巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記及其應(yīng)用,屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，所述巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記，具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列；本發(fā)明提供了巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記的特異性正反向引物，還提供了優(yōu)化的PCR體系和擴(kuò)增程序，通過(guò)對(duì)巴氏新小綏螨待測(cè)樣本的該分子標(biāo)記的分析，即可得知待測(cè)樣本是對(duì)甲氰菊酯的敏感品系還是抗性品系。該方法操作簡(jiǎn)便快捷，檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高，可以隨時(shí)監(jiān)測(cè)捕食螨的抗藥性，有利于“以蟲(chóng)殺蟲(chóng)”的生物防治策略，對(duì)于減少化學(xué)農(nóng)藥的使用、環(huán)境保護(hù)、果園可持續(xù)發(fā)展有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種分子標(biāo)記，尤其涉及一種巴氏新小綏 螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。 巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記及其應(yīng)用 【背景技術(shù)】
[0002] 巴氏新小綏螨屬蜱螨亞綱，寄螨目，革螨亞目、植綏螨科，小新綏螨屬，因其發(fā)育歷 期短、死亡率低、產(chǎn)卵率高、擴(kuò)散力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是最好的生物防治天敵之一。巴氏新小 綏螨是多食性捕食螨，除了捕食葉螨和薊馬外，還可以捕食蚜蟲(chóng)、木虱、粉虱、介殼蟲(chóng)、跳蟲(chóng)、 跗線(xiàn)螨、絲狀菌和蚊蠅類(lèi)的幼蟲(chóng)等。
[0003] 以甲氰菊酯為代表的菊酯類(lèi)農(nóng)藥是目前果園使用較為廣泛的殺蟲(chóng)殺螨劑，已有研 究表明，菊酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)植綏螨的毒力較大，在使用過(guò)程中容易造成植綏螨的大量死亡，導(dǎo)致 害螨的大爆發(fā)。因此我們室內(nèi)篩選獲得抗藥性巴氏新小綏螨，釋放到果園后可以有效應(yīng)對(duì) 農(nóng)藥脅迫，這對(duì)于該螨的田間釋放與長(zhǎng)期應(yīng)用有很高的實(shí)用價(jià)值。然而從形態(tài)上很難鑒別 巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯的敏感品系和抗性品系。
[0004] 隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展及其廣泛應(yīng)用，分子標(biāo)記被用來(lái)解決種類(lèi)鑒定這個(gè)問(wèn) 題。找到巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記，對(duì)于區(qū)分巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯的 敏感品系和抗性品系具有重要意義。目前螨類(lèi)對(duì)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性產(chǎn)生普遍認(rèn)為是由于 其靶標(biāo)鈉離子通道基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明根據(jù)巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯敏感和抗性品系分類(lèi)領(lǐng)域的空白，提供一種 巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供該分子標(biāo)記在巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯敏感品系和抗 性品系分類(lèi)中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案：一種巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分 子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所不：
[0008]
【權(quán)利要求】
1. 巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記在巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯敏感品系和抗性品系分類(lèi)中 的應(yīng)用。
3. 擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的特異性正反性引物，其特征在于：所述引物序列如 下： F :5' -CAACCTTTCACAGGCCAATC-3' ； R :5' -TTGCGTTGTAATACTTCTTCTG-3'。
4. 一種巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于：PCR擴(kuò)增 體系中采用的特異性正反向引物是根據(jù)權(quán)利要求1所述巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的 分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計(jì)的，所述特異性正反向引物擴(kuò)增的區(qū)域在該標(biāo)記的核苷酸序列 上，該方法先提取待測(cè)巴氏新小綏螨的總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板用 所述特異性正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到包含突變區(qū)域的鈉離子通道基因片段，將得到 的基因片段與上述巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記進(jìn)行序列比對(duì)，即可判斷該品 系是對(duì)甲氰菊酯的敏感品系還是抗性品系，所述特異性正反向引物為： F :5' -CAACCTTTCACAGGCCAATC-3' ； R :5' -TTGCGTTGTAATACTTCTTCTG-3'。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記的檢測(cè)方法， 其特征在于：所述PCR體系為：PCR Master Mix25yL，正反向引物各2yL，待測(cè)樣本cDNA 模板50?lOOng，補(bǔ)充ddH20至50 μ L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種巴氏新小綏螨對(duì)甲氰菊酯抗性的分子標(biāo)記的檢測(cè)方 法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min，然后94°C變性30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104109668SQ201410350374
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】冉春, 于士將, 陳飛, 劉浩強(qiáng), 田慧霞, 楊涓 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所