019] 酶活力的計算公式為U = A · V/( ε · L · Τ)
[0020] 公式中：Α表示紫外分光光度計吸收值的變化
[0021] V表示反應(yīng)體系的體積（單位：mL)，
[0022] ε = 3· 6X 104M · cnT1 = 36(μ mol/mir1 · cnT1，為氧化型 ABTS 的摩爾消光系數(shù)， L為比色皿的光徑（單位：cm)，T為反應(yīng)的時間（單位：分鐘）。
[0023] 本發(fā)明中酶活力測定條件為：反應(yīng)體積V = lmL，比色皿的光徑L = 0. 5cm，反應(yīng)時 間T = 30秒，反應(yīng)溫度為30°C。其中l(wèi)mL反應(yīng)體系內(nèi)含有500μ L的50mM的酒石酸緩沖 液（pH = 4)，390 μ L水，100 μ L500 μ Μ的ABTS，10 μ L發(fā)酵液，選用波長為420nm。如果發(fā) 酵液含有漆酶活力太高，可適當(dāng)稀釋。
[0024] 本發(fā)明所取得的實質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于：
[0025] 申請人:經(jīng)過對血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus) CGMCCNo. 2932的發(fā)酵條件及 培養(yǎng)基組成進(jìn)行科學(xué)的選配，在生產(chǎn)工藝上實現(xiàn)了漆酶在發(fā)酵罐上的穩(wěn)定成功生產(chǎn)，漆酶 酶活可達(dá)344U/ml。所產(chǎn)酶系較純，酶的溫度穩(wěn)定性好，pH適應(yīng)性能好。該漆酶可廣泛應(yīng)用 于染料降解、生物漂白、木材膠合、生態(tài)修復(fù)等領(lǐng)域，并對活性艷藍(lán)和靛藍(lán)有很好的褪色作 用。對活性艷藍(lán)5分鐘內(nèi)脫色達(dá)到90%以上。木質(zhì)素72小時的降解率達(dá)到60%，用于牛 仔褲水洗比化學(xué)法脫色，陳舊效果更好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1是本發(fā)明制備的發(fā)酵液過濾離心后的上清液進(jìn)行SDS-凝膠電泳得到的圖譜。
[0027] 由圖譜可知，產(chǎn)酶酶系較單一。這在實際規(guī)?；a(chǎn)中節(jié)約了大量分離純化成本。
[0028] 圖2是本發(fā)明所制備漆酶在常溫保存下的試驗結(jié)果。
[0029] 將制備的酶液置于30°C保存，分別在1、3、5、7、10、14、18、22、26、30(1測定酶活，由 圖2可見，酶在30°C條件下保存一個月，酶活損失4. 2%。說明其常溫穩(wěn)定性很好。
[0030] 圖3是本發(fā)明所制備漆酶的高溫耐受測定結(jié)果。
[0031] 將制備的酶液置于70°C水浴，分別在5、10、15、30、60min測定酶活變化情況，由圖 3可見，酶液置于70°C水浴中1小時酶活損失15. 7%。表明酶的高溫穩(wěn)定性較好。
[0032] 圖4是本發(fā)明所制備漆酶的pH穩(wěn)定性測定結(jié)果。
[0033] 將濃縮后的酶液用 pH = 2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0 的緩沖液稀釋， 30分鐘測定酶活，由圖4可見，漆酶在pH = 2. 0-5. 5的緩沖液中失活不明顯，pH大于5. 5 后，活性下降較快。其pH穩(wěn)定范圍為2. 0-5. 5。

【具體實施方式】
[0034] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不作為對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保 護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說明書做出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035] 本實施例的整體技術(shù)構(gòu)思如下：
[0036] 利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法，包括在有氧及避光條件下，含有碳 源、氮源及無機(jī)組分的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus)CGMCC No. 2932,還包括如下步驟：
[0037] 發(fā)酵培養(yǎng)基采用如下質(zhì)量份數(shù)的組分組成：
[0038] 玉米粉20-40,麩皮粉3-10,酒石酸銨1-5,磷酸二氫鉀1-1. 5,七水合硫酸鎂 0. 2-0. 2,琥珀酸鈉0. 8-1. 0,五水合硫酸銅0. 15-0. 25,六水合氯化鉀0. 01-0. 05,七水合硫 酸鋅0· 01-0. 04,表面活性劑0· 1-0. 5,泡敵0· 01-0. 05,水1000, pH自然；
[0039] 發(fā)酵的條件是：
[0040] 接種量為8%-10%，0-3天：通風(fēng)比為1:0.3-0.4-111，溫度301：-321：;4-6天：通 風(fēng)比為 1:0. 7-0. 9vvm，溫度 30°C -32°c ;7-9 天：通風(fēng)比為 1:1. 0-1. 4vvm，溫度 30°C -32°c ; 10-11天：通風(fēng)比為1:1. 0-1. 2vvm，溫度30°C -32°c ;第三天流加甲醇誘導(dǎo)劑8-15ul ;在第 3天、第5天、第7天、第9天每天流加補(bǔ)水500-1000ml，第5-8天每天流加濃度為5mg/l硫 酸銅溶液l_3ml，發(fā)酵周期為10-12天。
[0041] 所述的表面活性劑選用吐溫-80。
[0042] 將血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus) CGMCC No. 2932擴(kuò)大培養(yǎng)后制成種子液； 將種子液接種至無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0043] 所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是將斜面菌種制成克氏瓶種子。
[0044] 擴(kuò)大培養(yǎng)中克氏瓶培養(yǎng)基采用如下方法制備：將麥芽汁培養(yǎng)基稀釋至12柏林，力口 入瓊脂15克。
[0045] 將斜面菌種室溫活化2-4小時后接種至滅菌后的克氏瓶培養(yǎng)基，在28°C -32°C條 件在培養(yǎng)3-4天制成克氏瓶種子。
[〇〇46] 申請人:對利用本實施例中的方法所得到的漆酶進(jìn)行了如下試驗（試驗結(jié)果見附 圖說明）。
【權(quán)利要求】
1. 利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法，包括在有氧及避光條件下，含有碳 源、氮源及無機(jī)組分的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus)CGMCC No. 2932,其特征在于還包括如下步驟： 發(fā)酵培養(yǎng)基采用如下質(zhì)量份數(shù)的組分組成： 玉米粉20-40,麩皮粉3-10,酒石酸銨1-5,磷酸二氫鉀1-1. 5,七水合硫酸鎂0. 2-0. 2， 琥珀酸鈉〇. 8-1. 0,五水合硫酸銅0. 15-0. 25,六水合氯化鉀0. 01-0. 05,七水合硫酸鋅 0· 01-0. 04,表面活性劑 0· 1-0. 5,消泡劑 0· 01-0. 05,水 1000, pH 自然； 發(fā)酵的條件是： 接種量為8%-10%，0-3天：通風(fēng)比為1:0.3-0.4-111，溫度301：-321：;4-6天 ：通風(fēng)比 為 1:0. 7-0. 9vvm，溫度 3(TC -32°C;7-9 天：通風(fēng)比為 1:1. 0-1. 4vvm，溫度 3(TC -32°C;10-11 天：通風(fēng)比為1:1. 0-1. 2vvm，溫度3(TC-32? ;第三天流加甲醇誘導(dǎo)劑8-15ul ;在第3天、 第5天、第7天、第9天每天流加補(bǔ)水500-1000ml，第5-8天每天流加濃度為5mg/l硫酸銅 溶液l_3ml，發(fā)酵周期為10-12天。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法，其特征在于所 述的表面活性劑選用吐溫-80,消泡劑選用泡敵。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法，其特征在于還 包括如下工藝步驟：將血紅密孔菌（Pycnoporus sanguineus)CGMCC No. 2932擴(kuò)大培養(yǎng)后制 成種子液；將種子液接種至無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法，其特征在于所 述的擴(kuò)大培養(yǎng)是將斜面菌種制成克氏瓶種子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法，其特征在于所 述的擴(kuò)大培養(yǎng)中克氏瓶培養(yǎng)基采用如下方法制備：將麥芽汁培養(yǎng)基稀釋至12柏林，加入瓊 脂15克。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5中任一項所述的利用血紅密孔菌制備含有漆酶發(fā)酵液的方法， 其特征在于所述的擴(kuò)大培養(yǎng)方法如下：將斜面菌種室溫活化2-4小時后接種至滅菌后的克 氏瓶培養(yǎng)基，在28°C -32°C條件在培養(yǎng)3-4天制成克氏瓶種子。
【文檔編號】C12N9/02GK104099304SQ201410342986
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】章淑艷, 趙從波, 郭林, 秦艷梅, 李偉, 李軍, 王云鵬, 鄭翔, 李賓, 高慶華, 韓濤, 劉麗娜, 羅同陽, 薛剛 申請人:河北省微生物研究所, 中國科學(xué)院微生物研究所