Bcr-abl融合蛋白突變體及其編碼基因、表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種BCR-ABL融合蛋白突變體編碼基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，還提供了包含該核苷酸序列的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法；還提供了一種BCR-ABL融合蛋白突變體，該突變體是基于BCR-ABL/c-ABLSH3結(jié)構(gòu)域位點突變而設(shè)計，位于ABLSH3結(jié)構(gòu)79位的蘇氨酸突變?yōu)槔野彼?，其氨基酸序列為SEQIDNO:2。構(gòu)建的BCR-ABL融合蛋白突變體競爭性結(jié)合RIN1，直接阻滯和減少胞內(nèi)RIN1與BCR-ABL的結(jié)合，聯(lián)合IM作用，進(jìn)而增加細(xì)胞對IM的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時克服了直接敲除RIN1基因引發(fā)的潛在并發(fā)癥。
【專利說明】BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達(dá)載體及其構(gòu) 建方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表 達(dá)載體及其構(gòu)建方法，還涉及該BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達(dá)載體在治療 慢性粒細(xì)胞白血病中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] BCR-ABL融合蛋白具有異常激活的酪氨酸激酶活性，是慢性粒細(xì)胞白血病 (Chronic myelogenous leukemia，CML)的典型標(biāo)志，大于 90% 的 CML 病人表達(dá) BCR-ABL 融 合基因，而正常細(xì)胞中不表達(dá)BCR-ABL融合蛋白，且ABL位于胞核，RINl主要定位胞漿。位 于ABL段的SH3結(jié)構(gòu)與BCR-ABL蛋白激酶活性激活有著直接的關(guān)系，可負(fù)向調(diào)控BCR-ABL的 活性，其關(guān)鍵位點的突變或結(jié)合配體的改變均可引起伊馬替尼（Imatinib，IM)耐藥。酪氨 酸激酶抑制劑頂，在CML的治療中有可喜的成效，是治療CML的里程碑，但是由于BCR-ABL 激酶區(qū)T315I突變等原因，造成臨床15% -20%病人對頂耐藥，給CML的治療帶來一定困 難，因此,解決頂耐藥的問題已經(jīng)成為CML研究的熱點之一。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)，RINl蛋白--Ras抑制因子1，是ABL的一個直接的激活因子并且控制 對頂敏感的調(diào)定點。該蛋白通過自身富含脯氨酸的序列（PPAVPPPPVP)與ABL的SH3 (PxxP motif)高特異性低親和力的結(jié)合，降低細(xì)胞對頂?shù)拿舾行?，且RINl與BCR-ABL的結(jié)合不受 T315I突變的影響，亦不受除SH3、SH2和TKD以外的Abl結(jié)構(gòu)域的影響。不同的慢性粒細(xì)胞 白血病細(xì)胞株中RINl蛋白的表達(dá)不同，這種表達(dá)的不同影響細(xì)胞株對IM的敏感性。例如， 耐藥慢粒細(xì)胞株KCL22高表達(dá)RINl蛋白，而對頂敏感的細(xì)胞株中RINl表達(dá)較低，而K562 細(xì)胞表達(dá)較低對頂敏感。
[0004] 目前，關(guān)于RINl在CML方面的研究，主要包括：1. RNA干擾或者基因敲除后，和/或 聯(lián)合頂，分析ABL激酶活性、ABL磷酸化底物水平的變化以及相關(guān)的信號通路的研究；2.利 用RIN1ABD結(jié)構(gòu)域靶向結(jié)合ABL的功能，在RINl蛋白上連接有功能的酶、核定位信號等功 能片段，或者基因突變該結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑制ABL酪氨酸激酶活性的目的。以上方法，不能 直接阻抑RINl和BCR-ABL的結(jié)合，且RINl在不同的細(xì)胞中表現(xiàn)不同的生理功能，如在乳腺 細(xì)胞中RINl是抑癌基因，因此敲掉后可能會誘發(fā)乳腺癌的發(fā)生。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達(dá)載體及其 構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供該BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達(dá)載體在 治療慢性粒細(xì)胞白血病中的應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種BCR-ABL融合蛋白突變體編碼基因，其 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示：
[0008] AACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACTATCTAAGCATAACTAAAGGTGA AAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTC CCAAGCAACTACATCACGCCA
[0009] 本發(fā)明還提供了含有所述核苷酸序列SEQ ID NO: 1的表達(dá)載體。
[0010] 所述表達(dá)載體為將所述的核苷酸序列SEQ ID NO: 1插入穿梭質(zhì)粒PAd-Track-CMV 后與骨架質(zhì)粒pAd-Easy-1重組得到。
[0011] 本發(fā)明還提供了構(gòu)建所述含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1的表達(dá)載體的方法，包括 如下步驟：
[0012] (1)采用重疊延伸PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增得到核苷酸序列SEQ ID NO: 1的片段，包括 三個反應(yīng)體系：PCR1，PCR2和PCR3 ;PCR1以野生型ABL SH3為模板，上下游引物為F/Rm3 ; PCR2以野生型ABL SH3為模板，上下游引物為R/Fm3 ;PCR3以PCRl和PCR2的反應(yīng)產(chǎn)物作 為模板，上下游引物為F/R ;所述引物序列為：
[0013] F:5'-GCGTCGACAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATT-3'，
[0014] R:5'-CCGCTCGAGTCATGGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3'，
[0015] Rm3:5'-ATTCCCCATTGTGAATATAGCCTAAGACCC-3，
[0016] Fm3:5'-GTGGAGATAACtatCTAAGCATAACTAA-3' ；
[0017] (2)將步驟1得到的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的片段和穿梭質(zhì)粒pAd-Track-CMV 經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I和Xho I雙酶切后，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0018] (3)將步驟2得到的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切后與骨架質(zhì)粒pAd-Easy-Ι連接構(gòu)成 重組腺病毒載體。
[0019] 本發(fā)明還提供了 BCR-ABL融合蛋白突變體，所述的突變體是基于BCR-ABL/c-ABL SH3結(jié)構(gòu)域位點突變而設(shè)計，位于ABL SH3結(jié)構(gòu)79位的蘇氨酸突變?yōu)槔野彼幔鯞CR-ABL 融合蛋白突變體氨基酸序列為SEQ ID N0:2,其序列為：
[0020] NLFVALYDFVAS⑶NYLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITP
[0021] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了 ：所述的核苷酸序列SEQ ID NO: 1在制備多種治療慢 性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用；含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1的表達(dá)載體在制備多種治 療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用；氨基酸序列為SEQ ID N0:2的BCR-ABL融合蛋白突 變體在制備多種治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過計算機(jī)模擬構(gòu)建基于BCR-ABL/c-ABL SH3結(jié) 構(gòu)域位點突變的BCR-ABL融合蛋白突變體結(jié)構(gòu)，設(shè)計該突變體編碼基因的引物擴(kuò)增得到目 的基因片段，構(gòu)建了含有編碼該BCR-ABL融合蛋白突變體基因序列的表達(dá)載體。構(gòu)建的 BCR-ABL融合蛋白突變體競爭性結(jié)合RIN1，直接阻滯和減少胞內(nèi)RINl與BCR-ABL的結(jié)合， 聯(lián)合頂作用，進(jìn)而增加細(xì)胞對頂?shù)拿舾行?，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時克服了直接敲除RINl 基因引發(fā)的潛在并發(fā)癥。腫瘤細(xì)胞中，構(gòu)建的BCR-ABL融合蛋白突變體，直接封閉RINl與 BCR-ABL結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，不影響其他結(jié)合域，有利于RINl其他生物學(xué)功能的發(fā)揮；該突變體 與RINl的作用，不受T315I突變的影響，克服了單純使用IM時，T315I突變引起的耐藥。本 發(fā)明為CML治療和解決耐藥問題奠定了小分子基礎(chǔ)，提供了新的選擇。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為突變體M3結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024] 圖2為重組腺病毒載體構(gòu)建示意圖。
[0025] 圖3為免疫共沉淀驗證M3和RINl的相互作用。
[0026] 圖4為Western blot檢測突變體M3單獨作用CML細(xì)胞株的有效性；圖4A為對 KCL22細(xì)胞作用，圖4B為對K562/G01細(xì)胞作用，圖4C為對K562細(xì)胞作用。
[0027] 圖5為M3聯(lián)合M作用對CML細(xì)胞增殖的影響；圖5A為對KCL22細(xì)胞增殖的影 響，圖5B為對K562細(xì)胞增殖的影響。
[0028] 圖6為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。
[0029] 圖7為流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。
[0030] 圖8為突變體M3聯(lián)合頂作用CML細(xì)胞株對BCR-ABL及底物磷酸化水平、BCR-ABL 下游信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響。

【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0032] 試驗材料和試劑：
[0033] 1、實驗所用細(xì)胞株：

【權(quán)利要求】
1. 一種BCR-ABL融合蛋白突變體編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2. -種含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于：所述表達(dá)載體為將權(quán)利要求1所述 的核苷酸序列插入穿梭質(zhì)粒PAd-Track-CMV后與骨架質(zhì)粒pAd-Easy-Ι重組得到。
4. 一種構(gòu)建權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)載體的方法，其特征在于：該構(gòu)建方法包括如 下步驟： (1) 采用重疊延伸PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增得到核苷酸序列SEQ ID NO: 1的片段，包括三個反 應(yīng)體系：PCR1，PCR2和PCR3 ;PCR1以野生型ABLSH3為模板，上下游引物為F/Rm3 ;PCR2以野 生型ABLSH3為模板，上下游引物為R/Fm3 ;PCR3以PCRl和PCR2的反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，上下 游引物為F/R ;所述引物序列為： F:5'-GCGTCGACAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATT-3'， R:5'-CCGCTCGAGTCATGGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3'， Rm3:5'-ATTCCCCATTGTGAATATAGCCTAAGACCC-3， Fm3:5'-GTGGAGATAACtatCTAAGCATAACTAA-3' ； (2) 將步驟I得到的核苷酸序列為SEQIDNO: I的片段和穿梭質(zhì)粒pAd-Track-CMV經(jīng)限 制性內(nèi)切酶Sal I和Xho I雙酶切后，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒； (3) 將步驟2得到的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I酶切后與骨架質(zhì)粒pAd-Easy-Ι連接構(gòu)成重組 腺病毒載體。
5. -種BCR-ABL融合蛋白突變體，其特征在于：所述的突變體是基于BCR-ABL/ C-ABLSH3結(jié)構(gòu)域位點突變而設(shè)計，位于ABL SH3結(jié)構(gòu)79位的蘇氨酸突變?yōu)槔野彼?，所?BCR-ABL融合蛋白突變體氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
6. 權(quán)利要求1所述的核苷酸序列在制備多種治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)載體在制備多種治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的應(yīng) 用。
8. 權(quán)利要求5所述的融合蛋白突變體在制備多種治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/12GK104212821SQ201410359268
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月25日
【發(fā)明者】馮文莉, 劉鑫, 文良雪, 黃崢蘭, 李會 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)