表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液相芯片試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液相芯片試劑盒，所述檢測試劑盒主要包括有：與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球；連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針,每條支持延伸探針包括5’端能與對應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與對應(yīng)的支持探針的特異性序列互補配對的序列；連接目標(biāo)基因mRNA與信號檢測組分間的擴增延伸探針，每條擴增延伸探針包括5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與標(biāo)記探針互補配對的序列。本發(fā)明所述試劑盒除了具有特異性好、信噪比高、能夠在均一的反應(yīng)條件下進行雜交反應(yīng)等優(yōu)點外，還能實現(xiàn)不同基因mRNA表達(dá)水平的穩(wěn)定檢測，即能夠在不同樣本間，3種內(nèi)參基因的表達(dá)檢測穩(wěn)定,從而使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。
【專利說明】表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液 相芯片試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及表皮生長因子 受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液相芯片試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 酪氨酸激酶在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中占據(jù)了十分重要的地位，調(diào)節(jié)著細(xì)胞體內(nèi)生 長、分化、死亡等一系列生理過程，其異常表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)紊亂，進而導(dǎo)致腫瘤發(fā) 生。此外，酪氨酸激酶的異常表達(dá)還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、腫瘤新生血管的生成、腫瘤的化 療抗性密切相關(guān)，以酪氨酸激酶為靶點進行藥物研發(fā)已成為國際上抗腫瘤藥物研究的熱 點。
[0003] 目前，腫瘤治療的靶向治療藥物主要有兩類，一類是受體酪氨酸激酶抑制劑類 革巴向藥物（Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)，主要包括吉非替尼（Gefitinib，Ireasa)、 厄洛替尼（Erlotinib，Taceva)等；另一類是單克隆抗體類祀向藥物，包括西妥昔單抗 (cetuximab)、帕尼單抗（Vectibix)等。受體酪氨酸激酶抑制劑類祀向藥物通過擴散進入 腫瘤細(xì)胞，與受體胞內(nèi)段激酶結(jié)合區(qū)結(jié)合，從而抑制受體的磷酸化，阻斷受體下游信號通路 的傳導(dǎo)，發(fā)揮抗腫瘤作用。
[0004] TKI類靶向藥物的療效雖得到廣泛認(rèn)可，但患者用藥后藥效的個體差異很大。大量 的臨床研究已經(jīng)證實，TKI的療效/毒副作用與患者體內(nèi)某些受體酪氨酸激酶相關(guān)基因的 mRNA表達(dá)水平直接相關(guān)，它們分別是 ：
[0005] (1)表皮生長因子受體（EGFR)
[0006] 表皮生長因子受體（EGFR)是靶向治療的主要靶標(biāo)，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)的作用于EGFR的 靶向藥物包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI)以及抗EGFR抗體藥。但臨床運用表明 這些靶向藥物僅對部分病人有效。臨床研究已經(jīng)證實：以EGFR通路為靶標(biāo)的靶向藥物療效 與腫瘤組織中EGFR基因mRNA表達(dá)水平密切相關(guān)，即EGFR基因表達(dá)水平高的患者對靶向藥 物敏感，反之表達(dá)水平低的患者表現(xiàn)藥效較低。因此，美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)（NCCN) 2009 年臨床指南中推薦：患者在接受靶向藥物治療之前，進行EGFR基因表達(dá)水平檢測，確定是 否接受靶向治療，降低治療費用，節(jié)省寶貴的醫(yī)治時間。
[0007] ⑵膜島素樣生長因子 1 受體（insulin-like growth factor I receptor， IGF-1R)
[0008] 胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R)是靶向治療的重要靶標(biāo)，IGF-1R的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。抑制IGF-1R的活性，可以有效控制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移， 增強腫瘤對化療、放療的敏感性。以IGF-1R為靶標(biāo)的治療主要有IGF-1R單克隆抗體、反義 寡核苷酸、IGF-1R單克隆抗體、小分子激酶抑制劑等。IGF-1R的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還可引起細(xì)胞的 惡性化以及細(xì)胞粘附性的改變。目前IGF-1R已經(jīng)成為特異性治療腫瘤的熱點靶標(biāo)。大量 臨床研究表明IGF-IR在結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、食管癌、胃癌等惡性腫 瘤組織中都呈現(xiàn)高表達(dá)。臨床研究顯示：IGF-1R與經(jīng)吉非替尼治療的NSCLC患者較長存活 顯著相關(guān)。腫瘤患者檢測IGF-1R mRNA表達(dá)水平，對臨床上靶向藥物的選擇、用藥量、靶向 藥物敏感性的確定及預(yù)后的判斷有著重要的意義，同時提高靶向治療的有效性，為患者爭 取更多寶貴的醫(yī)治時間，大幅節(jié)省醫(yī)治費用。
[0009] (3)張力蛋白同源物磷酸酯酶基因（PTEN)
[0010] 張力蛋白同源物磷酸酯酶基因（PTEN)為PI3K/AKT信號通路的一種負(fù)調(diào)節(jié)因子， 目前研究顯示，PTEN與腫瘤對曲妥珠單抗的敏感性有關(guān)。
[0011] ⑷持家基因β 2-微球蛋白（B2M)、鐵傳遞蛋白受體（TFRC)和TATA框結(jié)合蛋白 (TBP)
[0012] 持家基因一般在體內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)，但由于這種穩(wěn)定表達(dá)是相對的，在一定的病理 狀態(tài)或用藥情況下，某些常用的持家基因的表達(dá)也會發(fā)生變化。選擇在我們所研究對象中 穩(wěn)定表達(dá)的基因作持家基因，對保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。因此，本發(fā)明從一定數(shù)量 的常用持家基因中進行篩選，確定3個合適的持家基因，分別是：β 2-微球蛋白（B2M)、鐵傳 遞蛋白受體（TFRC)、TATA框結(jié)合蛋白（ΤΒΡ)。
[0013] 基于以上基因的表達(dá)水平與受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效的相關(guān)性，專 家推薦患者在接受靶向藥物之前，應(yīng)當(dāng)進行相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平的檢測，幫助臨床醫(yī) 生根據(jù)患者的個體差異制定個體化用藥方案，以提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。 目前，對基因的mRNA表達(dá)水平進行檢測的技術(shù)主要有：逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法、實時熒光定量 PCR法、RNA原位核酸雜交（RISH)等。其中，RISH主要用于分析組織或細(xì)胞內(nèi)RNA分布以 了解特定基因的表達(dá)情況，且其過程較長、操作繁瑣，不適合用于臨床應(yīng)用；而逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR法與實時熒光定量PCR法，首先，這兩種方法均需要進行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄，檢測的結(jié)果 受RNA降解影響大；其次，這兩種方法只通過一對引物進行PCR擴增，容易產(chǎn)生非特異性結(jié) 合，從而導(dǎo)致假陽性高；再次，這兩種方法一般只有一個持家基因作對照，其準(zhǔn)確性容易受 到病理狀態(tài)的影響；因此，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實時熒光定量PCR法作為臨床應(yīng)用均存在著 難以克服的技術(shù)缺陷。。針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明 申請人:在項目開發(fā)早期申請 了的中國發(fā)明專利（申請?zhí)枺?00910193802. 8)，但其針對同一樣本不同基因mRNA檢測信號 的強弱不均衡，從而影響到目標(biāo)基因EGFR、IGF-1R、PTEN的判讀，因此急需對該產(chǎn)品進行改 進。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是提供一種表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢 測液相芯片試劑盒，該檢測試劑盒除了可以高靈敏度和特異性地單獨或者任意組合并列檢 測以下6種目標(biāo)基因的表達(dá)水平：EGFR、IGF-1R、PTEN、B2M、TFRC、TBP，且其中3種內(nèi)參基 因表達(dá)檢測更加穩(wěn)定。
[0015] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
[0016] 一種表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液相芯片試劑盒，主 要包括：
[0017] (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序 列和3'端的能與支持延伸探針互補配對的特異性序列P1，所述特異性序列P1選自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6,每個目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；
[0018] (2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針的堿基 序列從5'端到3'端依次為：與對應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA互補配對的特異性序列P2、間隔臂序 列、能與對應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性 序列P2包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID N0. 7 - SEQ ID N0. 11中的2條以上、針對 IGF-1R基因的選自SEQ ID N0. 12 -SEQ ID N0. 16中的2條以上、針對PTEN基因的選自 SEQ ID N0. 17 - SEQ ID N0. 21 中的 2 條以上、針對 B2M 基因的選自 SEQ ID N0. 22 - SEQ ID NO. 26中的2條以上、針對TFRC基因的選自SEQ ID NO. 27 - SEQ ID NO. 31中的2條以 上、和/或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 32 - SEQ ID NO. 36中的2條以上；
[0019] (3)擴增延伸探針，每條擴增延伸探針的堿基序列從5'端到3'端依次為：能與目 標(biāo)基因mRNA互補配對的特異性序列P4、間隔臂序列、序列P5, 3'末端還修飾有生物素；所 述擴增延伸探針的特異性序列P4包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID N0. 38 - SEQ ID NO. 47中的5條以上、針對IGF-1R基因的選自SEQ ID NO. 48 - SEQ ID NO. 57中的5條以 上、針對PTEN基因的選自SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 67中的5條以上、針對B2M基因的選 自SEQ ID NO. 68 - SEQ ID NO. 77中的5條以上、針對TFRC基因的選自SEQ ID NO. 78 - SEQ ID NO. 87中的5條以上、和/或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 97 中的5條以上，所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、 與PI、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。
[0020] 或者，主要包括：
[0021] (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序 列和3'端的能與支持延伸探針互補配對的特異性序列P1，所述特異性序列P1選自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6,每個目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；
[0022] (2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針的堿基 序列從5'端到3'端依次為：與對應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA互補配對的特異性序列P2、間隔臂序 列、能與對應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性 序列P2包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID N0. 7 - SEQ ID N0. 11中的2條以上、針對 IGF-1R基因的選自SEQ ID N0. 12 -SEQ ID N0. 16中的2條以上、針對PTEN基因的選自 SEQ ID N0. 17 - SEQ ID N0. 21 中的 2 條以上、針對 B2M 基因的選自 SEQ ID N0. 22 - SEQ ID NO. 26中的2條以上、針對TFRC基因的選自SEQ ID NO. 27 - SEQ ID NO. 31中的2條以 上、和/或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 32 - SEQ ID NO. 36中的2條以上；
[0023] (3)擴增延伸探針，每條擴增延伸探針的堿基序列從5'端到3'端依次為：能與目 標(biāo)基因mRNA互補配對的特異性序列P4、間隔臂序列、序列P5 ;所述擴增延伸探針的特異性 序列P4包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID N0. 38 - SEQ ID N0. 47中的5條以上、針對 IGF-1R基因的選自SEQIDN0·48 - SEQIDN0·57中的5條以上、針對PTEN基因的選自 SEQ ID N0. 58 - SEQ ID N0. 67 中的 5 條以上、針對 B2M 基因的選自 SEQ ID N0. 68 - SEQ ID NO. 77中的5條以上、針對TFRC基因的選自SEQ ID NO. 78 -SEQ ID NO. 87中的5條以 上、和/或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 97中的5條以上，所述P5為 不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA 之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；和
[0024] (4)標(biāo)記探針,所述標(biāo)記探針具有與擴增延伸探針P5互補配對的序列，且末端具 有生物素修飾。
[0025] 在其中一個實施例中，所述的抗微管類化療藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢 測液相芯片，還包括有填充序列，包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID N0. 98 - SEQ ID NO. 99中一條或多條、針對IGF-1R基因的SEQ ID NO. 100、針對PTEN基因的選自SEQ ID NO. 101 - SEQ ID NO. 103 中的一條或多條、針對 B2M 基因的選自 SEQ ID NO. 104 - SEQ ID NO. 107中的一條或多條、針對TFRC基因的選自SEQ ID NO. 108 - SEQ ID NO. 109中的一條 或多條、和/或針對TBP基因的SEQ ID NO. 110 - SEQ ID NO. 111。
[0026] 在其中一個實施例中，所述間隔臂序列為5 - 10個T ;所述P5的組成為SEQ ID Ν0· 37。
[0027] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0028] (1)本發(fā)明在已有產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，通過各種探針的設(shè)計和組合的進一步優(yōu)化，除了 具有特異性好、信噪比高、能夠在均一的反應(yīng)條件下進行雜交反應(yīng)等優(yōu)點外，還能實現(xiàn)不同 基因mRNA表達(dá)水平的穩(wěn)定檢測，即能夠在不同樣本間，3種內(nèi)參基因的表達(dá)檢測穩(wěn)定，從而 使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。
[0029] (2)所設(shè)計的各種探針能夠在均一的反應(yīng)條件下進行雜交反應(yīng)，且各種探針之間 基本不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時，多種探針的 組合使用使液相芯片和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統(tǒng)，有著操作簡易、準(zhǔn)確性高、 特異性高的特點。

【具體實施方式】
[0030] 本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提 供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。實施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0031] 除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】 的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實 施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語"和/或"包括一個或多個相關(guān)的所 列項目的任意的和所有的組合。
[0032] 實施例1表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液相芯片試劑 盒，主要包括有 ：
[0033] -、偶聯(lián)有支持探針（SP)的微球
[0034] 支持探針由三部分組成，5'端是與微球結(jié)合的胺基端，3'端是與支持延伸探針結(jié) 合（互補配對）的特異序列P1，長度為16nt，中間是間隔序，所述間隔臂為本領(lǐng)域的技術(shù)人 員所理解的，即用于將支持探針與微球表面間隔開來，在支持延伸探針與擴增延伸探針內(nèi) 部也存在間隔臂序列，通過在探針序列與氨基之間、探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列， 可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明支持探針的間隔臂 優(yōu)選為5 - 10個T，本實施例所述間隔臂序列是8個T。每個目標(biāo)基因選用一種微球，并選 用一條支持探針，每種微球具有不同的熒光編碼。本實施例中，每個目標(biāo)基因的支持探針如 表1所示。
[0035] 表1不同的目標(biāo)基因及其選用微球的編號、支持探針（SP)
[0036]

【權(quán)利要求】
1. 一種表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液相芯片試劑盒，其特 征在于，主要包括： (1) 與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列 和3'端的能與支持延伸探針互補配對的特異性序列P1，所述特異性序列P1選自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6,每個目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼； (2) 連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針的堿基序列從 5'端到3'端依次為：與對應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA互補配對的特異性序列P2、間隔臂序列、能與 對應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2 包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID NO. 7 - SEQ ID NO. 11中的2條以上、針對IGF-1R 基因的選自SEQ ID NO. 12 - SEQ ID NO. 16中的2條以上、針對PTEN基因的選自SEQ ID NO. 17 -SEQ ID NO. 21 中的 2 條以上、針對B2M基因的選自 SEQ ID NO. 22 -SEQ ID NO. 26 中的2條以上、針對TFRC基因的選自SEQ ID NO. 27 - SEQ ID NO. 31中的2條以上、和/ 或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 32 - SEQ ID NO. 36中的2條以上； (3) 擴增延伸探針，每條擴增延伸探針的堿基序列從5'端到3'端依次為：能與目標(biāo)基 因mRNA互補配對的特異性序列P4、間隔臂序列、序列P5, 3'末端還修飾有生物素；所述擴增 延伸探針的特異性序列P4包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID NO. 38 - SEQ ID NO. 47 中的5條以上、針對IGF-1R基因的選自SEQ ID NO. 48- SEQ ID NO. 57中的5條以上、針 對PTEN基因的選自SEQ ID NO. 58- SEQ ID NO. 67中的5條以上、針對B2M基因的選自 SEQ ID NO. 68 - SEQ ID NO. 77 中的 5 條以上、針對 TFRC 基因的選自 SEQ ID NO. 78 - SEQ ID NO. 87中的5條以上、和/或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 97中的 5條以上，所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與PI、 P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液 相芯片試劑盒，其特征在于：還包括有填充序列，所述填充序列為：針對EGFR基因的選自 SEQ ID NO. 98 - SEQ ID NO. 99 中一條或多條、針對 IGF-1R 基因的 SEQ ID NO. 100、針對 PTEN基因的選自SEQ ID NO. 101 - SEQ ID NO. 103中的一條或多條、針對B2M基因的選自 SEQ ID NO. 104 - SEQ ID NO. 107 中的一條或多條、針對TFRC基因的選自 SEQ ID NO. 108 - SEQ ID NO. 109 中的一條或多條、和 / 或針對 TBP 基因的 SEQ ID NO. 110 - SEQ ID NO. 111。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液 相芯片試劑盒，其特征在于：所述特異性序列P1為：針對EGFR基因的SEQ ID NO. 1、針對 IGF-1R基因的 SEQ ID NO. 2、針對PTEN基因的 SEQ ID NO. 3、針對B2M基因的 SEQ ID NO. 4、 針對TFRC基因的SEQ ID NO. 5、和/或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 6。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液 相芯片試劑盒，其特征在于：所述間隔臂序列為5 - 10個T。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1一4任一項所述的表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表 達(dá)檢測液相芯片試劑盒，其特征在于：所述P5的組成為SEQ ID NO. 37。
6. -種表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液相芯片試劑盒，其特 征在于：主要包括： (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5'端的間隔臂序列 和3'端的能與支持延伸探針互補配對的特異性序列P1，所述特異性序列P1選自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 6,每個目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼； (2) 連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針的堿基序列從 5'端到3'端依次為：與對應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA互補配對的特異性序列P2、間隔臂序列、能與 對應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補配對的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2 包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID NO. 7 - SEQ ID NO. 11中的2條以上、針對IGF-1R 基因的選自SEQIDN0·12 - SEQIDN0·16中的2條以上、針對PTEN基因的選自SEQID N0·17 - SEQIDN0·21中的2條以上、針對B2M基因的選自SEQIDN0·22 - SEQIDN0·26 中的2條以上、針對TFRC基因的選自SEQ ID NO. 27 - SEQ ID NO. 31中的2條以上、和/ 或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 32 - SEQ ID NO. 36中的2條以上； (3) 擴增延伸探針，每條擴增延伸探針的堿基序列從5'端到3'端依次為：能與目標(biāo) 基因mRNA互補配對的特異性序列P4、間隔臂序列、序列P5 ;所述擴增延伸探針的特異性序 列P4包括有：針對EGFR基因的選自SEQ ID NO. 38 - SEQ ID NO. 47中的5條以上、針對 IGF-1R基因的選自SEQ ID NO. 48 -SEQ ID NO. 57中的5條以上、針對PTEN基因的選自 SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 67 中的 5 條以上、針對 B2M 基因的選自 SEQ ID NO. 68 - SEQ ID NO. 77中的5條以上、針對TFRC基因的選自SEQ ID NO. 78 -SEQ ID NO. 87中的5條以 上、和/或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 88 - SEQ ID NO. 97中的5條以上，所述P5為 不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA 之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；和 (4) 標(biāo)記探針，所述標(biāo)記探針具有與擴增延伸探針P5互補配對的序列，且末端具有生 物素修飾。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液 相芯片試劑盒，其特征在于：還包括有填充序列，所述填充序列為：針對EGFR基因的選自 SEQ ID NO. 98 - SEQ ID NO. 99 中一條或多條、針對 IGF-1R 基因的 SEQ ID NO. 100、針對 PTEN基因的選自SEQ ID NO. 101 - SEQ ID NO. 103中的一條或多條、針對B2M基因的選自 SEQ ID NO. 104- SEQ ID NO. 107 中的一條或多條、針對TFRC基因的選自 SEQ ID NO. 108 - SEQ ID NO. 109 中的一條或多條、和 / 或針對 TBP 基因的 SEQ ID NO. 110-SEQ ID NO. 111。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液 相芯片試劑盒，其特征在于：所述特異性序列P1為：針對EGFR基因的SEQ ID NO. 1、針對 IGF-1R基因的 SEQ ID NO. 2、針對PTEN基因的 SEQ ID NO. 3、針對B2M基因的 SEQ ID NO. 4、 針對TFRC基因的SEQ ID NO. 5、和/或針對TBP基因的選自SEQ ID NO. 6。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因表達(dá)檢測液 相芯片試劑盒，其特征在于：所述間隔臂序列為5 - 10個T。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6- 9任一項所述的表皮生長因子受體抑制劑類藥物療效相關(guān)基因 表達(dá)檢測液相芯片試劑盒，其特征在于：所述P5的組成為SEQ ID NO. 37。
【文檔編號】C12Q1/68GK104195229SQ201410356954
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】吳詩揚, 羅彩英, 楊惠夷, 何嘉英 申請人:益善生物技術(shù)股份有限公司