一種茶樹(shù)類鈣調(diào)蛋白基因啟動(dòng)子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，提供一種茶樹(shù)類鈣調(diào)蛋白基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明的啟動(dòng)子，為如下1)-2)中任一種DNA分子：1)如SEQ ID NO.1所示DNA序列；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。本發(fā)明的啟動(dòng)子具有組織特異性，兼有誘導(dǎo)型功能。本啟動(dòng)子不僅含有對(duì)生物與非生物脅迫的順式作用元件，同時(shí)有鈣離子相關(guān)位點(diǎn)，可接受鈣離子誘導(dǎo)而過(guò)表達(dá)。鈣信號(hào)作為第二信使，影響諸多生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因素，可通過(guò)葉面噴施等方式通過(guò)鈣離子誘導(dǎo)下游基因表達(dá)。
【專利說(shuō)明】-種茶樹(shù)類鈣調(diào)蛋白基因啟動(dòng)子 一、

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種茶樹(shù)啟動(dòng)子，包括含有該啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和載 體，以及含有該啟動(dòng)子或者所述結(jié)構(gòu)或者載體的宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物。 二、 技術(shù)背景
[0002] 植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，常會(huì)遭遇種種非生物脅迫與生物脅迫，從而阻礙其生長(zhǎng) 與發(fā)育，甚至死亡。I丐信號(hào)（Calcium signal，Ca2+signal)是植物細(xì)胞逆境生理響應(yīng)的中心 調(diào)節(jié)者，作為第二信使調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育與各種逆境響應(yīng)。
[0003] 植物中有4類Ca2+感受器蛋白家族，S卩：鈣調(diào)素家族（CaM)、鈣依賴性蛋白激酶家 族（CDPK)、鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白家族（CBL)和類鈣調(diào)素蛋白（CML)。CML是近年新發(fā)現(xiàn)的一 類植物細(xì)胞所特有的Ca 2+響應(yīng)蛋白家族，具有進(jìn)化上保守性的Ca2+的結(jié)合區(qū)域-EF手型結(jié) 構(gòu)。CML基因表達(dá)受到各種生物和非生物刺激、激素和化學(xué)處理的調(diào)節(jié)。
[0004] 啟動(dòng)子根據(jù)其功能和作用方式大致分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異 性啟動(dòng)子三種。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可以減少對(duì)植物的不利 影響，目前對(duì)特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來(lái)越重視。這些特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用 為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。啟動(dòng)子的深入研究有助于闡明植物生長(zhǎng)發(fā) 育和生理代謝的基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。 三、


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 1、技術(shù)問(wèn)題
[0006] 本發(fā)明目的是提供一種茶樹(shù)類鈣調(diào)蛋白啟動(dòng)子，為茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝的研 究提供基礎(chǔ)，尤其是在茶樹(shù)的遺傳育種中提供一條快速、經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。
[0007] 2、技術(shù)方案
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人首先采集中山陵茶場(chǎng)茶樹(shù)花粉，使用改良的CTAB法提取DNA。 然后根據(jù)本課題組克隆得到的茶樹(shù)花粉CsCML21基因的cDNA序列（GenBank登錄號(hào) ： JQ999983)設(shè)計(jì)引物，使用TAIL-PCR方法擴(kuò)增其啟動(dòng)子。驗(yàn)證之后，引入酶切位點(diǎn)，構(gòu)建瞬 時(shí)表達(dá)載體（PJIT166-CsPCML21-GFP)。利用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404后與擬 南芥幼根共培養(yǎng)，對(duì)植物類鈣調(diào)蛋白基因啟動(dòng)子CsPCML21進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析。
[0009] 3、有益效果
[0010] 本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，首次提供了一個(gè)茶樹(shù)類鈣調(diào)蛋白基因啟動(dòng)子。 該啟動(dòng)子能夠有效響應(yīng)Ca2+濃度變化，驅(qū)動(dòng)下游基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，調(diào)節(jié)下游基因表 達(dá)量。通過(guò)對(duì)該啟動(dòng)子進(jìn)行定點(diǎn)突變，確定位于+561bp處的相關(guān)序列為響應(yīng)鈣信號(hào)關(guān)鍵區(qū) 域。對(duì)茶樹(shù)類鈣調(diào)蛋白基因啟動(dòng)子的研究有助于認(rèn)識(shí)CML基因的功能及類鈣調(diào)蛋白在茶樹(shù) 中的作用機(jī)理。可以利用本發(fā)明啟動(dòng)子構(gòu)建成各種植物表達(dá)載體，用于通過(guò)植物基因工程 技術(shù)改善植物品質(zhì)和其他有益生產(chǎn)性狀。
[0011] 本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子CsPCML21經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)不僅含有光、低溫、礦物質(zhì)元素、 激素響應(yīng)等生物與非生物脅迫相關(guān)的重要順式作用元件，同時(shí)在+561bp處出現(xiàn)與鈣元素 Calcium、鈣離子Ca2+相關(guān)的位點(diǎn)，可接受Ca2+誘導(dǎo)而過(guò)表達(dá)。鈣信號(hào)作為第二信使，影響植 物諸多生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因素。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)的高效表達(dá)不但造成浪費(fèi)，還會(huì)引 起植物的形態(tài)改變，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。鈣離子可誘導(dǎo)其大量特異表達(dá)，因此，可以通過(guò) 葉面噴施等方式刺激植物誘導(dǎo)下游基因表達(dá)。促進(jìn)通過(guò)含有該種啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)脅 迫環(huán)境下適應(yīng)能力，提高轉(zhuǎn)基因植物的品質(zhì)。茶樹(shù)類鈣調(diào)蛋白基因的克隆以及啟動(dòng)子的分 離可以使我們更好地了解植物體響應(yīng)逆境脅迫的機(jī)理，并為基因工程改良奠定基礎(chǔ)。
[0012] 由于本發(fā)明的啟動(dòng)子取自山茶科的茶樹(shù)，因此，對(duì)茶樹(shù)CML21基因功能的研究具 有十分重要的意義。在茶樹(shù)中，CML響應(yīng)冰凍、酷暑、干旱、水澇、高鹽、酸鋁、重金屬等非生 物脅迫和病毒、細(xì)菌、真菌等生物脅迫，顯著影響營(yíng)養(yǎng)代謝及生長(zhǎng)發(fā)育。提高茶樹(shù)抗性，可以 擴(kuò)大茶葉的生產(chǎn)區(qū)域，可以減小逆境對(duì)茶葉產(chǎn)量、品質(zhì)的影響。我們最常利用茶樹(shù)的部分是 茶葉，該啟動(dòng)子并不會(huì)在茶樹(shù)中持續(xù)表達(dá)，可一定程度上減少轉(zhuǎn)基因植物潛在危害以及人 們對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的抵觸。從某一層面上說(shuō)，本發(fā)明既能使食品更安全可靠又兼有現(xiàn)有技術(shù) 對(duì)植物的調(diào)控改良，一舉兩得。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)施例驗(yàn)證，該啟動(dòng)子可在擬南芥中具有表達(dá)功能，說(shuō)明本發(fā)明提供 的啟動(dòng)子應(yīng)用廣泛。 四、

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1從茶樹(shù)花粉基因組DNA中TAIL-PCR擴(kuò)增CsCML21啟動(dòng)子的電泳圖譜。
[0015] 其中，Μ泳道為DL2000 Marker，從上到下片段依次為2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp ;圓圈處即為切膠回收的目的基因。
[0016] 圖2啟動(dòng)子CsPCML21中預(yù)測(cè)到的順式表達(dá)元件，除了基本轉(zhuǎn)錄元件：CAAT-框和 TATA-框等外，該啟動(dòng)子含有2個(gè)ABRE響應(yīng)元件、ATCT結(jié)構(gòu)域、框II、多個(gè)G-框、GA及GATA 功能域、GT1 結(jié)構(gòu)域、HSE、I_ 框、MSA-like、Skn-l_motif、rbcS_CMA7a 等順式兀件（圖 2)， 這其中含有決定其在花粉和根中的組織特異性元件；還有CsPCML21對(duì)光、低溫、礦物質(zhì)元 素、激素響應(yīng)及生物與非生物脅迫的重要順式作用元件。
[0017] 圖3重組載體PJIT166-CsPCML21-GFP的PCR鑒定圖譜。其中，Μ泳道為 DL2000Marker，從上到下片段依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道 2 為 PCR所得產(chǎn)物的結(jié)果。
[0018] 圖4熒光體式顯微鏡下經(jīng)共培養(yǎng)轉(zhuǎn)入重組載體PJIT166-CsPCML21-GFP的擬南芥 幼根的GFP熒光表達(dá)結(jié)果。
[0019] 圖5激光共聚焦顯微鏡下經(jīng)共培養(yǎng)轉(zhuǎn)入重組載體PJIT166-CsPCML21-GFP的擬南 芥幼根的GFP熒光表達(dá)結(jié)果。 五、

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下述實(shí)施例中所用方法若無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域慣用的技術(shù)手段，所用的試劑、 材料，如無(wú)特殊說(shuō)明均可通過(guò)商業(yè)途徑得到。
[0021] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述，但是以下描述的目的是示例性 的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 植物組織特異性啟動(dòng)子CsPCML21的獲得
[0024] 1.引物設(shè)計(jì)
[0025] 根據(jù)茶樹(shù)花粉CsCML21基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其啟動(dòng)子。
[0026] 本發(fā)明引物擴(kuò)增的原則是：引物的長(zhǎng)度為22?26nt，GC含量45?55%，Tm值 60?70°C。其他要求和普通PCR反應(yīng)用引物相同。3個(gè)引物GSP1、GSP2、GSP3,設(shè)計(jì)方向?yàn)?需要擴(kuò)增的未知區(qū)域方向，GSP2的位置應(yīng)設(shè)計(jì)在GSP1的內(nèi)側(cè)，GSP3位于GSP2的內(nèi)側(cè)。每 兩個(gè)引物之間的距離約80?100bp?？紤]到靠近啟動(dòng)子區(qū)域可能存在的內(nèi)含子，GSP3應(yīng) 與啟動(dòng)子序列區(qū)域距離180?250bp左右，以增加獲取啟動(dòng)子序列的有效長(zhǎng)度，并確切驗(yàn)證 cDNA部分。設(shè)計(jì)時(shí)，可參考親緣關(guān)系較近的物種類似的基因，盡量避開(kāi)引物被內(nèi)含子截?cái)唷?br> [0027] 具體引物序列如下：
[0028] 基因 CsCML21的啟動(dòng)子CsPCML21的特異性引物：
[0029] pCML21-GSPl :如 SEQ ID N0. 3 所示；
[0030] pCML21-GSP2 :如 SEQ ID NO. 4 所示；
[0031] pCML21-GSP3 :如 SEQ ID NO. 5 所示；
[0032] 隨機(jī)引物：
[0033] AD1 :如 SEQ ID N0. 6 所不：5 ' -tgwgnagwan casaga-3 '，其中 w = a 或 t;n = a 或g或C或t;s = g或c
[0034] AD2 :如 SEQ ID Ν0· 7 所不：5 ' -agwgnagwan cawagg-3 '，其中 w = a 或 t;n = a 或g或c或t
[0035] AD3 :如 SEQ ID Ν0· 8 所不：5' -cawcgicnga iasgaa-3'，其中 w = a 或 t ;i = a 或g或c或t;n = a或g或c或t;s = g或c
[0036] AD4 :如 SEQ ID NO. 9 所不：5 ' -ntcgastwts gwgtt-3 '，其中 n = a 或 g 或 c 或 t ；s = g c ；w = a t ；
[0037] AD5 :如 SEQ ID NO. 10 所不：5 ' -gtcgaswgan awgaa-3 '，其中 s = g 或 c;w = a 或t;n = a或g或c或t;
[0038] AD6 :如 SEQ ID NO. 11 所不：5' -wgtgnagwan canaga-3'，其中 w = a 或 t;n = a或g或c或t ;
[0039] 2. TAIL-PCR 擴(kuò)增
[0040] 以茶樹(shù)花粉基因組DNA為模板，以AD和GSP1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)， 反應(yīng)體系為：模板 DNA 1 μ L，dNTP Mixture (每種 2. 5mm) 8 μ L，10 X LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5y L, TaKaRa LA Taq(5 U/μ 1) 0. 5 μ L, AD Primer (lOOpmol/μ 1) 1 μ L, GSPl(10pmol/y l)ddH20 33. 5 μ L，總體積 50μ L。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 °C 變性 lmin， 再 98 °C lmin ;緊接著 5 個(gè)循環(huán)為 94 °C 30s，68 °C lmin，72 °C 2min ;接著 94 °C 30s， 25°C 3min，72°C 2min ;然后按照（94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向進(jìn)行 15 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 10min。
[0041] 反應(yīng)完成后，將上述PCR反應(yīng)液稀釋50倍作為第二輪PCR擴(kuò)增模板。第二 輪PCR反應(yīng)：以AD和GSP2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋喊凑眨?4°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向進(jìn)行 15個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0042] 反應(yīng)完成后，將上述PCR反應(yīng)液稀釋50倍作為第三輪PCR擴(kuò)增模板。第三 輪PCR反應(yīng)：以AD和GSP3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋喊凑眨?4°C 30s，68°C lmin， 72°C 2min)-(94°C 30s，68°C lmin，72°C 2min)-(94°C 30s，44°C lmin，72°C 2min)方向進(jìn)行 15個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0043] 將三級(jí)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1)，回收純化約2kb的目的條帶，將其連 接到PMD18-T載體（購(gòu)自TAKARA公司），熱擊轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，PCR擴(kuò)增鑒 定重組子后送測(cè)菌液。
[0044] 測(cè)序結(jié)果表明，該DNA片段長(zhǎng)2306bp，去掉1440bp的重疊區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域，該片 段為序列表中序列1的842bp大小的核苷酸序列，即為基因 CsCML21的啟動(dòng)子CsPCML21。 將序列1放在啟動(dòng)子順式元件預(yù)測(cè)網(wǎng)站PLACE(http ://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/)和 plantCARE(http ://intra. psb.ugent.be :8080/PlantCARE/)上進(jìn)行分析，除了基本轉(zhuǎn)錄 元件：CAAT-框和TATA-框等外，該啟動(dòng)子含有2個(gè)ABRE響應(yīng)元件、ATCT結(jié)構(gòu)域、框II、多 個(gè) G-框、GA 及 GATA 功能域、GT1 結(jié)構(gòu)域、HSE、I-框、MSA-like、Skn-l_motif、rbcS-CMA7a 等順式元件（圖2)，這其中含有決定其在花粉和根中的組織特異性元件；還有CsPCML21對(duì) 光、低溫、礦物質(zhì)元素、激素響應(yīng)及生物與非生物脅迫的重要順式作用元件。值得一提的是， 在+561bp處出現(xiàn)與鈣元素 Calcium、鈣離子Ca2+相關(guān)的位點(diǎn)：S000507與S000406。而鈣元 素 Calcium、鈣離子Ca2+相關(guān)的位點(diǎn)是進(jìn)化上保守性的Ca2+的結(jié)合區(qū)域-EF手型結(jié)構(gòu)。該 區(qū)域基因表達(dá)受到各種生物和非生物刺激、激素和化學(xué)處理的調(diào)節(jié)。因此，此區(qū)域很可能會(huì) 提高啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)對(duì)逆境環(huán)境耐受性、抵抗性的調(diào)控作用能力。
[0045] 通過(guò)上述分析獲得的組織特異性元件和逆境脅迫作用元件，進(jìn)一步佐證了該啟動(dòng) 子的表達(dá)具有組織特異性與逆境脅迫誘導(dǎo)性雙重特性。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] 瞬時(shí)表達(dá)載體（PJIT166-CsPCML21_GFP)的構(gòu)建
[0048] 1、將大腸桿菌DH5 α重組子菌液用如下引物：PCML21-Kpnl-F和pCML21-BamHI-R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入酶切位點(diǎn)ΚρηΙ和BamHI。
[0049] pCML21-KpnI-F 如 SEQ ID NO. 12 所示
[0050] pCML21-BamHI-R 如 SEQ ID NO. 13 所示
[0051] 2、用限制性內(nèi)切酶Kpnl和BamHI雙酶切載體PJIT166-GFP，切去CaMV35S區(qū)域，回 收約5kb的載體骨架。
[0052] 3、用限制性內(nèi)切酶Kpnl和BamHI雙酶切由實(shí)施例1得到的DH5 α菌液抽提的質(zhì) 粒，得到酶切產(chǎn)物。
[0053] 4、將步驟1的載體骨架和步驟2的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接， 得到重組質(zhì)粒；測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性；測(cè)序結(jié)果表明所得質(zhì)粒為在PJIT166-GFP載體的 Kpnl和BamHI酶切位點(diǎn)之間插入具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的核酸片段，將該質(zhì)粒 命名為PJIT166-CsPCML21-GFP。經(jīng)過(guò)測(cè)序，在該載體中，GFP基因上游只有本發(fā)明序列表中 SEQ ID NO. 1所示的片段，沒(méi)有其它任何啟動(dòng)子。
[0054] 利用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,用步驟1中所述引物PCR菌液檢測(cè)驗(yàn) 證無(wú)誤（圖3)。
[0055] 實(shí)施例3
[0056] 植物類鈣調(diào)蛋白基因啟動(dòng)子CsPCML21的瞬時(shí)表達(dá)分析
[0057] 將實(shí)施例2中所得農(nóng)桿菌菌液與擬南芥幼苗共培養(yǎng)，確認(rèn)農(nóng)桿菌已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化擬 南芥后分別用熒光體式顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察瞬時(shí)表達(dá)情況，部分結(jié)果如圖4、5 所示。
[0058] 結(jié)果表明：在GFP激發(fā)光下，瞬時(shí)侵染PJIT166-CsPCML21-GFP的擬南芥幼根可發(fā) 射熒光；CsPCML21可驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)。
【權(quán)利要求】
1. 一種茶樹(shù)類鈣調(diào)蛋白啟動(dòng)子，其特征在于：如SEQ ID NO. 1所示的DNA分子序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104232641SQ201410359223
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】黎星輝, 杜昱林, 王玉花 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)