一種肌酸水解酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種肌酸水解酶及其編碼基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)療診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供的肌酸水解酶基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET20b-cre，該基因工程菌為將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliBL21，得到高效表達(dá)肌酸水解酶的基因工程菌，應(yīng)用該菌種可實(shí)現(xiàn)肌酸水解酶的高效生產(chǎn)。本發(fā)明中工程菌的成功構(gòu)建為降低肌酸水解酶的生產(chǎn)成本和擴(kuò)大應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種肌酸水解酶及其編碼基因和應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種肌酸水解酶及其編碼基因，以及該編碼基因重組大腸桿菌制備肌 酸水解酶的方法。本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明重組制備的肌酸水解酶產(chǎn)物屬于 醫(yī)學(xué)診斷化合物，可以用于檢測(cè)人體腎臟功能。 【背景技術(shù)】
[0002] 人類(lèi)的肌肉和大腦消耗的能量主要來(lái)自于磷酸肌酸的水解。磷酸肌酸與ADP在酶 的作用下可形成ATP，同時(shí)生成肌酸，所形成的肌酸在體內(nèi)最終將被轉(zhuǎn)化成肌酐。此外，磷 酸肌酸也會(huì)在體內(nèi)直接脫去磷酸生成肌酐，肌酐經(jīng)過(guò)腎臟的過(guò)濾由血液進(jìn)入尿液而排出體 夕卜。健康腎臟的這一功能可保證將代謝過(guò)程中形成的肌酐不斷地排出體外而使血液中的肌 酐始終保持在一個(gè)較低的水平。如果腎臟發(fā)生病變，將不能有效地清除所形成的肌酐而造 成肌酐在血液中積累。因此血液和尿液的肌酐含量可反映腎臟的排泄功能。肌酐測(cè)定主要 有化學(xué)法和酶法?；瘜W(xué)法有多種，但大都源于Jeffe早年建立的堿性苦味酸法，其優(yōu)點(diǎn)是成 本低，操作簡(jiǎn)單。該法雖然經(jīng)濟(jì)，但易受樣品中的非特異性物質(zhì)（假肌酐）的干擾，且敏感 性差。
[0003] 酶促方法是樣品通過(guò)肌酐水解酶（creatinine amidohydrolase，E. C. 3. 5. 2. 10)、 肌酸水解酶（E. C. 3. 5. 3. 3)、肌氨酸氧化酶（sareosine oxidase, E. C. 1. 5. 3. 1)的連續(xù)轉(zhuǎn) 化，肌酐完全被降解，該方法具有酶促反應(yīng)的專(zhuān)一性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)。
[0004] 肌酸水解酶是酶促檢測(cè)法中必不可少的一種酶，主要來(lái)源于微生物。1937年 首次發(fā)現(xiàn)肌酐可以被微生物降解。隨后發(fā)現(xiàn)一些屬的菌株能夠通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生肌酸水解 酶并在細(xì)胞中累積。這些細(xì)菌有假單胞菌屬（Pseudomonas)、梭菌（Clostridium)、黃桿 菌屬（Flavobacterium)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、產(chǎn)喊菌屬（Alcaligenes)、副球菌屬 (Paracoccus)等。國(guó)外針對(duì)肌酸酶的研究主要在以下幾個(gè)方面：（1)原始菌產(chǎn)肌酸酶的產(chǎn) 酶條件；（2)幾種不同來(lái)源的肌酸酶基因的表達(dá)；（3)肌酸酶純化和酶學(xué)性質(zhì)研究。目前國(guó) 外已生產(chǎn)出肌酐檢測(cè)試劑盒，而我國(guó)在肌酸水解酶的研究上起步較晚，臨床上的應(yīng)用仍然 主要依靠進(jìn)口。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種肌酸水解酶高效生產(chǎn)和純化制備的方法。在本發(fā)明中，提供了 以基因工程技術(shù)克隆獲取所述肌酸水解酶基因，構(gòu)建大腸桿菌重組表達(dá)肌酸水解酶的工程 菌及其生產(chǎn)方法。
[0006] 本發(fā)明涉及克隆獲得肌酸水解酶的全長(zhǎng)基因序列，涉及構(gòu)建所述的肌酸水解酶基 因工程高效表達(dá)制備肌酸水解酶的方法，還涉及到本發(fā)明所述的肌酸水解酶作為水解酶在 本文所述的醫(yī)療中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種來(lái)源于節(jié)桿菌的肌酸水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
[0008] 本發(fā)明還提供了編碼所述肌酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 含有權(quán)利要求2所述肌酸水解酶基因的質(zhì)粒也屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[〇〇1〇] 含有上述重組質(zhì)?；蚣∷崴饷傅幕虻幕蚬こ叹蜣D(zhuǎn)基因細(xì)胞系均屬于本 發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0011] 本發(fā)明中所述的肌酸水解酶（CRE)的基因克隆獲取和重組制備方法如下：
[0012] 1所述肌酸水解酶CRE全長(zhǎng)基因的克隆獲取。
[0013] 2所述肌酸水解酶CRE基因重組大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建。將所述制備方法1中 的肌酸水解酶CRE基因利用引物CREF、CRER擴(kuò)增，采用限制性?xún)?nèi)切酶酶切，連接至大腸桿菌 表達(dá)質(zhì)粒pET20b (+)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET20b-cre。
[0014] 3將制備方法2所述的表達(dá)重組質(zhì)粒pET20b-cre經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E. coliBL21 感受態(tài)中。在添加有氨芐青霉素（0.1 μ g/mL)的LB平板上篩選陽(yáng)性重組子，并用 特異性引物CREF、CRER對(duì)陽(yáng)性大腸菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證肌酸水解酶CRE基因重組 E.coliBL21(pET20b-cre)成功。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)重組肌酸水解酶的方法：從甘油管中按0. 4%的接 種量將所述的工程菌接入20mL/250mL三角瓶，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)溫度為37°C， 培養(yǎng)12h。發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按1% (v/v)的接種量接種至50mL/500mL三角 瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm ;待0D_ = 0. 6,加入終濃度為0. 6mmol/ L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)10h。
[0016] 通過(guò)上述方法制備的重組肌酸水解酶，E. coliBL21 (pET20-cre)發(fā)酵液進(jìn)行肌酸 水解酶活性檢測(cè)，采用比色法進(jìn)行檢測(cè)。
[0017] 本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)的手段，提供了一種新的肌酸水解酶基因。此外，構(gòu)建了一 株高產(chǎn)肌酸水解酶的大腸桿菌基因工程菌，應(yīng)用該菌種生產(chǎn)肌酸水解酶，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn) 單、產(chǎn)品產(chǎn)量高等諸多優(yōu)點(diǎn)，最高產(chǎn)量能達(dá)到32U/mL，預(yù)期能解決應(yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)肌酸水 解酶的工業(yè)應(yīng)用問(wèn)題。本發(fā)明為肌酸水解酶的研究、開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)工作奠定了基礎(chǔ)，也為肌酸 水解酶在醫(yī)療診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了方便。 【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1所示為重組大腸桿菌與原始菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)肌酸水解酶的粗酶液酶活比較。
[0019] 圖2所示為重組肌酸水解酶的蛋白純化SDS-PAGE電泳結(jié)果（M，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子 量；1，E. coliBL21/pET20b對(duì)照破壁上清；2,重組菌破壁上清；3,60-80%硫酸銨飽和度蛋 白；4,純化的重組肌酸水解酶蛋白）。 【具體實(shí)施方式】
[0020] 材料與方法
[0021] 肌酸水解酶活力單位定義：在37°C和pH7. 0的條件下反應(yīng)，每分鐘產(chǎn)生1 μ mol黃 色染料所需的酶量為一個(gè)單位（U)。
[0022] 比色法測(cè)定肌酸水解酶酶活：肌酸在肌酸水解酶的作用下分解為肌氨酸和尿素， 尿素與對(duì)二甲氨基苯甲醛在酸性條件下產(chǎn)生黃色染料，黃色染料的生成量與肌酸酶的活力 成正比。
[0023] 實(shí)施范例1 :肌酸水解酶
[0024] 本發(fā)明中肌酸水解酶的氨基酸序列如SEQIDN0. 1所示，核苷酸獲取的方式為：
[0025] 通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的肌酸水解酶基因序列的比對(duì)，設(shè)計(jì)引物（CREF :GAAAGAACATATG ACTACCGCCAACATCGCCACCA ;CRER :TTCTCTCGAGTTACGCGTCGATGATGTTGTTCTCC)，以煙草節(jié)桿菌 (Arthrobacter nicotianae 23710)基因組為模板，成功獲得約1200bp的片段，進(jìn)行測(cè)序， 核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0026] 本發(fā)明肌酸水解酶，其氨基酸序列SEQ ID NO. 1的信息如下：
[0027]
【權(quán)利要求】
1. 一種來(lái)源于節(jié)桿菌的肌酸水解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述肌酸水解酶的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
3. -種重組質(zhì)粒，其特征在于，其含有權(quán)利要求2所述的肌酸水解酶基因。
4. 一種含有權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒的重組肌酸水解酶工程菌。
5. -種含有權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒的重組肌酸水解酶細(xì)胞系。
6. 構(gòu)建權(quán)利要求4所述工程菌的方法，其特征在于，將權(quán)利要求2所述的肌酸水解酶基 因連接至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET20b (+)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET20b-cre，將制備的重組質(zhì) 粒pET20b-cre經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E. coliBL21感受態(tài)中。
7. -種發(fā)酵生產(chǎn)重組肌酸水解酶的方法：從甘油管中按0. 4%的接種量將權(quán)利要求 5所述的工程菌接入20mL/250mL三角瓶，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng) 12h;發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按1% (v/v)的接種量接種至50mL/500mL三角瓶中 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm ;待0D6QQ = 0. 6,加入終濃度為0. 6mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)10h。
8. 權(quán)利要求1所述肌酸水解酶在測(cè)定人體肌酐含量、評(píng)價(jià)人體腎臟功能中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104109658SQ201410359141
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 康振, 錢(qián)俊佳, 戴俊 申請(qǐng)人:江南大學(xué)