一種與非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相關(guān)的snp標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種與非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。該標(biāo)志物為rs3789612、rs4140836、rs13391263、rs13101737、rs1400558、rs6872396、rs13189951、rs9266596、rs7863990、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rs1531070、rs9533839、rs17019472、rs10182004、rs9461938、rs72759270和rs1886441的組合。該標(biāo)志物可用于制備非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒。
【專利說明】一種與非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志 物及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相 關(guān)的SNP標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 先天性心臟病（congenital heart disease, CHD)是由于心臟、血管在胚胎發(fā)育過 程中的障礙所致的心臟、血管形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能、代謝上的異常。在眾多出生缺陷中，CHD占 28%左右，是一種最為常見的先天性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的資料，普遍認(rèn)為CHD的發(fā)病 率在足月、活產(chǎn)的新生兒為0. 60%?0. 80%，在早產(chǎn)、死產(chǎn)或流產(chǎn)的病例中發(fā)病率則更高。 據(jù)測算，我國每年新增CHD病例超過13萬例，CHD已成為我國圍產(chǎn)兒第一位高發(fā)畸形。自 2000年起，圍產(chǎn)期CHD發(fā)生率呈快速上升趨勢，2011年全國CHD發(fā)生率為2000年的3. 56 倍。同時(shí)，CHD也是造成嬰幼兒死因或殘疾的主要原因之一，它不但嚴(yán)重危害兒童生存和生 活質(zhì)量，影響家庭幸福和諧，也會(huì)造成巨大的潛在壽命損失和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0003] 流行病學(xué)研究證明，綜合征型的CHD(syndromic CHD)占患者總數(shù)的25%左右，其 余為非綜合征型CHD(non_syndromic CHD)，即表現(xiàn)為心血管畸形而不伴其他系統(tǒng)畸形。非 綜合征型CHD在人群中多數(shù)呈散發(fā)，根據(jù)左、右兩側(cè)心臟及大血管之間有無分流，可分為3 大類：左向右分流型（潛伏青紫型）、右向左分流型（青紫型）、無分流型（無青紫型）。左 向右分流型主要包括：VSD、PDA、ASD等。右向左分流型主要包括：法洛四聯(lián)癥和大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位 等。無分流型主要包括：肺動(dòng)脈口狹窄和主動(dòng)脈縮窄等。引起非綜合征型CHD的原因很多， 包括孕母感染風(fēng)疹病毒、接觸環(huán)境致畸物、孕期用藥、母體疾病、孕婦吸煙、嗜酒、吸毒、染色 體異常、單基因突變以及多基因缺陷等。值得注意的是，71%患兒可存活到生育年齡以后， 因此，CHD，尤其是非綜合征型CHD已成為影響我國兒童身心健康及人口生存質(zhì)量的重大公 共衛(wèi)生問題。
[0004] 目前，先天性心臟病的診斷方法主要為病史詢問、體格檢查、影像學(xué)檢查（彩色多 普勒超聲心動(dòng)圖、X線、多層螺旋CT、磁共振成像）、心導(dǎo)管檢查和心血管造影、放射性核素 心血管造影顯像及心電圖等。然而，現(xiàn)在臨床常用的檢查仍存在一些弊端：多層螺旋CT及X 線對(duì)人體存在一定的輻射危害，不能作為CHD的一線影像檢查途徑；磁共振成像時(shí)間長（至 少需要30分鐘），檢查噪聲大，且病人的移動(dòng)對(duì)圖像質(zhì)量的影響很大，故不適用于不能合作 的兒童；放射性核素心血管造影注射技術(shù)要求高；心導(dǎo)管檢查及心血管造影作為CHD診斷 的金標(biāo)準(zhǔn)，在臨床先心病確診中居于重要地位，但其屬于有創(chuàng)檢查，操作復(fù)雜，有一定的手 術(shù)風(fēng)險(xiǎn)性，存在引起肺水腫的可能，因此不適合作為常規(guī)篩查手段。
[0005] 心臟發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，其關(guān)鍵時(shí)期為受孕后2?8周，經(jīng)歷了心管形 成、環(huán)化、內(nèi)部分隔、血管連接等過程，每個(gè)階段都受到許多重要基因和信號(hào)通路的調(diào)控。研 究表明，遺傳因素是非綜合征型CHD的重要病因，其中單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)起重要作用。SNP是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異一A，T，C 或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣 性，是人類可遺傳變異中最常見的一種。SNP的存在被認(rèn)為賦予了個(gè)體不同的表型性狀，以 及對(duì)于環(huán)境暴露、藥物治療等因素的不同反應(yīng)性。因此SNP可能是導(dǎo)致個(gè)體對(duì)常見疾病發(fā) 病和預(yù)后易感性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。近年來，針對(duì)腫瘤和心血管疾病等常見重大疾病的 SNP研究已經(jīng)成為臨床和科研工作者的研究熱點(diǎn)。
[0006] 然而，目前還沒有將SNP應(yīng)用于非綜合征型先天性心臟病診斷的報(bào)道，若能篩選 出非綜合征型先天性心臟病易感的SNP作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對(duì)我 國非綜合征型先天性心臟病診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動(dòng)，也為其藥物篩選、藥效評(píng)價(jià) 及靶向治療開辟了新的途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問題，提出一種與非綜合征型先天性心臟病輔助診 斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述SNP標(biāo)志物及其特異性擴(kuò)增引物和/或特異性延 伸引物在制備先天性心臟病輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明第五個(gè)目的是提供非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒。
[0012] 發(fā)明人通過分離和研究非綜合征型先天性心臟病患者及與其年齡、性別匹配的健 康對(duì)照外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與非綜合征型先天性心臟病高度相關(guān)的 高特異性和敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應(yīng)用的非綜合征型先天性心臟病輔助診斷 試劑盒，為非綜合征型先天性心臟病的篩查和診斷提供數(shù)據(jù)支持，為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià) 值的新型小分子藥物提供數(shù)據(jù)支持。
[0013] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0014] 一種與非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物，該標(biāo)志物為 rs3789612、 rs4140836、 rsl3391263、 rsl3101737、 rsl400558、 rs6872396、 rsl3189951、 rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rsl531070、rs9533839、 rsl7019472、rsl0182004、rs9461938、rs72759270 和 rsl886441 的組合。
[0015] 所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，該引物為：
[0016] rs3789612 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ;
[0017] rs4140836 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ;
[0018] rsl3391263 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ;
[0019] rsl3101737 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:ll ;
[0020] rsl400558 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 14 ;
[0021] rs6872396 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ;
[0022] rsl3189951 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:19 和 SEQ ID No:20 ;
[0023] rs9266596 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No:23 ;
[0024] rs2433752 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ;
[0025] rs7259736 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29 ;
[0026] rs490514 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ;
[0027] rs2474937 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ;
[0028] rsl531070 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38 ;
[0029] rs9533839 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ;
[0030] rsl7019472 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ;
[0031] rs 10182004 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No :46 和 SEQ ID No :47 ;
[0032] rs9461938 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No :49 和 SEQ ID No :50 ;
[0033] rs72759270 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ;
[0034] rsl886441 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:55 和 SEQ ID No:56。
[0035] 所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，該引物為：
[0036] rs3789612 的延伸引物序列為 SEQ ID No:3 ;
[0037] rs4140836 的延伸引物序列為 SEQ ID No:6 ;
[0038] rsl3391263 的延伸引物序列為 SEQ ID No:9 ;
[0039] rsl3101737 的延伸引物序列為 SEQ ID No:12 ;
[0040] rsl400558 的延伸引物序列為 SEQ ID No:15 ;
[0041] rs6872396 的延伸引物序列為 SEQ ID No:18 ;
[0042] rsl3189951 的延伸引物序列為 SEQ ID No:21 ;
[0043] rs9266596 的延伸引物序列為 SEQ ID No:24 ;
[0044] rs2433752 的延伸引物序列為 SEQ ID No:27 ;
[0045] rs7259736 的延伸引物序列為 SEQ ID No:30 ;
[0046] rs490514 的延伸引物序列為 SEQ ID No:33 ;
[0047] rs2474937 的延伸引物序列為 SEQ ID No:36 ;
[0048] rsl531070 的延伸引物序列為 SEQ ID No:39 ;
[0049] rs9533839 的延伸引物序列為 SEQ ID No:42 ;
[0050] rsl7019472 的延伸引物序列為 SEQ ID No:45 ;
[0051] rsl0182004 的延伸引物序列為 SEQ ID No:48 ;
[0052] rs9461938 的延伸引物序列為 SEQ ID No:51 ;
[0053] rs72759270 的延伸引物序列為 SEQ ID No:54 ;
[0054] rsl886441 的延伸引物序列為 SEQ ID No:57。
[0055] 所述的SNP標(biāo)志物在制備非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0056] 所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備非綜合征型先天性心臟病輔助診斷 試劑盒中的應(yīng)用。
[0057] 所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備非綜合征型先天性心臟病輔助診斷 試劑盒中的應(yīng)用。
[0058] -種非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測外周血DNA中 rs3789612、rs4140836、rsl3391263、rsl3101737、rsl400558、rs6872396、rsl3189951、 rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rsl531070、rs9533839、 rsl7019472、rsl0182004、rs9461938、rs72759270 和 rsl886441。
[0059] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物和/或特異 性延伸引物。
[0060] 其中，特異性擴(kuò)增引物為：
[0061] rs3789612 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ;
[0062] rs4140836 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ;
[0063] rsl3391263 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ;
[0064] rsl3101737 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:ll ;
[0065] rsl400558 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 14 ;
[0066] rs6872396 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ;
[0067] rsl3189951 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:19 和 SEQ ID No:20 ;
[0068] rs9266596 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No:23 ;
[0069] rs2433752 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ;
[0070] rs7259736 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29 ;
[0071] rs490514 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ;
[0072] rs2474937 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ;
[0073] rsl531070 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38 ;
[0074] rs9533839 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ;
[0075] rsl7019472 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ;
[0076] rs 10182004 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No :46 和 SEQ ID No :47 ;
[0077] rs9461938 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No :49 和 SEQ ID No :50 ;
[0078] rs72759270 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ;
[0079] rsl886441 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:55 和 SEQ ID No:56。
[0080] 特異性延伸引物為：
[0081] rs3789612 的延伸引物序列為 SEQ ID No:3 ;
[0082] rs4140836 的延伸引物序列為 SEQ ID No:6 ;
[0083] rsl3391263 的延伸引物序列為 SEQ ID No:9 ;
[0084] rsl3101737 的延伸引物序列為 SEQ ID No:12 ;
[0085] rsl400558 的延伸引物序列為 SEQ ID No:15 ;
[0086] rs6872396 的延伸引物序列為 SEQ ID No:18 ;
[0087] rsl3189951 的延伸引物序列為 SEQ ID No:21 ;
[0088] rs9266596 的延伸引物序列為 SEQ ID No:24 ;
[0089] rs2433752 的延伸引物序列為 SEQ ID No:27 ;
[0090] rs7259736 的延伸引物序列為 SEQ ID No:30 ;
[0091] rs490514 的延伸引物序列為 SEQ ID No:33 ;
[0092] rs2474937 的延伸引物序列為 SEQ ID No:36 ;
[0093] rsl531070 的延伸引物序列為 SEQ ID No:39 ;
[0094] rs9533839 的延伸引物序列為 SEQ ID No:42 ;
[0095] rsl7019472 的延伸引物序列為 SEQ ID No:45 ;
[0096] rsl0182004 的延伸引物序列為 SEQ ID No:48 ;
[0097] rs9461938 的延伸引物序列為 SEQ ID No:51 ;
[0098] rs72759270 的延伸引物序列為 SEQ ID No:54 ;
[0099] rsl886441 的延伸引物序列為 SEQ ID No:57。
[0100] 所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP 混合液、Mgcl 2溶液、去離子水等；還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>
[0101] 具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：（1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù) 庫：以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（S0P)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床 資料。（2)基因型檢測：選擇非綜合征型先天性心臟病病例，與非綜合征型先天性心臟病病 例年齡、性別匹配的對(duì)照，利用高密度SNP芯片，在全基因組范圍內(nèi)找出與非綜合征型先天 性心臟病相關(guān)的SNP。（3)對(duì)于篩選出來的陽性關(guān)聯(lián)SNP，進(jìn)一步采用Sequenom MassARRAY 基因分型平臺(tái)進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證將其應(yīng)用于診斷的可重復(fù)性。（4)非綜合征型先天性心臟病 輔助診斷試劑盒的研制：根據(jù)非綜合征型先天性心臟病病例和健康對(duì)照中基因型分布頻率 有顯著差異的SNP開發(fā)SNP輔助診斷試劑盒。
[0102] 本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序（S0P)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口 學(xué)資料、臨床資料等，并采用了 Affymetrixe. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描，初篩陽性位點(diǎn)采用 Sequenom MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0103] 具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個(gè)部分：
[0104] 1.研究樣本的選擇
[0105] (1)經(jīng)超聲心動(dòng)圖、心臟導(dǎo)管插入術(shù)或手術(shù)明確診斷的非綜合征型先天性心臟病 患者；
[0106] (2)排除合并其他器官先天異常、染色體異常患者；
[0107] (3)排除一級(jí)親屬患先心病、母親患有糖尿病、苯丙酮尿癥、母親孕期接觸致畸物 (如農(nóng)藥或有機(jī)溶劑）及服用藥物的患者；
[0108] (4)與病例年齡、性別匹配的對(duì)照；
[0109] 本研究共采用8217例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進(jìn)行研究。
[0110] 2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20-50ng/y 1 DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在1. 6-2. 0。
[0111] 3. Affymetrix6. 0 芯片檢測
[0112] (1)取受試者全基因組DNA樣本；
[0113] (2)在Affymetrixe.O芯片（購于美國昂飛公司，下同）上進(jìn)行全基因組掃描；
[0114] (3)檢測并比較各基因型在非綜合征型先天性心臟病病例與健康對(duì)照中的分別差 異。
[0115] 4. Sequenom MassARRAY 基因分型檢測
[0116] (1)取受試者DNA樣本；
[0117] (2)設(shè)計(jì)SNP的特異性擴(kuò)增引物和特異性延伸引物；
[0118] (3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物純化；
[0119] (4)進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)及產(chǎn)物純化；
[0120] (5)檢測并比較非綜合征型先天性心臟病病例與健康對(duì)照中不同基因型的分布差 異。
[0121] 5.診斷試劑盒制備方法
[0122] Affymetrix6. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描和Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)驗(yàn) 證后確定非綜合征型先天性心臟病病例與健康對(duì)照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP， 作為非綜合征型先天性心臟病輔助診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與非綜合征型先天性心臟病 發(fā)病有關(guān)的 SNP 組成輔助診斷試劑盒（rs3789612、rs4140836、rsl3391263、rsl3101737、 rsl400558、rs6872396、rsl3189951、rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、 rs2474937、rsl531070、rs9533839、rsl7019472、rsl0182004、rs9461938、rs72759270 和 rsl886441)。診斷試劑可以包括這些SNP的特異性擴(kuò)增引物及特異性延伸引物，以及Taq 酶、dNTP等試劑。
[0123] 6.統(tǒng)計(jì)分析方法
[0124] 運(yùn)用卡方檢驗(yàn)（用于分類變量）或者student t檢驗(yàn)（用于連續(xù)性變量）比較人 口學(xué)特征等在研究對(duì)象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進(jìn)行關(guān) 聯(lián)分析。計(jì)算比值比（Odds Ratio, 0R)以及它們的95%可信區(qū)間。定義那些0R小于1的 SNP為保護(hù)性SNP ;定義那些0R大于1的SNP為危險(xiǎn)性SNP。
[0125] 為了進(jìn)一步研究這19個(gè)SNP構(gòu)成的綜合指征用于早期診斷的效果，我們構(gòu)建 了一個(gè)數(shù)學(xué)公式，綜合考慮每個(gè)SNP與非綜合征型先天性心臟病發(fā)病的正、負(fù)關(guān)聯(lián)情況 和聯(lián)系強(qiáng)度。具體來說，我們對(duì)每個(gè)SNP的三種基因型進(jìn)行評(píng)分，野生純合型="0"， 雜合型=" 1 "，變異純合型="2"，以單個(gè)SNP分析時(shí)的additive模型下的回歸系數(shù) 為權(quán)重，綜合考慮每個(gè)SNP的情況給每個(gè)研究研究對(duì)照確定一個(gè)危險(xiǎn)分值。危險(xiǎn)分值 的計(jì)算方法如下：危險(xiǎn)分值=(〇. 447Xrs3789612的評(píng)分）+ (0. 490Xrs4140836的評(píng) 分）+ (0· 338Xrsl3391263 的評(píng)分）+ (0· 325Xrsl3101737 的評(píng)分）+ (0· 266Xrsl400558 的 評(píng)分）+ (〇· 570Xrs6872396 的評(píng)分）+ (0· 397Xrsl3189951 的評(píng)分）+ (0· 477Xrs9266596 的 評(píng)分）+ (_〇· 329Xrs2433752 的評(píng)分）+ (0· 332Xrs7259736 的評(píng)分）+ (0· 255Xrs490514 的 評(píng)分）+ (〇· 499Xrs2474937 的評(píng)分）+ (0· 479Xrsl531070 的評(píng)分）+ (0· 392Xrs9533839 的 評(píng)分）+ (_〇· 284Xrsl7019472 的評(píng)分）+ (0· 270 Xrsl0182004 的評(píng)分）+ (0· 570 Xrs9461938 的評(píng)分）+ (_〇. 341Xrs72759270的評(píng)分）+ (0. 311Xrsl886441的評(píng)分），獲得的危險(xiǎn)分值 系數(shù)以及界限值被直接應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)研究的2191例樣本中。（以rs3789612為例： 0. 447為rs3789612的回歸系數(shù)（見表1) ;rs3789612的評(píng)分，野生純合型= "0"，雜合型= "1"，變異純合型="2"，某個(gè)SNP的基因型由儀器檢測結(jié)果確定；某個(gè)樣本的總評(píng)分是這些 個(gè)SNP分別評(píng)分的總和，單個(gè)SNP的基因型只是計(jì)算評(píng)分的一個(gè)中間過程，不需要知道具體 基因型。）
[0126] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過專門的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件完成（PLINK1. 07)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平 P值設(shè)為〇. 05,所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。
[0127] 以下是本發(fā)明進(jìn)一步的說明：
[0128] 在上述945例符合條件的非綜合征型先天性心臟病病例及1246例健康對(duì)照中，兩 組年齡、性別均衡可比。我們將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe. 0芯片進(jìn)行全基因組掃描獲得 相關(guān)結(jié)果。
[0129] 根據(jù)Affymetrix6. 0芯片檢測，本發(fā)明人檢測到在"非綜合征型先天性心臟病病 例"組和"健康對(duì)照"組中基因型分布頻率存在差異的SNP包括：rs3789612、rs4140836、 rsl3391263、rsl3101737、rsl400558、rs6872396、rsl3189951、rs9266596、rs2433752、 rs7259736、rs490514、rs2474937、rsl531070、rs9533839、rsl7019472、rsl0182004、 rs9461938、rs72759270 和 rsl886441。
[0130] 根據(jù)上述檢測結(jié)果，我們將這20個(gè)與非綜合征型先天性心臟病發(fā)病相關(guān)的SNP在 另外2160例非綜合征型先天性心臟病病例和與其年齡、性別匹配的3866例健康對(duì)照中在 Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與Affymetrix6. 0芯片檢測一致。
[0131] 單因素和多因素Logistic回歸分析結(jié)果均表明，這19個(gè)SNP與非綜合征型先天 性心臟病的發(fā)病存在著顯著關(guān)聯(lián)。
[0132] 進(jìn)一步分析這19個(gè)SNP的組合用于非綜合征型先天性心臟病診斷的效果，發(fā)現(xiàn)其 組合能夠很好的區(qū)分病例與對(duì)照。
[0133] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明人制備了一種能用于非綜合征型先天性心臟病輔助診 斷的試劑盒，包含測定受試者血標(biāo)本DNA中上述SNP的特異性擴(kuò)增引物、特異性延伸引物和 其他檢測試劑。
[0134] 具體而言，這19個(gè)SNP的組合，或者這19個(gè)SNP的特異性擴(kuò)增引物、特異性延伸 引物的組合構(gòu)成的相關(guān)診斷試劑盒有助于非綜合征型先天性心臟病的輔助診斷，為臨床醫(yī) 生快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度，及時(shí)采取更具個(gè)性化的防治方案提供支 持。
[0135] 本發(fā)明有益效果：
[0136] 本發(fā)明提供的SNP標(biāo)志物作為非綜合征型先天性心臟病輔助判斷的標(biāo)志物的優(yōu) 越性在于：
[0137] (l)SNP是一種新型基因生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢 測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為非綜合征型 先天性心臟病的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。
[0138] (2) SNP試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷試劑盒，可用于非綜合征型先天性心臟病 的輔助診斷，有助于反映患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時(shí)采取更 具個(gè)性化的防治方案提供支持。
[0139] (3)采用嚴(yán)密的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)體系，本發(fā)明人初期采用全基因組芯片掃描以獲取疾 病相關(guān)的SNP譜，并在Sequenom MassARRAY基因分型平臺(tái)上進(jìn)行了驗(yàn)證；以上方法和策略 的應(yīng)用加速和保證了 SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒在臨床上的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo) 志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0140] 本發(fā)明通過控制年齡、性別等對(duì)疾病發(fā)展的影響因素，研究SNP在非綜合征型先 天性心臟病輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述SNP對(duì)于非綜合征型先天性心臟病進(jìn)展的影響，揭 示其診斷價(jià)值。因此，本發(fā)明獲得了非綜合征型先天性心臟病發(fā)病相關(guān)SNP譜和特異性標(biāo) 志物；通過SNP生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的研制和應(yīng)用，可使得非綜合征型先天性心臟病 的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治療效果評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)， 并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價(jià)值的新型小分子藥物靶標(biāo)提供幫助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0141] 圖1 :顯示全基因組關(guān)聯(lián)研究病例組和對(duì)照組的R0C曲線。
[0142] 顯示非綜合征型先天性心臟病病例組對(duì)健康對(duì)照組為參照的R0C曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0143] 實(shí)施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0144] 發(fā)明人于2006年開始至2012年從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、南京兒童醫(yī)院、西 安西京醫(yī)院收集了大量的非綜合征型先天性心臟病患者血標(biāo)本，通過對(duì)樣品資料的整理， 發(fā)明人從中選擇了 8217例符合下列標(biāo)準(zhǔn)的樣本全基因組芯片掃描和單個(gè)SNP Sequenom MassARRAY基因分型的實(shí)驗(yàn)樣品：
[0145] 1、經(jīng)超聲心動(dòng)圖、心臟導(dǎo)管插入術(shù)或手術(shù)明確診斷的非綜合征型先天性心臟病患 者；
[0146] 2、排除合并其他器官先天異常、染色體異?；颊撸?br>
[0147] 3、排除一級(jí)親屬患先心病、母親患有糖尿病、苯丙酮尿癥、母親孕期接觸致畸物 (如農(nóng)藥或有機(jī)溶劑）及服用藥物的患者；
[0148] 4、與病例年齡、性別匹配的健康對(duì)照；
[0149] 并系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料和臨床資料等情況。
[0150] 實(shí)施例2外周血DNA中SNP的全基因組掃描
[0151] 在上述符合條件的945例非綜合征型先天性心臟病患者和1246例健康對(duì)照中，兩 組年齡、性別匹配。將這兩組人群經(jīng)Affymetrixe.O芯片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。具體步驟為：
[0152] 1、向儲(chǔ)存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑（即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化鎂2. 02g和曲拉通X-100(amresco 0694)2〇1111混合后，用1^8此1溶 液定容至2000ml，下同），顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0153] 2、去除紅細(xì)胞：用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml，顛倒混勻，4000rpm離心10分 鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0154] 3、抽提DNA :向沉淀中加1ml抽提液（每300ml中含有122. 5ml0. 2M氯化鈉， 14. 4ml0. 5M乙二胺四乙酸，15mll0%十二烷基硫酸鈉，148. lml雙蒸水，下同）和8μ 1蛋白 酶Κ，震蕩器上充分震蕩混勻，37 °C水浴過夜。
[0155] 4、去除蛋白質(zhì)：加lml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 :1，v/v，下同），充分混勻后（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分入 兩個(gè)1. 5ml的離心管）。
[0156] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無 水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。
[0157] 6、DNA洗漆：在沉淀中加入冰無水乙醇lml, 12000rpm離心lOmin,棄上清后真空 抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0158] 7、測量濃度：通常能得到20-50ng/ μ 1 DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0159] 8、在Affymetrix 6. 0芯片（購于美國昂飛公司，下同）上進(jìn)行全基因組掃描；
[0160] 9、數(shù)據(jù)分析與處理：在"非綜合征型先天性心臟病病例"組和"健康對(duì)照"組中發(fā) 現(xiàn)的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經(jīng)羅列出，結(jié)果見表1。
[0161] 實(shí)施例3單個(gè)SNP的Sequeom MassARRAY基因分型
[0162] 將上述全基因組掃描發(fā)現(xiàn)與非綜合征型先天性心臟病發(fā)病有關(guān)的SNP在2160例 非綜合征型先天性心臟病病例和3866例健康對(duì)照中進(jìn)行檢測，具體步驟為 ：
[0163] 1、向儲(chǔ)存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉(zhuǎn)入。
[0164] 2、去除紅細(xì)胞：用溶血試劑將5ml離心管補(bǔ)至4ml，顛倒混勻，4000rpm離心10分 鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄 上清。
[0165] 3、抽提DNA:向沉淀中加1ml抽提液和8μ 1蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻， 37 °C水浴過夜。
[0166] 4、去除蛋白質(zhì)：加lml飽和酚充分混勻（手輕搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘， 取上清轉(zhuǎn)入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液（氯仿：異戊 醇=24 :1)，充分混勻后（手搖15分鐘），4000rpm離心10分鐘，取上清（分入兩個(gè)1. 5ml 的離心管）。
[0167] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無 水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。
[0168] 6、DNA洗漆：在沉淀中加入冰無水乙醇lml, 12000rpm離心lOmin,棄上清后真空 抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0169] 7、測量濃度：通常能得到20-50ng/ μ 1 DNA，純度（紫外2600D與2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0170] 8、進(jìn)行 Sequenom MassARRAY 基因分型：
[0171] 1)使用 Sequenom 公司 Genotyping Tools 及 MassARRAY Assay Design 軟件對(duì)全 基因組掃描發(fā)現(xiàn)的19個(gè)陽性關(guān)聯(lián)的SNP設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物（表2)。反 應(yīng)體系包括 4μ1 Sequenom MassARRAY 基因分型 PCR master mix(Hotstar Taq 0.5U，每 條擴(kuò)增引物〇. 5pmol，0. 1 μ 1的25mM dNTPs、1. 9 μ 1雙蒸水），加入1 μ 1 DNA。儀器使用的 是 Sequenom MassARRAY Nanodispenser，PCR 反應(yīng)條件為：94°C 4 分鐘；94°C 20 秒，56°C 30 秒，72 °C 1分鐘，45個(gè)循環(huán)；72 °C 3分鐘；4°C保持。
[0172] 2)在 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，將 PCR 產(chǎn)物用 SAP (shrimp alkaline phosphatase,蟲下堿性 磷酸酶）處理，以去除體系中游離的dNTPs。
[0173] 3)在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系包括：2 μ 1 EXTEND Mix (單堿基延伸反應(yīng)液，包括其中各延伸反應(yīng)引物混合物0.94 μ l，iPLEX酶0.041 μ 1，延 伸混合物0. 2 μ 1)，7 μ 1 SAP處理后PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件：I. 94°C 30秒；II. 94°C 5秒； III. 52°C 5 秒；IV. 80°C 5 秒；V.重復(fù) III、IV4 個(gè)循環(huán)；VI.重復(fù) II、III、IV、V39 個(gè)循環(huán)； VII. 72°C 3 分鐘；VII. 4°C保持
[0174] 4)樹脂純化：
[0175] (1)將Clean Resin樹脂平鋪到6mg的樹脂板中；
[0176] (2)加16 μ 1水到延伸產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)孔內(nèi)；
[0177] (3)將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中，封膜，低速垂直旋轉(zhuǎn)30分鐘，使樹脂與反 應(yīng)物充分接觸；
[0178] (4)離心使樹脂沉入孔底部。
[0179] 5)芯片點(diǎn)樣：啟動(dòng)MassARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣儀，將樹脂純化后的延 伸產(chǎn)物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上
[0180] 6)質(zhì)譜檢測：將點(diǎn)樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF(matrix -assisted laser desorption/ionization - time of fligh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì) 譜）分析，檢測結(jié)果使用TYPER 4.0軟件（sequenom)分型并輸出結(jié)果。
[0181] 9、數(shù)據(jù)處理和分析：利用logistic回歸模型中的additive模型比較每個(gè)SNP的 三種基因型在病例組和對(duì)照組中分布頻率的差異，結(jié)果與全外顯子掃描類似不再列出。
[0182] 實(shí)施例4利用危險(xiǎn)度評(píng)分方法進(jìn)一步分析SNP與非綜合征型先天性心臟病發(fā)病
[0183] 根據(jù)上述結(jié)果，本發(fā)明人通過對(duì)2組樣品（"非綜合征型先天性心臟病病例組"和 "健康對(duì)照組"）基因型分布頻率的比較，選擇陽性關(guān)聯(lián)的SNP，以全基因組掃描樣本中單個(gè) SNP回歸系數(shù)為權(quán)重，進(jìn)一步求得危險(xiǎn)分值，繪制R0C來評(píng)價(jià)檢測的靈敏性和特異性，進(jìn)而 診斷這些SNP對(duì)非綜合征型先天性心臟病發(fā)病的判斷能力。對(duì)19個(gè)SNP標(biāo)志物的聯(lián)合分 析發(fā)現(xiàn)，這19個(gè)SNP以71. 3 %的AUC將健康對(duì)照組和先天性心臟病病例組分開，最佳臨界 點(diǎn)的靈敏度為68. 0%，特異度：63. 8% (圖1)。
[0184] 因此，本發(fā)明人證明 了采用 rs3789612、rs4140836、rsl3391263、rsl3101737、 rsl400558、rs6872396、rsl3189951、rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、 rs2474937、rsl531070、rs9533839、rsl7019472、rsl0182004、rs9461938、rs72759270 和 rsl886441的組合能夠很好地將健康對(duì)照和非綜合征型先天性心臟病患者區(qū)分。
[0185] 實(shí)施例5用于非綜合征型先天性心臟病輔助診斷SNP試劑盒的制作
[0186] SNP試劑盒的制作和操作流程是基于Affymetrix6. 0芯片檢測和Sequenom MassARRAY基因分型技術(shù)。試劑盒含有一批SNP特異性擴(kuò)增引物（包括下列引物： rs3789612的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:l和SEQ ID No:2;rs4140836的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:4和SEQ ID No:5;rsl3391263 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:7和SEQ ID No:8; rsl3101737的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:10和SEQ ID No:ll;rsl400558的擴(kuò)增引物序列 為 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 14 ;rs6872396 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No:17;rsl3189951 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:19和SEQIDNo:20;rs9266596 的擴(kuò)增 引物序列為SEQ ID No:22和SEQ ID No:23 ;rs2433752的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:25 和SEQIDNo:26;rs7259736 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:28和SEQIDNo:29;rs490514 的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:31和SEQ ID No:32;rs2474937的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35;rsl531070 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38; rs9533839的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:40和SEQ ID No:41;rsl7019472的擴(kuò)增引物序 列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44;rsl0182004 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:46 和 SEQ IDNo:47;rs9461938 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:49和SEQIDNo:50;rs72759270 的擴(kuò) 增引物序列為SEQ ID No:52和SEQ ID No:53;rsl886441的擴(kuò)增引物序列為SEQ ID No:55 和SEQ ID N〇:56。）特異性延伸引物（包括下列延伸引物：rs3789612的延伸引物序列為 SEQ ID No:3;rs4140836的延伸引物序列為SEQ ID No:6;rsl3391263的延伸引物序列為 SEQ ID No:9;rsl3101737的延伸引物序列為SEQ ID No:12;rsl400558的延伸引物序列為 SEQ ID No:15 ;rs6872396的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ;rsl3189951的延伸引物序列 為SEQ ID No:21;rs9266596的延伸引物序列為SEQ ID No:24;rs2433752的延伸引物序列 為SEQ ID No:27 ;rs7259736的延伸引物序列為SEQ ID No:30 ;rs490514的延伸引物序列 為SEQ ID No:33;rs2474937的延伸引物序列為SEQ ID No:36;rsl531070的延伸引物序列 為SEQ ID No:39 ;rs9533839的延伸引物序列為SEQ ID No:42 ;rsl7019472的延伸引物序 列為SEQ ID No:45 ;rsl0182004的延伸引物序列為SEQ ID No:48 ;rs9461938的延伸引物 序列為SEQ ID No:51 ;rs72759270的延伸引物序列為SEQ ID No:54 ;rsl886441的延伸引 物序列為SEQ ID N〇:57。），還可以有相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試劑，如：dNTPs，MgCl2，雙蒸 水，Taq酶等，這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照（如 確定基因型的標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照等）。此試劑盒的價(jià)值在于只需要外周血而不需要其它組 織樣品，通過最精簡和特異的擴(kuò)增引物及延伸引物檢測SNP，再通過SNP譜輔助判斷非綜合 征型先天性心臟病，不僅穩(wěn)定，檢測方便，且精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因 此將此試劑盒投入實(shí)踐，可以幫助指導(dǎo)診斷和更有效的個(gè)體化治療。
[0187] 表1.病例組與對(duì)照組全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
[0188]
【權(quán)利要求】
1. 一種與非綜合征型先天性心臟病輔助診斷相關(guān)的SNP標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物 為 rs3789612、rs4140836、rsl3391263、rsl3101737、rsl400558、rs6872396、rsl3189951、 rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rsl531070、rs9533839、 rsl7019472、rsl0182004、rs9461938、rs72759270 和 rsl886441 的組合。
2. 權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物，其特征在于該引物為： rs3789612 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ; rs4140836 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ; rsl3391263 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8; rsl3101737 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:10和SEQIDNo:ll; rsl400558 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 14; rs6872396 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ; rsl3189951 的擴(kuò)增引物序列為SEQIDNo:19和SEQIDNo:20; rs9266596 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No: 23; rs2433752 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No: 26; rs7259736 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No: 29; rs490514 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ; rs2474937 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No: 35; rsl531070 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No: 38; rs9533839 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ; rsl7019472 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ; rsl0182004 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47; rs9461938 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No: 50; rs72759270 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53; rsl886441 的擴(kuò)增引物序列為 SEQ ID No:55 和 SEQ ID No: 56。
3. 權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物，其特征在于該引物為： rs3789612的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ; rs4140836的延伸引物序列為SEQ ID No:6 ; rsl3391263的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ; rsl3101737的延伸引物序列為SEQ ID No:12 ; rsl400558的延伸引物序列為SEQ ID No: 15 ; rs6872396的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ; rsl3189951的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ; rs9266596的延伸引物序列為SEQ ID No:24 ; rs2433752的延伸引物序列為SEQ ID No:27 ; rs7259736的延伸引物序列為SEQ ID No:30 ; rs490514的延伸引物序列為SEQ ID No:33 ; rs2474937的延伸引物序列為SEQ ID No:36 ; rsl531070的延伸引物序列為SEQ ID No:39 ; rs9533839的延伸引物序列為SEQ ID No:42 ; rsl7019472的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ; rs 10182004的延伸引物序列為SEQ ID No :48 ; rs9461938的延伸引物序列為SEQ ID No:51 ; rs72759270的延伸引物序列為SEQ ID No:54 ; rsl886441的延伸引物序列為SEQ ID No:57。
4. 權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)志物在制備非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒中的 應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的SNP標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物在制備非綜合征型先天性心臟病輔 助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求3所述的SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物在制備非綜合征型先天性心臟病輔 助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7. -種非綜合征型先天性心臟病輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測外 周血 DNA 中 rs3789612、rs4140836、rsl3391263、rsl3101737、rsl400558、rs6872396、 rsl3189951、rs9266596、rs2433752、rs7259736、rs490514、rs2474937、rsl531070、 rs9533839、rsl7019472、rsl0182004、rs9461938、rs72759270 和 rsl886441。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權(quán)利要求2所述SNP 標(biāo)志物的特異性擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求3所述SNP標(biāo)志物的特異性延伸引物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR技術(shù)常用的 試劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104195228SQ201410351665
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】胡志斌, 沈洪兵, 沙家豪, 陳亦江, 林苑, 倪碧嫻 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)