檢測(cè)脂環(huán)酸桿菌屬微生物的組合物的制作方法
【專利摘要】檢測(cè)脂環(huán)酸桿菌屬微生物的組合物。本發(fā)明提供了核酸，核酸集合物，載體，試劑盒及用于食物中微生物的靈敏及特異檢測(cè)的方法。所述核酸包括選自SEQ ID NOs：1-15的核苷酸序列，且長(zhǎng)度至多為35個(gè)核苷酸。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)脂環(huán)酸桿菌屬微生物的組合物
[0001] 將電子提交的材料以引用方式并入本文
[0002] 同此一并提交的并標(biāo)識(shí)如下：2013年6月4日，文件名為《712628ST25. TXT》的一 個(gè)13, 658字節(jié)ASCII (文本）的計(jì)算機(jī)可讀核苷酸/氨基酸序列表以引用方式全部并入本 文。

【背景技術(shù)】
[0003] 微生物（例如細(xì)菌）可能使生產(chǎn)過(guò)程中的或生產(chǎn)后的食物（例如果汁）變質(zhì)。有 些微生物可能導(dǎo)致食物變質(zhì)和幾種不良作用之任一種或多種，例如難聞的氣味，討厭的味 道，以及食物食用不安全。未能準(zhǔn)確而快速地檢測(cè)使食物變質(zhì)的微生物的存在可能增加食 物變質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)?？焖俣鴾?zhǔn)確檢測(cè)使食物變質(zhì)的微生物的障礙可能包括，例如：用于檢測(cè)該微 生物的傳統(tǒng)微生物學(xué)方法的持續(xù)時(shí)間冗長(zhǎng)。該些傳統(tǒng)方法可能需平均10-12天完成。準(zhǔn)確 檢測(cè)的另一個(gè)障礙可能包括，例如：一些使食物變質(zhì)的微生物的基因組序列與不使食物變 質(zhì)的微生物的基因組序列相似。
[0004] 據(jù)此，需求用于檢測(cè)使食物變質(zhì)的微生物的改良組合物及方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的實(shí)施方案提供了核酸，其包含選自SEQ ID NOs :1-15的核苷酸序列且長(zhǎng) 度至多為35個(gè)核苷酸。
[0006] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了核酸集合物，包括兩種或更多種核酸，其中，每種核 酸包含選自SEQ ID NOs :1-15的核苷酸序列且長(zhǎng)度至多為35個(gè)核苷酸。
[0007] 本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供了載體，包括固定在該載體上的本發(fā)明的核酸或核酸 集合物。
[0008] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了用于檢測(cè)食物中一種或多種脂環(huán)酸桿菌屬微生物 的存在的方法，該方法包括：(a)獲得至少一種包含從食物中分離的微生物核酸的測(cè)試樣 品；(b)在允許本發(fā)明的核酸與所述微生物核酸之間形成復(fù)合物的條件下使本發(fā)明的核 酸、核酸集合物或載體之任一種與所述至少一種測(cè)試樣品接觸；（c)檢測(cè)所述復(fù)合物；以及 (d)比較所述復(fù)合物在所述至少一種測(cè)試樣品中的存在與缺少微生物核酸的陰性樣品中復(fù) 合物不存在，其中所述復(fù)合物的檢測(cè)表明一種或多種脂環(huán)酸桿菌屬微生物的存在。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案提供了用于檢測(cè)食物中一種或多種使食物變質(zhì)的脂環(huán)酸 桿菌屬微生物的存在的方法，該方法包括：(a)獲得至少一種包含從食物中分離的微生物 核酸的測(cè)試樣品；(b)在允許本發(fā)明的核酸與所述微生物核酸之間形成復(fù)合物的條件下使 本發(fā)明的核酸、核酸集合物或載體之任一種與所述至少一種測(cè)試樣品接觸；(c)檢測(cè)所述 復(fù)合物；以及（d)比較所述復(fù)合物在所述至少一種測(cè)試樣品中的存在與缺少微生物核酸的 陰性樣品中復(fù)合物不存在，其中所述復(fù)合物的檢測(cè)表明一種或多種使食物變質(zhì)的脂環(huán)酸桿 菌屬微生物的存在。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 本發(fā)明的實(shí)施方案提供了核酸，包括選自SEQ ID NOs :1-15的核苷酸序列且長(zhǎng)度 至多為35個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，核苷酸序列可能包括附加核苷酸以至于長(zhǎng) 度至多為35個(gè)核苷酸。在這點(diǎn)上，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了選自SEQ ID NOs :31-74且長(zhǎng) 度至多為35個(gè)核苷酸的核苷酸序列。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，核酸包括選自SEQ ID NOs :16-30的核苷酸序列且長(zhǎng)度至多為35個(gè)核苷酸。核酸可能具有至多為35個(gè)核苷酸的 任何長(zhǎng)度。例如：核酸可能具有至多為34,33,32,31，30,29,28,27,26,25,24,23,22,21， 20,19,18,17,16或15個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，核酸可能由選自SEQ ID NOs :1-74的核苷酸序列組成。
[0011] 在一實(shí)施方案中，核酸是分離或純化的。本發(fā)明的核酸提供正向引物、反向引物以 及探針，其可有利地與微生物核酸特異地雜交，用于檢測(cè)食物中一種或多種微生物的存在。 在一些實(shí)施方案中，引物與探針與特定的微生物屬（此處稱屬特異性核酸）內(nèi)的多個(gè)物種 的核酸特異地雜交。在其他實(shí)施方案中，引物與探針與特定的微生物種（此處稱種特異性 核酸）的核酸特異地雜交。
[0012] 本發(fā)明的屬特異性核酸可用于檢測(cè)食物樣品中一種或多種可能或不可能使食物 變質(zhì)的微生物的存在。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，該屬特異性核酸可以特異地檢測(cè)脂環(huán)酸 桿菌屬內(nèi)的多種不同的微生物菌種之兩種或更多種的存在。采用本發(fā)明的屬特異性核酸 檢測(cè)的脂環(huán)酸桿菌屬菌種的數(shù)量不限于且可包括，例如，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，12，13， 14,15,16,17,18,19, 20, 21，22, 23或更多的脂環(huán)酸桿菌屬菌種。采用本發(fā)明的屬特異性 核酸檢測(cè)的脂環(huán)酸桿菌屬菌的數(shù)量不限于且可包括，例如，10, 20, 30,40, 50,60, 70,80,90， 100,110,120,130,140,150,160,170,180,190, 200或更多的脂環(huán)酸桿菌屬菌。通過(guò)本發(fā)明 的屬特異性核酸特異地檢測(cè)的微生物示例菌種包括酸熱脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius)，污染脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus contaminans)，二硫化物氧化脂環(huán) 酸桿菌（Alicyclobacillus disulfidooxidans)，苛求污染脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus fastidiosus)，氧化鐵脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus ferrooxydans)，橘皮苷脂環(huán)酸桿 菌（Alicyclobacillus hesperidum),果實(shí)脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus pomorum), 糖脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus sacchari)，嗜酸耐熱異養(yǎng)菌（Alicyclobacillus sendaiensis),靜網(wǎng)市脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus shizuokensis)，抗逆性脂 環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus tolerans)，火神脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus vulcanalis)，騰沖市脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus tengchongenesis)，酸 土脂環(huán) 酸桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris)，嗜酸脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus acidiphilus)，環(huán)庚基脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus cycloheptanicus)以及草脂環(huán)酸桿 菌（Alicyclobacillus herbarius)的一種或多種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的屬特異 性核酸特異地檢測(cè)酸土脂環(huán)酸桿菌，嗜酸脂環(huán)酸桿菌，環(huán)庚基脂環(huán)酸桿菌以及草脂環(huán)酸桿 菌的一種或多種。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的屬特異性核酸可包含或由選自SEQ ID NOs :1-3,16-18及31-41的核苷酸序列組成。
[0013] 本發(fā)明的種特異性核酸可能用于檢測(cè)一種或多種使食物樣品變質(zhì)的微生物的存 在。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸可能特定地檢測(cè)使食物樣品變質(zhì)的脂環(huán)酸桿菌 屬內(nèi)的多種不同的微生物菌種之任一種或多種的存在?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的核酸特異地檢測(cè)的 使食物樣品變質(zhì)的微生物示例菌種包括酸土環(huán)脂酸桿菌，嗜酸脂環(huán)酸桿菌，環(huán)庚基脂環(huán)酸 桿菌以及草脂環(huán)酸桿菌的一種或多種。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，該種特異性核酸可能包含 或由選自SEQ ID N0s:4-15,19-30及42-74的核苷酸序列組成。表1-4列出了本定明的屬 特異性核和種特異性核酸以及可采用本發(fā)明的核酸特異地檢測(cè)的微生物的示例菌種。
[0014] 表 1
[0015]

【權(quán)利要求】
1. 核酸，其包含選自SEQ ID NOs :1-15的核苷酸序列，且長(zhǎng)度至多為35個(gè)核苷酸。
2. 權(quán)利要求1的核酸，其包含選自SEQ ID NOs :31-74的核苷酸序列，且長(zhǎng)度至多為35 個(gè)核苷酸。
3. 權(quán)利要求1的核酸，其包括選自SEQ ID NOs :16-30的核苷酸序列，且長(zhǎng)度至多為35 個(gè)核苷酸。
4. 權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核酸，由選自SEQ ID NOs :1-74的核苷酸序列組成。
5. 核酸集合物，包括兩種或更多種權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核酸。
6. 權(quán)利要求5的集合物，其中，所述兩種或更多種核酸包括兩種或更多種不同的核酸。
7. 權(quán)利要求5的集合物，其中，所述兩種或更多種核酸包括： (a) 包含選自 SEQ ID NOs :1，4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-34,42-45,53-57,67 及 71-72的核苷酸序列的第一核酸；以及 (b) 包含選自 SEQ ID NOs :2, 5,8,11，14,17, 20, 23, 26, 29, 35-41，46-52, 58-66,68-70 以及73-74的核苷酸序列的第二核酸； 其中，所述兩種或更多種核酸之每種的長(zhǎng)度至多為35個(gè)核苷酸。
8. 權(quán)利要求5的集合物，其中，所述兩種或更多種核酸包含： (a) SEQ ID NOs :1-2 ; (b) SEQ ID NOs :4-5 ; (c) SEQ ID NOs :7-8 ; (d) SEQ ID NOs :10-11 ;或 (e) SEQ ID NOs :13-14 ; 其中，所述兩種或更多種核酸之每種的長(zhǎng)度至多為35個(gè)核苷酸。
9. 權(quán)利要求5的集合物，其中，所述兩種或更多種核酸包含： (a) SEQ ID NOs :16-17 ； (b) SEQ ID NOs :19-20 ; (c) SEQ ID NOs :22-23 ; (d) SEQ ID NOs :25-26 ;或 (e) SEQ ID NOs :28-29。
10. 權(quán)利要求5的集合物，其中，所述兩種或更多種核酸包含： (a) 選自 SEQ ID NOs :1，4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-34,42-45,53-57,67及71-72 的第一核酸； (b) 選自 SEQ ID NOs :2, 5,8,11，14,17, 20, 23, 26, 29, 35-41，46-52, 58-66,68-70 以及 73-74的第二核酸： (c) 選自 SEQ ID NOs :3,6,9,12,15,18, 21，24, 27 以及 30 的第三核酸； 其中，所述兩種或更多種核酸之每種的長(zhǎng)度至多為35個(gè)核苷酸。
11. 權(quán)利要求5的集合物，其中，所述兩種或更多種核酸包含： (a) SEQ ID NOs ：1-3 ； (b) SEQ ID NOs :4-6 ; (c) SEQ ID NOs :7-9 ; (d) SEQ ID NOs :10-12 ;或 (e)SEQ ID NOs :13-15 ; 其中所述核酸之每一種的長(zhǎng)度至多為35個(gè)核苷酸。
12. 權(quán)利要求5的集合物，其中，所述兩種或更多種核酸由如下組成： (a) SEQ ID NOs :16-18 ； (b) SEQ ID NOs :19-21 ; (c) SEQ ID NOs :22-24 ； (d) SEQ ID NOs :25-27 ;或 (e) SEQ ID NOs :28-30。
13. 載體，包括根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的且固定在該載體上的核酸。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的載體，進(jìn)一步地包括可檢測(cè)標(biāo)記。
15. 檢測(cè)食物中一種或多種脂環(huán)酸桿菌屬微生物存在的方法，該方法包括： (a) 獲得至少一種包含從食物中分離的微生物核酸的測(cè)試樣品； (b) 在允許權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核酸與所述微生物核酸之間形成復(fù)合物的條件下 使所述權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的核酸與所述至少一測(cè)試樣品接觸； (c) 檢測(cè)所述復(fù)合物；以及 (d) 比較所述復(fù)合物在所述至少一種測(cè)試樣品中的存在與缺少微生物核酸的陰性樣品 中復(fù)合物不存在，其中所述復(fù)合物的檢測(cè)表明一種或多種脂環(huán)酸桿菌屬微生物的存在。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，包括檢測(cè)一種或多種使食物變質(zhì)的微生物的存在。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，包括檢測(cè)一種或多種選自酸土脂環(huán)酸桿菌 (Alicyclobacillus acidoterrestris)，嗜酸脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus acidiphilus)，環(huán)庚基脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus cycloheptanicus)及草脂環(huán)酸桿菌 (Alicyclobacillus herbarius)的微生物的存在。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述食物是飲料。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述食物是果汁。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104232629SQ201410354031
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月6日
【發(fā)明者】王彧, 包赟 申請(qǐng)人:帕爾公司