利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標(biāo)記的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標(biāo)記的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：1)遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建；2)球孢白僵菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化；3)PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立；4)平均轉(zhuǎn)化效率分析；5)PCR檢測；6)熒光觀察。本發(fā)明利用抗殺菌劑萎銹靈基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，成功進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到26個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA，拓寬了球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記基因范圍，解決bar基因存在的安全性問題。
【專利說明】利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標(biāo)記的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標(biāo)記的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法。

【背景技術(shù)】
[0002]球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一種致病性與適應(yīng)性很強(qiáng),且寄主范圍廣的昆蟲病原真菌，已被作為昆蟲真菌制劑廣泛用于玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育種過程中，啟動(dòng)子是外源或內(nèi)源基因?qū)胄实闹匾蛩刂弧?br> [0003]目前，球孢白僵菌的遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記主要為抗草甘膦基因bar，但對(duì)于bar基因的環(huán)境安全性問題一直存在爭論，因此，開發(fā)一種新篩選標(biāo)記能夠?yàn)榍蜴甙捉┚z傳轉(zhuǎn)化提供更多的選擇，為球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育種奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標(biāo)記的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法。其具體技術(shù)方案為:
[0005]一種利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標(biāo)記的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:
[0006]I)遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建:利用NotI和NodI限制性內(nèi)切酶對(duì)otef:CAR載體和PF載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切并連接，將抗萎銹靈基因carboxin構(gòu)建到pgpdA為啟動(dòng)子,含有綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記基因，TtrpC為終止子的遺傳轉(zhuǎn)化載體上，構(gòu)建PgpdA:car:GFP轉(zhuǎn)化載體；
[0007]2)球孢白僵菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
[0008]原生質(zhì)體的獲得
[0009](I)將培養(yǎng)好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體；
[0010](2)滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mL EP管中；
[0011](3)在EP管中加入4mL的LB液體培養(yǎng)基，8 μ L β _巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
[0012](4)28°C 下 100r/min 培養(yǎng) 20_25min ；
[0013](5)將小管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次；
[0014](6)用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩；
[0015](7)28°C下100r/min培養(yǎng)lh，并鏡檢觀察，此時(shí)視野中應(yīng)得到透明圓球狀的原生質(zhì)體；
[0016]萎銹靈抗性濃度的篩選
[0017]將制備的原生質(zhì)體分別涂布于含有不同濃度梯度萎銹靈的查氏培養(yǎng)基上，萎銹靈濃度分別為0.5、l、2、3、4mg/ml培養(yǎng)基，并設(shè)置不含萎銹靈的培養(yǎng)基為對(duì)照，26°C培養(yǎng)48h后，觀察菌落生長情況；
[0018]3) PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立
[0019](I)將得到的原生質(zhì)體懸液吸取400 μ L到三個(gè)新的EP管中，做好標(biāo)記，分別為CK對(duì)照和PgpdA: car: GFP質(zhì)粒；
[0020](2)對(duì)應(yīng)管中分別加入1(^^^)(^:0&1':6--質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度60.5呢/^1^，冰浴20min ；
[0021](3)每個(gè)管中各加入100 μ L PEG4000溶液，混勻，冰浴20min ；
[0022](4)各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min ；
[0023](5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋；
[0024](6)吸200 μ L于軟瓊脂平板上，封口標(biāo)記，于28°C恒溫箱培養(yǎng)24h ；
[0025](7)將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復(fù)吸打；吸出100 μ L均勻涂在帶有萎銹靈抗性的查氏培養(yǎng)基上，于28°C恒溫箱培養(yǎng)并觀察；
[0026]4)平均轉(zhuǎn)化效率分析
[0027](I)對(duì)PgpdA:car:GFP載體進(jìn)行球孢白僵菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化,每個(gè)載體轉(zhuǎn)化5個(gè)平板；
[0028](2)轉(zhuǎn)化后對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，取平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
[0029]轉(zhuǎn)化子的PCR檢測及熒光觀察
[0030](I)利用滅菌環(huán)將查氏培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子小心挑出，在提前準(zhǔn)備的PDA平板上畫多個(gè)“Z”字，分別標(biāo)記為轉(zhuǎn)PgpdA:car:GFP和CK ；
[0031](2)將劃好的平板置于26°C恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3d ;
[0032](3)此時(shí)得到轉(zhuǎn)化子第一代，繼續(xù)挑出孢子劃線在新的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d得到第二代孢子；
[0033](4)同上述過程 ，得到第三代轉(zhuǎn)化子孢子，在超凈工作臺(tái)中挑出，置于SDY培養(yǎng)基中搖2-3d ；
[0034]5) PCR檢測:利用氯化芐法提取球孢白僵菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA，然后利用基因組做模版，利用GFP基因特異性引物，進(jìn)行PCR及電泳檢測；
[0035]6)熒光觀察:菌絲從PDA上刮下后置于SDAY培養(yǎng)基中搖三天，將實(shí)驗(yàn)控制在相同的培養(yǎng)條件及時(shí)間，在培養(yǎng)第48h置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
[0036]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0037]本發(fā)明篩選了球孢白僵菌對(duì)萎銹靈的最佳抗性濃度，并進(jìn)行了萎銹靈抗性的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得含GFP的陽性轉(zhuǎn)化子。利用抗殺菌劑萎銹靈基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，成功進(jìn)行球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到26個(gè)轉(zhuǎn)化子/y gDNA，拓寬了球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記基因范圍，解決bar基因存在的安全性問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1 是 PgpdA: car: GFP 載體圖譜；
[0039]圖2是球孢白僵菌原生質(zhì)體顯微鏡觀察效果圖；
[0040]圖3是；球孢白僵菌抗萎銹靈最佳濃度篩選；
[0041]圖4是轉(zhuǎn)PgpdA:car:GFP載體的球孢白僵菌轉(zhuǎn)化子圖片，圖4a是陽性轉(zhuǎn)化子，圖4b是對(duì)照；
[0042]圖5是轉(zhuǎn)化子PCR檢測；
[0043]泳道I為陰性對(duì)照，泳道2為陽性對(duì)照，泳道3-7轉(zhuǎn)PgpdA:car:GFP基因樣品檢測；
[0044]圖6是轉(zhuǎn)PgpdA:car:GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子熒光顯微檢測結(jié)果圖，其中，圖6 (a)為熒光下；圖6(b)為白光下；圖6(c)為合成光下。

【具體實(shí)施方式】
[0045]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0046]I實(shí)驗(yàn)方法:
[0047]1.1遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建:將抗萎銹靈基因carboxin構(gòu)建到pgpdA為啟動(dòng)子,含有綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記基因，TtrpC為終止子的遺傳轉(zhuǎn)化載體上，構(gòu)建PgpdA:car:GFP轉(zhuǎn)化載體。
[0048]1.2球孢白僵菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
[0049]原生質(zhì)體的獲得
[0050](I)將培養(yǎng)好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體；
[0051](2)滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mLEP管中；
[0052](3)在EP管中加入4mL的LB液體培養(yǎng)基，8 μ L β -巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
[0053](4) 28 O 下 100r/min 培養(yǎng) 20_25min ；
[0054](5)將小管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次；
[0055](6)用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩；
[0056](7)28°C下100r/min培養(yǎng)Ih左右，并鏡檢觀察，此時(shí)視野中應(yīng)得到透明圓球狀的原生質(zhì)體。
[0057]萎銹靈抗性濃度的篩選
[0058]將制備的原生質(zhì)體分別涂布于含有不同濃度梯度萎銹靈的查氏培養(yǎng)基上，萎銹靈濃度分別為0.5、l、2、3、4mg/ml培養(yǎng)基，并設(shè)置不含萎銹靈的培養(yǎng)基為對(duì)照，26°C培養(yǎng)48h后，觀察菌落生長情況。
[0059]PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立
[0060](I)將得到的原生質(zhì)體懸液吸取400 μ L到三個(gè)新的EP管中，做好標(biāo)記，分別為CK對(duì)照和PgpdA: car: GFP質(zhì)粒；
[0061](2)對(duì)應(yīng)管中分別加入10 μ LPgpdA:car:GFP質(zhì)粒(質(zhì)粒濃度60.5ug/ μ L)冰浴20min ；
[0062](3)每個(gè)管中各加入100 μ L PEG4000溶液，混勻，冰浴20min ；
[0063](4)各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min ；
[0064](5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋；
[0065](6)吸200 μ L于軟瓊脂平板上，封口標(biāo)記，于28°C恒溫箱培養(yǎng)24h ；
[0066](7)將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復(fù)吸打。吸出100 μ L均勻涂在帶有萎銹靈抗性的查氏培養(yǎng)基上，于28°C恒溫箱培養(yǎng)并觀察。
[0067]平均轉(zhuǎn)化效率分析
[0068](I)對(duì)PgpdA:car:GFP載體進(jìn)行球孢白僵菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化,每個(gè)載體轉(zhuǎn)化5個(gè)平板；
[0069](2)轉(zhuǎn)化后對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，取平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
[0070]1.3轉(zhuǎn)化子的PCR檢測及熒光觀察
[0071](I)利用滅菌環(huán)將查氏培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子小心挑出，在提前準(zhǔn)備的PDA平板上畫多個(gè)“Z”字，分別標(biāo)記為轉(zhuǎn)PgpdA:car:GFP和CK。
[0072](2)將劃好的平板置于26°C恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3d。
[0073](3)此時(shí)得到轉(zhuǎn)化子第一代，繼續(xù)挑出孢子劃線在新的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d得到第二代孢子；
[0074](4)同上述過程，得到第三代轉(zhuǎn)化子孢子，在超凈工作臺(tái)中挑出，置于SDY培養(yǎng)基中搖2-3d。
[0075]PCR檢測:利用氯化芐法提取球孢白僵菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA，然后利用基因組做模版，利用GFP基因特異性引物，進(jìn)行PCR及電泳檢測。
[0076]熒光觀察:菌絲從PDA上刮下后置于SDAY培養(yǎng)基中搖三天，將實(shí)驗(yàn)控制在相同的培養(yǎng)條件及時(shí)間，在培養(yǎng)第48h置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
【權(quán)利要求】
1.一種利用抗萎銹靈基因carboxin為篩選標(biāo)記的球孢白僵菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建:利用NotI和NodI限制性內(nèi)切酶對(duì)otef:CAR載體和PF載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切并連接，將抗萎銹靈基因carboxin構(gòu)建到pgpdA為啟動(dòng)子，含有綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記基因，TtrpC為終止子的遺傳轉(zhuǎn)化載體上，構(gòu)建PgpdA:car:GFP轉(zhuǎn)化載體； 2)球孢白僵菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體的獲得 (1)將培養(yǎng)好的白僵菌菌液用漏斗過濾到空瓶中，留下濾布中得到的菌絲體； (2)滲透壓緩沖液洗滌2-3遍，并用小勺收集菌絲到6mLEP管中； (3)在EP管中加入4mL的LB液體培養(yǎng)基，8μ L β -巰基乙醇，搖菌絲，使菌絲充分混入緩沖液中；
(4)28 0C T 100r/min 培養(yǎng) 20_25min ； (5)將小管第二次過濾，收集菌絲體，并用滲透壓緩沖液洗滌兩次； (6)用小勺刮下濾布上的菌絲到新的EP管，加入4mL滲透壓緩沖液，再加入0.1g的酶粉振蕩； (7)28°C下100r/min培養(yǎng)lh，并鏡檢觀察，此時(shí)視野中應(yīng)得到透明圓球狀的原生質(zhì)體； 萎銹靈抗性濃度的篩選 將制備的原生質(zhì)體分別涂布于含有不同濃度梯度萎銹靈的查氏培養(yǎng)基上，萎銹靈濃度分別為0.5、1、2、3、4mg/ml培養(yǎng)基，并設(shè)置不含萎銹靈的培養(yǎng)基為對(duì)照，26 V培養(yǎng)48h后，觀察菌落生長情況； 3)PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立 (1)將得到的原生質(zhì)體懸液吸取400μ L到三個(gè)新的EP管中，做好標(biāo)記，分別為CK對(duì)照和 PgpdA: car: GFP 質(zhì)粒； (2)對(duì)應(yīng)管中分別加入10μ LPgpdA:car:GFP質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度60.5ug/ μ L，冰浴20min ； (3)每個(gè)管中各加入100μ L PEG4000溶液，混勻，冰浴20min ； (4)各加入2mLPEG4000，混勻，常溫放置5min； (5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀釋； (6)吸200μ L于軟瓊脂平板上，封口標(biāo)記，于28°C恒溫箱培養(yǎng)24h ； (7)將ImL的滲透壓緩沖液打在軟瓊脂平板上，重復(fù)吸打；吸出100μ L均勻涂在帶有萎銹靈抗性的查氏培養(yǎng)基上，于28°C恒溫箱培養(yǎng)并觀察； 4)平均轉(zhuǎn)化效率分析 (1)對(duì)PgpdA:car:GFP載體 進(jìn)行球孢白僵菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化,每個(gè)載體轉(zhuǎn)化5個(gè)平板； (2)轉(zhuǎn)化后對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)化平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，取平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析； 轉(zhuǎn)化子的PCR檢測及熒光觀察 (1)利用滅菌環(huán)將查氏培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子小心挑出，在提前準(zhǔn)備的PDA平板上畫多個(gè)“Z”字，分別標(biāo)記為轉(zhuǎn)PgpdA:car:GFP和CK ； (2)將劃好的平板置于26°C恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3d； (3)此時(shí)得到轉(zhuǎn)化子第一代，繼續(xù)挑出孢子劃線在新的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3d得到第二代孢子； (4)同上述過程，得到第三代轉(zhuǎn)化子孢子，在超凈工作臺(tái)中挑出，置于SDY培養(yǎng)基中搖2-3d ； 5)PCR檢測:利用氯化芐法提取球孢白僵菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA，然后利用基因組做模版，利用GFP基因特異性引物，進(jìn)行PCR及電泳檢測； 6)熒光觀察:菌絲從PDA上刮下后置于SDAY培養(yǎng)基中搖三天，將實(shí)驗(yàn)控制在相同的培養(yǎng)條件及時(shí)間，在培養(yǎng)第 48h置于倒置熒光顯微鏡下觀察。
【文檔編號(hào)】C12N15/65GK104131026SQ201410353284
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】張正坤, 李啟云, 張佳詩, 路楊, 徐文靜, 鄭巖, 隋麗, 杜茜, 任金平, 田志來 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院