一種BL21(DE3)ΔaroA菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物載體領(lǐng)域，特別涉及一種BL21(DE3)ΔaroA菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。構(gòu)建方法，包括以下步驟：構(gòu)建aroA基因敲除打靶片段；將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株，獲得BL21(DE3)/pKD46菌株；將aroA基因敲除打靶片段轉(zhuǎn)化至該菌株，獲得BL21(DE3)ΔaroA菌株。本發(fā)明提供的一種BL21(DE3)ΔaroA菌株的構(gòu)建方法，采用大于500bp的同源側(cè)翼序列，利用Red同源重組技術(shù)成功的敲除BL21(DE3)菌株的aroA基因；該菌株既可用于EPSPS功能互補驗證，還實現(xiàn)了pET系統(tǒng)重組外源蛋白的大量表達，達到一舉兩得的效果。
【專利說明】-種BL21 (DE3) Aar〇A菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物載體領(lǐng)域，具體而言，涉及一種BL21(DE3) AaroA菌株的構(gòu)建方 法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] aroA基因，因其編碼產(chǎn)物是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyru vylshikimate3_phosphate synthase, EPSPS)又被稱為 EPSPS 基因 。EPSPS 是只存在于 細菌、真菌、藻類、頂配位寄生蟲和植物中（Herrmann and Weaver, 1999 ;Macheroux and Schmidv，1999 Reeling et al.，1999)的莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，其功能是是催化PEP和莽 草酸-3-磷酸（shikimate3_phosphate，S3P)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（5_e nolpyruvylshikimate3_phosphate，EPSP)。莽草酸途徑（shikimate pathway)是連接碳水 化合物代謝和芳香族化合物生物合成的重要生物代謝途徑，該途徑起始于糖酵解中間產(chǎn)物 磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP)和五碳糖磷酸途徑中間產(chǎn)物赤蘚糖-4-磷 酸（erythrose4_phosphate)，到合成分支酸（chorismate)結(jié)束，整個過程有7種酶參與， EPSPS是倒數(shù)第二步的酶（Herrmann and Weaver, 1999)。EPSPS還是世界上使用量最大的 廣譜滅生性除草劑草甘膦（glyphosate)的唯一靶標酶，EPSPS和PEP的結(jié)合因草甘膦在結(jié) 構(gòu)上是PEP的類似物而被它競爭性的抑制，從而阻斷EPSP的合成，造成分支酸合成受阻，最 終導(dǎo)致芳香族氨基酸和芳香族化合物的生物合成代謝失調(diào)，最終造成生物體的死亡（Gruys et al. , 1992 ；Mcdowell et al. , 2004)〇
[0003] 菌株aroA內(nèi)源基因的缺失，將造成菌株自身芳香族氨基酸合成受阻，在沒有外源 芳香族氨基酸添加的基本培養(yǎng)基（如M9、M63等基本培養(yǎng)基）中將不能正常生長，只有將 aroA內(nèi)源基因缺失的菌株轉(zhuǎn)化進完整的能夠提供充足的具有活性的EPSPS的aroA基因，該 菌株才能夠在基本培養(yǎng)基中生長，因此，aroA基因缺失的菌株可用于EPSPS功能的互補驗 證（Zhou et al·，2006)。
[0004] Red同源重組技術(shù)是利用噬菌體Red系統(tǒng)介導(dǎo)實現(xiàn)外源線性DNA核苷酸片段與細 菌染色體上的目標基因進行同源重組的研究方法，外源線性DNA的兩端只需含有與染色體 目標基因兩側(cè)同源的約50bp的序列，便可實現(xiàn)將目標基因同源敲除的目的。該技術(shù)在大腸 桿菌K12菌株成功應(yīng)用的實例很多，但用于K12菌株以外的其他大腸桿菌菌株卻鮮有報道。 BL21 (DE3)菌株是大腸桿菌B菌株，用幾十bp的短的同源序列很難實現(xiàn)在該菌株內(nèi)的靶基 因的同源替換，因此，Red同源重組技術(shù)應(yīng)用于BL21 (DE3)菌株存在很大的挑戰(zhàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種BL21 (DE3) Λ aroA菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，以解決 上述的問題。
[0006] 在本發(fā)明的實施例中提供了一種BL21(DE3) AaroA菌株的構(gòu)建方法，包括以下步 驟：
[0007] 構(gòu)建aroA基因敲除打靶片段；
[0008] 將 pKD46 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 BL21 (DE3)菌株，獲得 BL21 (DE3) /pKD46 菌株；
[0009] 將aroA基因敲除打靶片段轉(zhuǎn)化進入BL21 (DE3) /pKD46菌株，獲得所述BL21 (DE3) Δ aroA菌株。
[0010] 優(yōu)選地，所述aroA基因敲除打靶片段包括依次連接的aroA-U基因片段、FRT基因 片段和aroA-D基因片段；所述aroA-U基因片段和aroA-D基因片段的長度均大于500bp。
[0011] 優(yōu)選地，所述FRT基因片段含有Kan抗性基因片段。
[0012] 優(yōu)選地，所述aroA基因敲除打靶片段的構(gòu)建包括以下步驟：
[0013] 以pKD4質(zhì)粒為模板，P1和P2為引物進行PCR擴增獲得兩端含有FRT位點的Kan 抗性基因片段FRT，將該片段連入克隆載體pTG19-T，獲得pJA1401質(zhì)粒，其中，P1和P2引 物為：
[0014] P1 :5' -GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
[0015] P2 :5, -ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3,；
[0016] 以BL21(DE3)菌株為模板，P3和P4為引物進行PCR擴增獲得兩端含有EcoR I和 Κρη I酶切位點的aroA基因上游序列aroA-U，將該片段連入克隆載體pTG19-T，獲得所述 PJA1402質(zhì)粒，其中，P3和P4引物為：
[0017] P3 :5 ' -CCGgaattcGGCAAAGATGTGGTGGTCGC-3 '
[0018] P4 :5, -CCGggtaccCAGGCTGGCTGTGGGGATTA-3,；
[0019] 以BL21 (DE3)菌株為模板，P5和P6為引物PCR進行擴增獲得兩端含有Sal I和 Hindlll酶切位點的aroA基因下游序列ar〇A-D，將該片段連入克隆載體pTG19-T，構(gòu)建獲得 PJA1403質(zhì)粒，其中，P3和P4引物為：
[0020] P5 :5, -CCGgtcgacACGGGCAATAAATAGCCAAATC-3'
[0021] P6 :5, -GCGaagcttTCCATCAGGCCACTGTAGACAC-3,；
[0022] 用EcoR I和Κρη I分別雙酶切pJA1402和pJA1401質(zhì)粒，將獲得的兩端含有 EcoR I和Κρη I粘性末端的ar〇A-U基因片段連入線性化的pJA1401質(zhì)粒，得到含有 ar〇A-U基因片段和含有Kan抗性的FRT基因片段的pJA1404質(zhì)粒；
[0023] 用Sal I和Hindlll分別雙酶切pJA1403和pJA1404質(zhì)粒，將獲得兩端含有Sal I和Hindlll粘性末端的ar 〇A-D基因片段連入線性化的PJA1404質(zhì)粒，構(gòu)建獲得含有依次 連接的ar〇A-U基因片段、FRT (Kan)基因片段和ar〇A-D基因片段的pJA1405質(zhì)粒；
[0024] 以P3和P6作為引物，PJA1405質(zhì)粒為模板，PCR擴增即可獲得aroA基因敲除打靶 片段。
[0025] 本發(fā)明還提供了上述BL21(DE3) Λ aroA菌株的構(gòu)建方法中得到的含有依次連接 的ar〇A-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和ar 〇A-D基因片段的pJA1405質(zhì)粒。
[0026] 本發(fā)明還提供了上述BL21(DE3) Λ aroA菌株的構(gòu)建方法中得到的含有依次連接 的aroA-U基因片段、FRT (Kan)基因片段和aroA-D基因片段的得aroA基因敲除打靶片段。
[0027] 本發(fā)明還提供了上述BL21(DE3)八&1*(^菌株的構(gòu)建方法中得到的口從1405質(zhì)粒的 菌株。
[0028] 本發(fā)明還提供了上述BL21 (DE3) Λ aroA菌株的構(gòu)建方法中得到的BL21 (DE3) Δ aroA菌株。
[0029] 本發(fā)明還提供了 BUT(BL21 (DE3) AaroA)菌株，將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3) Δ aroA 菌株，得到 BUT(BL21 (DE3) Δ aroA)菌株。
[0030] 本發(fā)明還提供了 BL21 (DE3) AaroA菌株在功能互補中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明的實施例提供的一種BL21(DE3) AaroA菌株的構(gòu)建方法，采用大于500bp 的同源側(cè)翼序列，利用Red同源重組技術(shù)成功的敲除BL21(DE3)菌株的aroA基因，為該 技術(shù)在BL21(DE3)菌株基因組成功敲除目標基因提供了可行的方法。aroA基因缺失的 BL21 (DE3)菌株，既可以用于EPSPS的功能互補驗證，同時還實現(xiàn)了 pET系統(tǒng)重組外源蛋白 的大量表達，達到一舉兩得的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1示出了本發(fā)明實施例1中PJA1405質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖；
[0033] 圖2示出了本發(fā)明實施例1中aroA-U、aroA-D和含有Kan抗性的FRT基因片段 PCR擴增后的瓊脂糖電泳結(jié)果圖；
[0034] 圖 3 示出了 本發(fā)明實施例 1 中質(zhì)粒 pJA1401、pJA1402、pJA1403、pJA1404 和 PJA1405限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定電泳結(jié)果圖；
[0035] 圖4示出了本發(fā)明實施例2中BL21(DE3) AaroA菌株的PCR鑒定電泳結(jié)果圖；
[0036] 圖5示出了本發(fā)明實施例3中BLA_(BL21 (DE3) Λ aroA)菌株的PCR鑒定電泳結(jié)果 圖；
[0037] 圖6示出了本發(fā)明實施例4中BL21 (DE3)菌株和BL21 (DE3) Λ aroA菌株在LB培 養(yǎng)基中的生長曲線圖；
[0038] 圖7示出了本發(fā)明實施例4中BL21 (DE3)菌株和BL21 (DE3) Λ aroA菌株在M9基 本培養(yǎng)基中的生長曲線圖；
[0039] 圖8示出了本發(fā)明實施例4中BL21 (DE3) Λ aroA菌株在M9基本培養(yǎng)基和加入芳 香族氨基酸的M9基本培養(yǎng)基中的生長曲線圖；
[0040] 圖9示出了本發(fā)明實施例5中菌株BL21 (DE3) Λ aroA和BL21 (DE3) Λ aroA/ pJA 1406在M9基本培養(yǎng)基中的生長曲線圖。

【具體實施方式】
[0041] 下面通過具體的實施例子并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
[0042] 本發(fā)明涉及的實驗材料和培養(yǎng)基的配制方法
[0043] 1、菌株與質(zhì)粒、引物
[0044] 用于本發(fā)明的細菌菌株和質(zhì)粒見表1 ;用于本發(fā)明的引物見表2。
[0045] 表1本發(fā)明的細菌菌株和質(zhì)粒
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種BL21(DE3) AaroA菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： 構(gòu)建aroA基因敲除打靶片段； 將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)菌株，獲得BL21 (DE3) /pKD46菌株； 將aroA基因敲除打靶片段轉(zhuǎn)化進入BL21 (DE3) /pKD46菌株，獲得所述BL21 (DE3) Δ aroA菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的BL21 (DE3) AaroA菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述aroA 基因敲除打靶片段包括依次連接的aroA-U基因片段、FRT基因片段和aroA-D基因片段；所 述ar〇A-U基因片段和ar 〇A-D基因片段的長度均大于500bp。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的BL21(DE3) Λ aroA菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述FRT基 因片段含有Kan抗性基因片段。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的BL21 (DE3) Δ aroA菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述aroA 基因敲除打靶片段的構(gòu)建包括以下步驟： 以pKD4質(zhì)粒為模板，P1和P2為引物進行PCR擴增獲得兩端含有FRT位點的Kan抗性 基因片段FRT，將該片段連入克隆載體pTG19-T，獲得pJA1401質(zhì)粒，其中，P1和P2引物為： P1 :5' -GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' P2 :5' -ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3' ； 以BL21(DE3)菌株為模板，P3和P4為引物進行PCR擴增獲得兩端含有EcoR I和 Κρη I酶切位點的aroA基因上游序列aroA-U，將該片段連入克隆載體pTG19-T，獲得所述 PJA1402質(zhì)粒，其中，P3和P4引物為： P3 :5' -CCGgaattcGGCAAAGATGTGGTGGTCGC-3' P4 :5' -CCGggtaccCAGGCTGGCTGTGGGGATTA-3' ； 以BL21(DE3)菌株為模板，P5和P6為引物PCR進行擴增獲得兩端含有Sal I和 Hindlll酶切位點的aroA基因下游序列ar〇A-D，將該片段連入克隆載體pTG19-T，構(gòu)建獲得 PJA1403質(zhì)粒，其中，P5和P6引物為： P5 :5' -CCGgtcgacACGGGCAATAAATAGCCAAATC-3' P6 :5' -GCGaagcttTCCATCAGGCCACTGTAGACAC-3' ； 用EcoR I和Κρη I分別雙酶切pJA1402和pJA1401質(zhì)粒，將獲得的兩端含有EcoR I 和Κρη I粘性末端的ar〇A-U基因片段連入線性化的pJA1401質(zhì)粒，得到含有ar〇A-U基因 片段和含有Kan抗性的FRT基因片段的PJA1404質(zhì)粒； 用Sal I和Hindlll分別雙酶切pJA1403和pJA1404質(zhì)粒，將獲得兩端含有Sal I和 Hindlll粘性末端的ar〇A-D基因片段連入線性化的PJA1404質(zhì)粒，構(gòu)建獲得含有依次連接 的ar 〇A-U基因片段、FRT (Kan)基因片段和ar〇A-D基因片段的pJA1405質(zhì)粒； 以P3和P6作為引物，PJA1405質(zhì)粒為模板，PCR擴增即可獲得aroA基因敲除打靶片 段。
5. -種權(quán)利要求4所述的BL21(DE3) Λ aroA菌株的構(gòu)建方法中得到的含有依次連接的 aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的pJA1405質(zhì)粒。
6. -種權(quán)利要求4所述的BL21(DE3) Λ aroA菌株的構(gòu)建方法中得到的含有依次連接的 aroA-U基因片段、FRT (Kan)基因片段和aroA-D基因片段的得aroA基因敲除打靶片段。
7. 含有權(quán)利要求4所述的BL21(DE3)八&1*(^菌株的構(gòu)建方法中得到的？從1405質(zhì)粒的 菌株。
8. 權(quán)利要求4所述的BL21 (DE3) Λ aroA菌株的構(gòu)建方法得到的BL21 (DE3) Λ aroA菌 株。 9. BUT(BL21 (DE3) AaroA)菌株，其特征在于，將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入權(quán)利要求8所述的 BL21 (DE3) Λ aroA 菌株，得到 BLA_(BL21 (DE3) Λ aroA)菌株。 10. BL21 (DE3) AaroA菌株在功能互補中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/21GK104099363SQ201410346343
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】鞏元勇, 倪萬潮, 郭書巧, 束紅梅, 沙琴 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院