一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟：A.清洗；B.高溫處理；C.發(fā)酵；D.除雜酶解；E.第一道大米蛋白的制備；F.第二道大米蛋白的制備；G.大米免疫肽的制備；H.低蛋白大米干燥；所述方法所得到的低蛋白大米，粒度完整，口感與普通大米接近，保證了大米免疫肽的高提取率和高純度，所制備的大米免疫肽具有增強(qiáng)免疫力等效果，為大米資源廣泛應(yīng)用奠定了重要的基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大米產(chǎn)品制備領(lǐng)域，尤其是一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的 方法。 一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法

【背景技術(shù)】
[0002] 大米蛋白以其較高的生物利用率、合理的氨基酸組成、特有的低敏性等特點(diǎn)被認(rèn) 為是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，在各種糧食中均居第一位，與牛乳、豆類蛋白相比更適合于飼料、嬰幼兒、 老年人及特殊人群。但由于大米內(nèi)僅含有約8%的蛋白質(zhì)，且胚乳細(xì)胞中的淀粉顆粒和蛋白 質(zhì)結(jié)合緊密，造成提取成本高、難度大等問(wèn)題，目前關(guān)于功能性大米產(chǎn)品的研究也不是很深 入。
[0003] 在一定條件下，蛋白經(jīng)酶解可以得到多種生物活性肽，分別具有降低血壓、調(diào)節(jié)免 疫力、增強(qiáng)食品風(fēng)味、抗氧化作用等功能。它們大多以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈中，一 旦經(jīng)過(guò)酶解成為適當(dāng)長(zhǎng)度的肽，就可表現(xiàn)出調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的生理活性并保持低過(guò)敏性。 在已獲得的生物活性肽中，動(dòng)物源活性肽占大多數(shù)而植物源活性肽逐漸成為研究的新亮 點(diǎn)，免疫活性肽是一類促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化和成熟，轉(zhuǎn)移免疫信息，抗腫瘤和抗菌作用的活性 肽。目前已有研究表明，從大米蛋白水解物中獲得的免疫活性肽具有促進(jìn)平滑肌收縮、刺激 體外人血白細(xì)胞吞噬活性、刺激白細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子的作用。
[0004] 目前，我國(guó)對(duì)于大米免疫肽的研究還處于初步階段，大部分研究方法是采用的將 大米粉碎、磨漿并通過(guò)蛋白酶酶解制備大米活性肽的方法，如CN102229643A公開了一種高 純度大米蛋白和高純度大米肽的制備方法，是以大大米或碎大米為原料，通過(guò)堿提酸沉方 法制備大米蛋白粗品基礎(chǔ)上，通過(guò)復(fù)合酶除雜制備高純度大米蛋白，再經(jīng)復(fù)合蛋白酶作用 和交替式酶解超濾偶聯(lián)技術(shù)制備大米肽。CN103555795A公開了一種聯(lián)產(chǎn)高純度大米淀粉和 大米蛋白的方法，是以大米為原料，通過(guò)洗大米、浸泡磨漿、酶解及沉降分離等步驟處理后， 得到高純度的大米蛋白產(chǎn)品，再經(jīng)堿性蛋白酶和乙醇純化、分離和干燥后得到高純度的大 米淀粉產(chǎn)品。在上述方法中，高純度大米蛋白和大大米肽的制備方法采用了酸堿提取大米 蛋白的方法，在食品生產(chǎn)中容易存在安全性問(wèn)題，且方法會(huì)產(chǎn)生大米副產(chǎn)物資源的浪費(fèi)；而 聯(lián)產(chǎn)高純度大米淀粉和大米蛋白的方法，雖然對(duì)大米淀粉和大米蛋白進(jìn)行了提純，但提純 后的大米淀粉在加工應(yīng)用上易受限制。加工制成的淀粉制品成本提高、口感與普通大米差 別大，很難滿足需要低蛋白飲食人群對(duì)大米風(fēng)味的需求。此外，國(guó)內(nèi)也有部分專利以大米渣 為原料制備大米活性肽，但由于大米渣成分復(fù)雜，提取難度較大，不易保證蛋白的提取率和 純度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的 方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0007] -種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0008] A.清洗：
[0009] 常溫下，將大米與水投入反應(yīng)容器中，大米和水的重量比為1:2?5,攪拌1?5分 鐘，排掉清洗液，重復(fù)清洗（1?5次），排掉清洗液，浙干大米；
[0010] B.高溫處理：
[0011] 將大米加入到60?100°C的水溶液中攪拌1?10分鐘，然后倒出洗液，加水冷卻 清洗，浙干大米（重復(fù)1?6次，洗液可回收）；
[0012] C.發(fā)酵：
[0013] 將大米、水、乳酸菌和乳酸添加到發(fā)酵容器中，其中大米和水的重量比為1:1? 6,控制每公斤發(fā)酵液中乳酸菌菌數(shù)為10 7?1013,乳酸添加量為每公斤發(fā)酵液中加50%? 80%乳酸50?500 μ L，發(fā)酵溫度為25?50°C，時(shí)間為8?20小時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)為發(fā)酵液pH 為3. 5?4. 5 ;發(fā)酵結(jié)束后將大米和發(fā)酵液分尚，大米用水清洗1?6次，將清洗液與發(fā)酵 液一并回收，采用135?150°C，滅菌4?6秒，即為發(fā)酵產(chǎn)酸溶出的蛋白溶液；
[0014] D.除雜酶解：
[0015] 向反應(yīng)容器中加入水，控制大米和水的質(zhì)量比例為1:1?6,采用淀粉酶、纖維素 酶和脂肪酶水解大米，其中淀粉酶投入量為大米重量〇. 05?0. 30%，反應(yīng)溫度為50? 65°C，反應(yīng)pH控制為5. 5?7.0,時(shí)間為10?60分鐘；纖維素酶投入量為大米重量的 0. 05?0. 30%，反應(yīng)溫度為35?50°C，pH控制為4. 0?6. 0,時(shí)間為1?4小時(shí)；脂肪酶 投入量為大米重量的〇. 05?0. 20%，反應(yīng)溫度為40?55°C，pH控制為6. 5?8. 0,時(shí)間為 1?4小時(shí)；酶解結(jié)束后，將酶解液放出，用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液一并回收；
[0016] E.第一道大米蛋白的制備：
[0017] 將步驟C、D反應(yīng)液及洗液合并，調(diào)節(jié)pH至5. 0?5. 5,用離心機(jī)2000?5000rpm 離心10?30分鐘，獲得沉淀；向沉淀中加入水和0. 02?0. 10%淀粉酶，于50?65°C酶解 10?30分鐘，經(jīng)相同離心方式離心，沉淀即為大米蛋白第一道產(chǎn)物；
[0018] F.第二道大米蛋白的制備：
[0019] 將步驟D處理后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:1?6,投入谷氨酰胺酶， 投入量為大米重量的〇. 05?0. 30%，反應(yīng)溫度為30?65°C，反應(yīng)pH控制為5. 0?7. 0,酶 解時(shí)間為1?3小時(shí)；投入蛋白酶，其中蛋白酶投入量為大米重量的0. 2?4. 0%，反應(yīng)溫度 為30?60°C，反應(yīng)pH控制為3. 5?8. 0,酶解時(shí)間為1?8小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后分離反應(yīng)液， 用水清洗大米兩次，將洗液與反應(yīng)液一并回收，獲得的大米即為低蛋白大米；然后將洗液與 反應(yīng)液用離心機(jī)2000?5000rpm離心10?30分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0020] G.大米免疫肽的制備：
[0021] 將步驟E得到的產(chǎn)物，與水混合，沉淀與水的質(zhì)量比例為1:1?6,用蛋白酶進(jìn)行酶 解，蛋白酶投入量為水重的〇. 2?4. 0%，反應(yīng)溫度為30?60°C，pH控制為3. 5?8. 0,時(shí) 間為1?6小時(shí)；酶解結(jié)束后，將反應(yīng)溶液用離心機(jī)2000?5000rpm離心10?30分鐘，取 上清液后與步驟F得到的上清液混合，于90°C滅酶5?20min;將滅酶后的上清液經(jīng)超濾膜 系統(tǒng)和納濾膜分別進(jìn)行濃縮后，對(duì)濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得到固體粉末即為所述的大米免 疫肽；
[0022] H.低蛋白大米干燥：
[0023] 將得到的低蛋白大米用水清洗干凈后，進(jìn)行干燥。
[0024] 上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所得干燥后低蛋白大米取部分烘 干至干基狀態(tài)，粉碎用于檢測(cè)干基中蛋白含量。
[0025] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌為乳桿菌屬。
[0026] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌為植物乳桿 菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和德氏乳桿菌中的任意一種或兩 種。
[0027] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌為植物乳桿 菌時(shí)，可提供好氧條件，即1公斤大米和發(fā)酵液的混合物的無(wú)菌空氣通入量為〇. 5?2L/ min〇
[0028] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌為植物乳桿 菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和德氏乳桿菌在兩種組合使用時(shí)， 二者菌數(shù)控制在1?2:2?1之間。
[0029] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述大米原料可以替換 為薏米、高粱米、黑米、大麥或燕麥。
[0030] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述淀粉酶、纖維素酶和 脂肪酶的添加順序是依次加入到料液中，當(dāng)一種酶作用結(jié)束后再投入另一種，并保證每種 酶在其適宜的溫度和pH下酶解。
[0031] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步驟E得到的沉淀 可與水混合，然后重復(fù)步驟E方法2?3次，取最終沉淀。
[0032] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述蛋白酶為來(lái)自動(dòng)物 的胰蛋白酶、胃蛋白酶，來(lái)自植物的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，以及來(lái)自微生物發(fā)酵的酸性 蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶中的任意兩種或三種；當(dāng)采用兩種混合酶時(shí)， 其中二者質(zhì)量比例控制在1?5:5?1之間，當(dāng)采用三種混合酶時(shí)，其中三者質(zhì)量比例控制 在1?5:5?1:5?1之間，且分步加入，反應(yīng)從始至終保證每種蛋白酶作用的pH及溫度。
[0033] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步驟G中超濾膜其 截留分子量為3000?6000Da，納濾膜其截留分子量為200?600Da ;采用的噴霧干燥方法， 噴霧干燥控制進(jìn)風(fēng)溫度為160?210°C，出口溫度為60?90°C。
[0034] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步驟Η得到的低蛋 白大米干燥的方式為在60?105°C條件下烘干，所述烘干方式為恒溫干燥、真空干燥、蒸汽 烘干或微波干燥的任意一種或任意兩種，控制產(chǎn)品水分含量在14%以內(nèi)。
[0035] 優(yōu)選的，上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，為了證明大米免疫肽可 顯著地提高機(jī)體的免疫能力，用所獲得的大米免疫肽粉對(duì)昆明種小鼠進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)，檢測(cè) 小鼠抗體生成細(xì)胞含量（PFC);同時(shí)，利用體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大米免疫肽對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬 能力的影響。具體方法為：將腹腔注射綿羊紅細(xì)胞（SRBC)的大米免疫肽灌胃小鼠進(jìn)行眼 球取血處死，調(diào)整脾細(xì)胞濃度與10%豚鼠血清補(bǔ)體和0. 2% SRBC混合，37°C水浴1小時(shí)，離 心，上清在413nm處的吸光值表示抗體生成細(xì)胞含量；取正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，于細(xì)胞板 中37°C培養(yǎng)至貼壁生長(zhǎng)，離心去上清，加入大米免疫肽刺激培養(yǎng)24小時(shí)，離心去上清，加入 FITC標(biāo)記的熱滅活大腸桿菌液，培養(yǎng)1小時(shí)，終止吞噬后，低溫離心，沉淀用PBS洗滌混勻， 在485nm激發(fā)光和530nm發(fā)射光下測(cè)定吞噬及表面熒光總和，經(jīng)后續(xù)處理測(cè)定表面熒光值， 分析巨噬細(xì)胞吞噬能力。
[0036] 本發(fā)明的有益效果是：
[0037] 上述同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法所得到的低蛋白大米，粒度完整， 口感與普通大米接近，可適用于腎病和PKU患者的低蛋白飲食，緩解病情；也可用于釀酒、 大米加工食品等；所制備的高提取率和高純度的大米免疫肽，適用于老年人、嬰幼兒以及免 疫力低下人群食用，應(yīng)用于乳豬、犢牛、水產(chǎn)養(yǎng)殖等畜牧業(yè)飼料中具有增強(qiáng)免疫力、增加食 量和提高生長(zhǎng)速度等效果；本發(fā)明所述制備方法為大米資源廣泛應(yīng)用于功能性食品、醫(yī)用 食品、畜牧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了重要的基礎(chǔ)，可增加大米的整體經(jīng)濟(jì)效益和功能性效益。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0041] A.普通大米，投入反應(yīng)容器中，加入約3倍重量的水，攪拌1分鐘，倒掉清洗液，重 復(fù)3次；
[0042] B.將大米用80°C水?dāng)嚢杼幚?min，去除浸泡水，加水冷卻2次，將每次倒出的洗液 進(jìn)行回收備用；
[0043] C.將大米、水、植物乳桿菌添加到發(fā)酵容器中，大米和水的質(zhì)量比為1:2,控制每 公斤發(fā)酵液中植物乳桿菌數(shù)為8X 10^80%乳酸添加100 μ L，發(fā)酵溫度為37°C，發(fā)酵時(shí)間 16小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程通入無(wú)菌空氣，1公斤大米和發(fā)酵液的混合物通氣量為1. 2L/min ;發(fā)酵結(jié) 束后分離大米和發(fā)酵液，清洗大米3次，將發(fā)酵液與洗液于135°C滅菌4秒；
[0044] D.大米與3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶水解大米，其中淀粉 酶投入大米量的〇. 10%，反應(yīng)溫度為55°C，pH控制為6.0,酶解40分鐘；纖維素酶投入大米 量的0. 05%，于40°C，pH4. 5,酶解1. 5小時(shí)；脂肪酶投入大米量的0. 10%，于45°C，pH6. 5， 酶解1. 5小時(shí)；酶解結(jié)束后，將酶解液取出，用水清洗大米兩次，洗液與酶解液一并回收；
[0045] E.將步驟B、C、D反應(yīng)液及洗液合并，調(diào)節(jié)pH至5. 0,用離心機(jī)4000rpm低溫離心 15分鐘，獲得沉淀，向沉淀中加入水和0. 05 %淀粉酶，于55 °C酶解20分鐘，再經(jīng)相同條件離 心，沉淀即為第一道大米蛋白產(chǎn)物；
[0046] F.將步驟D處理后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:2,投入大米重量 0. 10%的谷氨酰胺酶，于45°C，pH7. 0,酶解2小時(shí)；投入質(zhì)量為大米重量的0. 4%胰蛋白酶， 反應(yīng)溫度為45°C，pH8. 0,酶解2小時(shí)；再加入0. 8%菠蘿蛋白酶，反應(yīng)溫度為45°C，pH6. 5， 酶解4小時(shí)；再加入0. 2%酸性蛋白酶，反應(yīng)溫度為45°C，pH3. 5,酶解2小時(shí)，分離酶解液， 用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液回收，剩下的大米即為低蛋白大米；然后將洗液與酶解 液用離心機(jī)4000rpm離心15分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0047] G.將步驟E得到的產(chǎn)物與水混合，沉淀與水的質(zhì)量比例為1:3,用0. 3 %胰蛋白 酶和0. 6 %菠蘿蛋白酶進(jìn)行酶解，反應(yīng)條件與上步蛋白酶解相同；結(jié)束后，酶解液用離心 機(jī)4000rpm離心15分鐘，取上清液后與步驟F得到的上清液于90°C滅酶15min ;上清液經(jīng) 3000Da超濾膜系統(tǒng)和200Da納濾膜分別進(jìn)行濃縮后，對(duì)濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫 度為180°C，出風(fēng)溫度為80°C，即得固體粉末即為大米免疫肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)大米免疫肽提取率為 85. 9%，純度為 90. 1% ;
[0048] H.對(duì)低蛋白大米用水清洗后于微波烘干，至大米水含量低于13%，經(jīng)凱氏定氮法 測(cè)定，大米中蛋白去除率為95 %。經(jīng)免疫活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)證明，大米免疫肽灌胃的受試小鼠組 與對(duì)照組相比，抗體生成細(xì)胞含量（PFC)提高15% (P〈0. 05);經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大米免 疫肽可使腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力提高10% (P〈〇. 05)，表明大米免疫肽可顯著地提高機(jī)體 的免疫能力。
[0049] 實(shí)施例2
[0050] -種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0051] A.黑米投入反應(yīng)容器中，加入約2倍重量的水，攪拌3分鐘，倒掉清洗液，重復(fù)3 次；
[0052] B.將黑米用70°C水?dāng)嚢杼幚?min，去除浸泡水，加水冷卻清洗3次，浙干黑米；
[0053] C.將黑米、水、德式乳桿菌和保加利亞乳桿菌添加到發(fā)酵容器中，黑米和水的質(zhì)量 比為1:3,控制每公斤發(fā)酵液中德式乳桿菌和保加利亞乳桿菌菌數(shù)各為1X 109,80%乳酸添 加150 μ L，發(fā)酵溫度為37°C，發(fā)酵時(shí)間12小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后分離黑米和發(fā)酵液，清洗黑米3 次，將清洗液與發(fā)酵液一并收回，將發(fā)酵液與洗液于140°C滅菌5秒，即為發(fā)酵產(chǎn)酸溶出的 蛋白溶液；
[0054] D.黑米與3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶水解黑米，其中淀粉 酶投入黑米量的0. 10%，反應(yīng)溫度為60°C，pH控制為6. 0,酶解30分鐘；纖維素酶投入黑米 量的0. 07%，于42°C，pH4. 5,酶解1. 5小時(shí)；脂肪酶投入黑米量的0. 05%，于45°C，pH7. 0， 酶解1. 5小時(shí)；酶解結(jié)束后，將酶解液取出，用水清洗黑米兩次，洗液與酶解液一并回收；
[0055] E.將步驟C、D反應(yīng)液及洗液合并，調(diào)節(jié)pH至5. 0,用離心機(jī)4000rpm離心20分 鐘，獲得沉淀，向沉淀中加入水和〇. 05%淀粉酶，于55°C酶解20分鐘，再經(jīng)相同條件離心， 沉淀即為黑米蛋白第一道產(chǎn)物；
[0056] F.將酶解后的黑米與水混合，黑米與水的重量比為1:3,投入米量0.05%的谷氨 酰胺酶，于45°C，pH6. 0,酶解2小時(shí)；投入質(zhì)量為黑米重量的0. 5 %酸性蛋白酶，反應(yīng)溫度 為45°C，pH3. 5,酶解3小時(shí)；再加入1. 0%堿性蛋白酶，反應(yīng)溫度為42°C，pH8. 0,酶解3小 時(shí)，分離酶解液，用水清洗黑米兩次，將洗液與酶解液回收，剩下的黑米即為低蛋白黑米；然 后將洗液與酶解液用離心機(jī)4000rpm離心20分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0057] G.將步驟E得到的產(chǎn)物與水混合，沉淀與水的質(zhì)量比例為1:3,用0. 3 %的酸性 蛋白酶和〇. 4%的堿性蛋白酶酶解，反應(yīng)條件與上步蛋白酶解相同；結(jié)束后，酶解液用離心 機(jī)4000rpm離心20分鐘，取上清液后與步驟F得到的上清液于90°C滅酶15min ;上清液經(jīng) 5000Da超濾膜系統(tǒng)和300Da納濾膜系統(tǒng)分別進(jìn)行濃縮后，對(duì)濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn) 風(fēng)溫度為200°C，出風(fēng)溫度為70°C，即得固體粉末即為免疫肽。經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定黑米免疫 肽提取率為78%，純度為88. 7% ;
[0058] H.對(duì)低蛋白黑米用水清洗后于70°C真空干燥，至黑米水含量低于12%，經(jīng)凱氏定 氮法測(cè)定，黑米中蛋白去除率為89. 6%。經(jīng)免疫活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)證明，黑米免疫肽灌胃的受 試小鼠組與對(duì)照組相比，抗體生成細(xì)胞含量（PFC)提高14% (P〈0. 05);經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示，黑米免疫肽可使腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力提高10% (P〈〇. 05)，表明黑米免疫肽可有效地 提1?機(jī)體的免疫能力。
[0059] 實(shí)施例3
[0060] -種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0061] A.普通大米，投入反應(yīng)容器中，加入約2倍重量的水，攪拌1分鐘，倒掉清洗液，重 復(fù)3次；
[0062] B.將大米用60°C水?dāng)嚢杼幚?min，去除浸泡水，加水冷卻2次；
[0063] C.將大米、水、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌添加到發(fā)酵容器中，大米和水的質(zhì)量 比為1:2,控制每公斤發(fā)酵液中嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌菌數(shù)各為1X 109,80%乳酸添 加100 μ L，發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵時(shí)間10小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后分離大米和發(fā)酵液，清洗大米 2次，將發(fā)酵液與洗液于150°C滅菌4秒；
[0064] D.大大米與3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶水解大米，其中淀 粉酶投入大米量的〇. 05%，反應(yīng)溫度為55 °C，pH控制為6. 0,酶解30分鐘；纖維素酶投入大 米量的0. 05%，于40°C，pH4. 5,酶解1小時(shí)；脂肪酶投入大米量的0. 05%，于45°C，pH6. 5， 酶解1小時(shí)。酶解結(jié)束后，將酶解液取出，用水清洗大米兩次，洗液與酶解液回收；
[0065] E.將步驟C、D反應(yīng)液及洗液合并，調(diào)節(jié)pH至5. 0,用離心機(jī)5000rpm低溫離心10 分鐘，獲得沉淀，向沉淀中加入水和〇. 02%淀粉酶，于55°C酶解20分鐘，再經(jīng)相同條件離 心，沉淀即為第一道大米蛋白產(chǎn)物。
[0066] F.將酶解后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:3,投入大米重量0.05%的 谷氨酰胺酶，于45°C，pH7. 0,酶解1小時(shí)；投入質(zhì)量為大米重量的0. 4%酸性蛋白酶，反應(yīng)溫 度為451：，？!13.5，酶解2小時(shí)；再加入0.8(%堿性蛋白酶，反應(yīng)溫度為421：，？!18.0，酶解4 小時(shí)，分離酶解液，用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液回收，剩下的大米即為低蛋白大米。 然后將洗液與酶解液用離心機(jī)5000rpm離心10分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0067] G.將步驟E得到的產(chǎn)物與水混合，沉淀與水的質(zhì)量比例為1:3,用0. 2 %酸性蛋 白酶和0. 4%堿性蛋白酶酶解，反應(yīng)條件與上步蛋白酶解相同。結(jié)束后，酶解液用離心機(jī) 5000rpm離心10分鐘，取上清液后與步驟F得到的上清液于90°C滅酶lOmin。上清液經(jīng) 5000Da超濾膜系統(tǒng)和300Da納濾膜系統(tǒng)分別進(jìn)行濃縮后，對(duì)濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn) 風(fēng)溫度為180°C，出風(fēng)溫度為80°C，即得固體粉末即為大米免疫肽，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定大米 免疫肽提取率為74%，純度為87. 3% ;
[0068] H.對(duì)低蛋白大米用水清洗后于70°C真空干燥，至大米水含量低于14%，經(jīng)凱氏定 氮法測(cè)定，大米中蛋白去除率為82. 5%。經(jīng)免疫活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)證明，大米免疫肽灌胃的受 試小鼠組與對(duì)照組相比，抗體生成細(xì)胞含量（PFC)提高10% (P〈0. 05);經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示，大米免疫肽可使腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力提高10. 5% (P〈0. 05)，表明大米免疫肽可有效 地提高機(jī)體的免疫能力。
[0069] 實(shí)施例4
[0070] -種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具體步驟如下：
[0071] A.普通大米，投入反應(yīng)容器中，加入約2倍重量的水，攪拌4分鐘，倒掉清洗液，重 復(fù)3次；
[0072] B.將大米用80°C水?dāng)嚢杼幚?min，去除浸泡水，加水冷卻2次；
[0073] C.將大米、水、短乳桿菌和干酪乳桿菌添加到發(fā)酵容器中，大米和水的質(zhì)量比為 1:2,控制每公斤發(fā)酵液中短乳桿菌和干酪乳桿菌菌數(shù)各為2 X 109, 80%乳酸添加100 μ L， 發(fā)酵溫度為37°C，發(fā)酵時(shí)間14小時(shí)；發(fā)酵結(jié)束后分離大米和發(fā)酵液，清洗大米3次，將發(fā)酵 液與洗液于135°C滅菌4秒。淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶的條件及步驟（C、D、E)同實(shí)施例 3 ；
[0074] F.將酶解后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:3,投入大米重量0.04%的 谷氨酰胺酶，于45°C，pH7. 0,酶解1小時(shí)；投入質(zhì)量為大米重量的0. 6%木瓜蛋白酶，反應(yīng)溫 度為50°C，pH7. 0,酶解3小時(shí)；再加入1. 0%堿性蛋白酶，反應(yīng)溫度為45°C，pH8. 0,酶解5 小時(shí)，分離酶解液，用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液回收，剩下的大米即為低蛋白大米。 然后將洗液與酶解液用離心機(jī)，5000rpm離心10分鐘，取上清液，棄除沉淀；
[0075] G.將步驟E得到的產(chǎn)物與水混合，沉淀與水的質(zhì)量比例為1:2,用0. 2%木瓜蛋白 酶和0. 5%堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，反應(yīng)條件與上步蛋白酶解相同。結(jié)束后，酶解液用離心機(jī) 5000rpm離心10分鐘，取上清液后與步驟F得到的上清液于90°C滅酶15min。上清液經(jīng) 3000Da超濾膜系統(tǒng)和300Da納濾膜系統(tǒng)分別進(jìn)行濃縮后，對(duì)濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn) 風(fēng)溫度為200°C，出風(fēng)溫度為90°C，即得固體粉末即為大米免疫肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定大米免疫肽 提取率為80 %，純度為88% ;
[0076] H.對(duì)低蛋白大米用水清洗后用微波干燥，至大米水含量低于14%，經(jīng)凱氏定氮法 測(cè)定，大米中蛋白去除率為88. 9%。經(jīng)免疫活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)證明，大米免疫肽灌胃的受試小鼠 組與對(duì)照組相比，抗體生成細(xì)胞含量（PFC)提高13% (P〈0. 05);經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大米 免疫肽可使腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力提高11.5% (P〈0. 05)，表明大米免疫肽可有效地提高 機(jī)體的免疫能力。
[0077] 工藝分析：
[0078] 上述一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，首先，采用高溫處理結(jié)合乳 酸菌發(fā)酵，去除雜菌并穩(wěn)定大米粒型；同時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸具有α -羥基結(jié)構(gòu)的羧酸，能與 多肽鏈上的基團(tuán)形成氫鍵，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶出；其次，利用多步聯(lián)合酶解，通透大米胚 乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)，將與淀粉、纖維素和脂肪緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)釋放到料液中并除去這三種雜質(zhì)； 利用谷氨酰胺酶和蛋白酶分別對(duì)大米粒中的蛋白質(zhì)進(jìn)行改性（增加溶解度）和切割，充分 提取大米蛋白并水解成多肽。整個(gè)工藝促進(jìn)了大米整蛋白的析出和分離，保證了大米蛋白 酶解的穩(wěn)定性，利于肽的提取和純化。
[0079] 該工藝與傳統(tǒng)方法相比，利用了乳酸菌發(fā)酵和多步酶解，條件溫和、安全，免去了 堿溶酸沉帶來(lái)的營(yíng)養(yǎng)流失、雜質(zhì)干擾以及安全問(wèn)題，該方法制備的大米免疫肽提取率高，達(dá) 85%以上，純度達(dá)90%以上，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，受試小鼠組的抗體生成細(xì)胞含量（PFC)和腹腔巨噬細(xì) 胞吞噬能力各提高了 15%和10% (Ρ〈0. 05)，證明大米免疫肽可顯著地提高機(jī)體的免疫能 力。在寵物飼料、乳仔豬料、高檔水產(chǎn)料、犢牛代奶粉中添加可代替動(dòng)物蛋白制品，有利于提 高幼崽對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收、增強(qiáng)免疫力、增加食量和提高生長(zhǎng)速度等效果，對(duì)飼用植物蛋白的產(chǎn) 業(yè)化具有巨大的市場(chǎng)利用價(jià)值。此外，還獲得了蛋白去除率達(dá)95%的低蛋白大米，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明該大米能保持良好的完整性，烘干后不易碎，蒸制后在口感和風(fēng)味上與普通大米接近， 適用于慢性腎病患者和PKU患者。
[0080] 上述參照實(shí)施例對(duì)該一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法進(jìn)行的詳細(xì) 描述，是說(shuō)明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離
【權(quán)利要求】
1. 一種同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：具體步驟如下： A. 清洗： 常溫下，將大米與水投入反應(yīng)容器中，大米和水的重量比為1:2?5,攪拌1?5分鐘， 排掉清洗液，重復(fù)清洗1?5次，排掉清洗液，浙干大米； B. 高溫處理： 將大米加入到60?100°C的水溶液中攪拌1?10分鐘，然后倒出洗液，加水冷卻清洗， 浙干大米，重復(fù)1?6次，洗液可回收； C. 發(fā)酵： 將大米、水、乳酸菌和乳酸添加到發(fā)酵容器中，其中大米和水的重量比為1:1?6,控制 每公斤發(fā)酵液中乳酸菌菌數(shù)為1〇7?1〇13,乳酸添加量為每公斤發(fā)酵液中加50%?80%乳 酸50?500 μ L，發(fā)酵溫度為25?50°C，時(shí)間為8?20小時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)為發(fā)酵液pH為3. 5? 4. 5 ;發(fā)酵結(jié)束后將大米和發(fā)酵液分尚，大米用水清洗1?6次，將清洗液與發(fā)酵液一并回 收，采用135?150°C，滅菌4?6秒，即為發(fā)酵產(chǎn)酸溶出的蛋白溶液； D. 除雜酶解： 向反應(yīng)容器中加入水，控制大米和水的質(zhì)量比例為1:1?6,采用淀粉酶、纖維素酶和 脂肪酶水解大米，其中淀粉酶投入量為大米重量〇. 05?0. 30%，反應(yīng)溫度為50?65°C， 反應(yīng)pH控制為5. 5?7. 0,時(shí)間為10?60分鐘；纖維素酶投入量為大米重量的0. 05? 0. 30%，反應(yīng)溫度為35?50°C，pH控制為4. 0?6. 0,時(shí)間為1?4小時(shí)；脂肪酶投入量為 大米重量的0. 05?0. 20%，反應(yīng)溫度為40?55°C，pH控制為6. 5?8. 0,時(shí)間為1?4小 時(shí)；酶解結(jié)束后，將酶解液放出，用水清洗大米兩次，將洗液與酶解液一并回收； E. 第一道大米蛋白的制備： 將步驟C、D反應(yīng)液及洗液合并，調(diào)節(jié)pH至5. 0?5. 5,用離心機(jī)2000?5000rpm離心 10?30分鐘，獲得沉淀；向沉淀中加入水和0. 02?0. 10 %淀粉酶，于50?65°C酶解10? 30分鐘，經(jīng)相同離心方式離心，沉淀即為第一道大米蛋白產(chǎn)物； F. 第二道大米蛋白的制備： 將步驟D處理后的大米與水混合，大米與水的重量比為1:1?6,投入谷氨酰胺酶，投入 量為大米重量的〇. 05?0. 30%，反應(yīng)溫度為30?65°C，反應(yīng)pH控制為5. 0?7. 0,酶解時(shí) 間為1?3小時(shí)；投入蛋白酶，其中蛋白酶投入量為大米重量的0. 2?4. 0%，反應(yīng)溫度為 30?60°C，反應(yīng)pH控制為3. 5?8.0,酶解時(shí)間為1?8小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后分離反應(yīng)液，用 水清洗大米兩次，將洗液與反應(yīng)液一并回收，獲得的大米即為低蛋白大米；然后將洗液與反 應(yīng)液用離心機(jī)2000?5000rpm離心10?30分鐘，取上清液，棄除沉淀； G. 大米免疫肽的制備： 將步驟E得到的產(chǎn)物與水混合，沉淀與水的質(zhì)量比例為1:1?6,用蛋白酶進(jìn)行酶解， 蛋白酶投入量為水重的〇. 2?4. 0%，反應(yīng)溫度為30?60°C，pH控制為3. 5?8. 0,時(shí)間為 1?6小時(shí)；酶解結(jié)束后，將反應(yīng)溶液用離心機(jī)2000?5000rpm離心10?30分鐘，取上清 液后與步驟F得到的上清液混合，于90°C滅酶5?20min ;將滅酶后的上清液經(jīng)超濾膜系 統(tǒng)和納濾膜分別進(jìn)行濃縮后，對(duì)濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得到固體粉末即為所述的大米免疫 肽； H. 低蛋白大米干燥： 將得到的低蛋白大米用水清洗干凈后，進(jìn)行干燥。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述乳酸菌為乳桿菌屬。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述乳酸菌為植物乳桿菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和德氏乳桿 菌中的任意一種或兩種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述乳酸菌為植物乳桿菌、短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和德氏乳桿 菌在兩種組合使用時(shí)，二者菌數(shù)控制在1?2:2?1之間。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述原料大米可以替換為薏米、高粱米、黑米、大麥或燕麥。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶的添加順序是依次加入到料液中，當(dāng)一種酶作用結(jié)束后再投 入另一種，并保證每種酶在其適宜的溫度和pH下酶解。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述步驟E得到的沉淀可與水混合，然后重復(fù)步驟E方法2?3次，取最終沉淀。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述蛋白酶為胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性 蛋白酶、復(fù)合蛋白酶中的任意兩種或三種；當(dāng)采用兩種混合酶時(shí)，其中二者質(zhì)量比例控制在 1?5:5?1之間，當(dāng)采用三種混合酶時(shí)，其中三者質(zhì)量比例控制在1?5:5?1:5?1之 間，且分步加入，反應(yīng)從始至終保證每種蛋白酶作用的pH及溫度。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述步驟G中超濾膜其截留分子量為3000?6000Da，納濾膜其截留分子量為200?600Da ; 采用的噴霧干燥方法，噴霧干燥控制進(jìn)風(fēng)溫度為160?210°C，出口溫度為60?90°C。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)制備低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所 述步驟Η得到的低蛋白大米干燥的方式為在60?105°C條件下烘干，所述烘干方式為恒溫 干燥、真空干燥、蒸汽烘干或微波干燥的任意一種或任意兩種，控制產(chǎn)品水分含量在14%以 內(nèi)。
【文檔編號(hào)】A23L1/10GK104082673SQ201410352958
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】吳樂(lè)斌, 劉漢民, 常繼辰, 劉紅彥 申請(qǐng)人:中恩（天津）營(yíng)養(yǎng)科技有限公司