一種納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器的制備及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器的制備及應(yīng)用。該方法首先由功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑的混合溶液在柱內(nèi)通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)聚合制備多孔有機(jī)聚合物整體柱，經(jīng)功能化修飾后鍵合納米材料，得到納米材料整體柱。再以納米材料為中間配體，實(shí)現(xiàn)酶在整體柱上的固定化，制備的納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器。該生物微反應(yīng)器成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析、藥物手性拆分和催化酯交換反應(yīng)中。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：制備方法簡單，酶的固載量大，催化活性高，酶解速率快、效率高，使用壽命長，可重復(fù)使用。
【專利說明】一種納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器的制備及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及整體柱固載酶生物微反應(yīng)器的制備及其應(yīng)用，具體是一種基于納米材 料為中間配體的多孔有機(jī)聚合物整體柱固載酶生物微反應(yīng)器的制備方法，并研究其在蛋白 質(zhì)組學(xué)分析、藥物手性拆分和催化酯交換反應(yīng)中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 酶固定化技術(shù)是一門交叉學(xué)科技術(shù)。固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催 化反應(yīng)特性的同時，又具有更高的酶/底物比和酶解效率、更快的酶解速率、可連續(xù)使用并 能減少酶的自身降解和交叉感染等優(yōu)點(diǎn)；且酶解反應(yīng)可控，酶與產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物容易提 純，反應(yīng)所需的空間小，可以實(shí)現(xiàn)和分離鑒定系統(tǒng)的聯(lián)用。固定化酶的性能主要取決于固定 化方法和所使用的載體材料，二者能直接影響固定化酶的催化活性。然而目前國內(nèi)外報道 的固定化載體和方法均有一定的局限性，如二氧化娃、人工合成微粒、介孔分子篩、大孔樹 脂和合成纖維等載體對酶的固載量較低，且傳質(zhì)速度慢，不利于快速高效的進(jìn)行酶催化反 應(yīng)。而常規(guī)的酶固定化方法，如包埋法、交聯(lián)法、共價結(jié)合、離子結(jié)合和物理吸附等均具有一 定的缺陷。例如，離子結(jié)合法和物理吸附法制備簡單、活力回收率高、載體可以再生，然而酶 的固定化程度較弱，催化過程中酶容易脫落。共價結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法對酶的固定化程 度強(qiáng)，然而制備較難、活力回收率低、載體不能再生。因此，目前迫切需要開發(fā)酶固定化載體 和固定化方法，增強(qiáng)酶的催化活性，增大使用壽命和可再生性，提高酶解反應(yīng)的反應(yīng)速率和 效率。
[0003] 有機(jī)高聚物整體柱具有制備簡單、滲透性好、背壓低、傳質(zhì)速度快、易于改性和化 學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，可以為酶和底物提供快速的對流傳質(zhì)性能，因而是固定化酶的理想載 體之一。例如Krenkova和 Urban等人（Anal. Chem. 2009,81，2004-2012 ;Biotechnology and Bioengineering, 2012,109,371-380)分別應(yīng)用環(huán)氧基團(tuán)或Π 丫內(nèi)酯基團(tuán)與酶的氨基反應(yīng)，通 過共價法在整體柱上固載酶，分別用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析和催化酯交換反應(yīng)。Spross (Anal. Chem. 2010,82,1434-1443)則利用戊二醛交聯(lián)法在整體柱上固載酶，用于蛋白質(zhì)消化。Ma， Wu 和 Zhang 等人（Proteomics 2011，11，991-995 J.Chromatogr. A 2012,1256,136-143; Anal. Bioanal. Chem. 2012,402, 703-710)分別通過金屬離子螯合和離子鍵固載酶，酶解蛋 白質(zhì)，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。整體柱固載酶生物微反應(yīng)器雖然能為酶和底物提供良好的對 流傳質(zhì)性能，提高酶解反應(yīng)速率，但是使用過程中仍然存在兩個問題，一是整體柱由于具有 連續(xù)的貫穿大孔，其比表面積較小，因此酶固載量較低。二是傳統(tǒng)的整體柱固載酶方法，如 共價法和離子交換法等存在一定的弊端，不利于提高酶的穩(wěn)定性和使用壽命。
[0004] 納米材料由于其獨(dú)特的尺寸和物理性質(zhì)，比如具有小粒徑效應(yīng)、表面效應(yīng)及界面 效應(yīng)等，具有比表面積大等諸多優(yōu)點(diǎn)。作為載體用于酶的固定化，有利于保持酶的活性和穩(wěn) 定性，大大提高酶的固載量和催化效率。本專利中將納米材料和整體柱相結(jié)合，首先對整體 柱聚合物進(jìn)行功能化修飾，鍵合納米材料；再以納米材料為中間配體，通過開發(fā)納米材料與 酶的親和超分子識別作用實(shí)現(xiàn)酶的固定化，合成納米材料整體柱固定化酶生物微反應(yīng)器。 有機(jī)聚合物整體柱化學(xué)穩(wěn)定性高，通透性好，能為酶和底物提供快速的對流傳質(zhì)性能。納米 材料巨大的比表面積與體積比，有利于大大提高酶的固載量；親和作用力強(qiáng)，能防止酶從載 體上的脫落；且反應(yīng)條件溫和，可以保持酶的三維結(jié)構(gòu)和生物活性。將二者有機(jī)結(jié)合，一方 面可以解決傳統(tǒng)固載酶生物微反應(yīng)器傳質(zhì)速率慢、固載量低和催化效率低等問題，大大提 高固載酶的穩(wěn)定性、使用壽命、催化速率和效率；另一方面親和超分子作用力可逆，酶在多 次使用失活后可洗脫，重新鍵合新酶，固載酶反應(yīng)器可再生，大大降低了成本，為固載酶生 物微反應(yīng)器的制備提供新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的之一是研究一種納米材料整體柱固載酶微生物微反應(yīng)器，通過將納 米材料和整體柱二者有機(jī)結(jié)合，解決傳統(tǒng)固載酶生物微反應(yīng)器傳質(zhì)速率慢、酶固載量低、催 化效率低和使用壽命差等問題，從而獲得催化速率快、效率高的可再生固載酶生物微反應(yīng) 器。
[0006] 本發(fā)明的目的之二是研究納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器在催化酯交換反 應(yīng)、藥物手性拆分和蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)酶催化反應(yīng)的快速、高效進(jìn)行。
[0007] 本發(fā)明借由以下技術(shù)方案措施實(shí)現(xiàn)：在功能化修飾的有機(jī)聚合物毛細(xì)管整體柱孔 表面鍵合一層排列規(guī)則、致密、連續(xù)、不同粒徑的高密度納米材料，以納米材料為中間配體， 將酶固定到整體柱上，從而獲得納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器。
[0008] -種納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器的制備，包括：步驟A，制備納米材料； 步驟B，有機(jī)聚合物整體柱的合成：由功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑的混合溶液，通過 原位熱引發(fā)或光引發(fā)合成多孔有機(jī)聚合物整體柱；步驟C，合成納米材料整體柱：對整體柱 進(jìn)行功能化修飾，引入高密度的特異性功能基團(tuán)，通過功能基團(tuán)與納米材料的特異性親和 作用，在整體柱的孔表面上鍵合納米材料；步驟D，固載酶生物微反應(yīng)器的制備：以納米材 料為中間配體，通過納米材料與酶的特異性親和作用，在整體柱上實(shí)現(xiàn)目標(biāo)酶的固定化，設(shè) 計制備納米材料固載酶生物微反應(yīng)器。
[0009] 步驟A中合成的納米材料包括納米金、納米銀、納米二氧化娃、足球烯C6(l、碳納米 管、石墨烯、磁性四氧化三鐵、金屬-有機(jī)框架材料M0F或共價有機(jī)骨架C0F。納米材料膠體 為球形，粒徑在5?100nm。
[0010] 步驟B中合成整體柱所用的功能單體包括甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸 甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯、丙烯酸、丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、甲基 丙烯酸丙炔基酯、縮水甘油基炔丙基醚、2-乙烯基-4,4-二甲基-2-惡唑啉-5-酮、2-甲 基-2-丙烯酸_2, 3-二羥基丙酯、苯乙烯、或4-乙烯基吡啶。交聯(lián)劑包括乙二醇二甲基丙 烯酸酯、三烯丙基異三聚氰酸酯、二乙烯基苯、Ν，Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺等。致孔劑包括甲 苯、正庚烷、環(huán)己醇、十二醇、正丙醇、1，4_ 丁二醇、或不同分子量的聚乙二醇。引發(fā)劑包括偶 氮二異丁臆、偶氮二異庚臆、2, 2-二甲氧基_2_苯基苯乙酮、或2-輕基-2-甲基-1-苯基丙 酮。5?30% (w/w)功能單體、5?30% (w/w)交聯(lián)劑、30?80% (w/w)致孔劑，并且功能 單體、交聯(lián)劑和致孔劑的質(zhì)量總和為100%。另外加入是功能單體和交聯(lián)劑質(zhì)量的〇. 2? 5%的引發(fā)劑，熱引發(fā)反應(yīng)溫度為45?851：，反應(yīng)時間6?4811。光引發(fā)波長為25411111或 365nm，光強(qiáng)為6-30mw/cm 2,光照時間為5_60min。整體柱在不銹鋼色譜柱（內(nèi)徑3_6mm，長 度6_30cm)、毛細(xì)管（內(nèi)徑50-600 μ m，長度5_50cm)、聚丙烯基槍頭（體積0· 01-10mL)、聚 丙烯基注射器（體積〇. Ι-lOmL)、高硼硅玻璃板或硅晶片中合成。
[0011] 步驟C中通過對多孔有機(jī)聚合物整體柱進(jìn)行表面功能化修飾，鍵合一層排列規(guī) 貝1J、致密、連續(xù)的高密度納米材料。
[0012] 步驟D中所用的酶溶液是用pH 6. 5?8. 0的磷酸緩沖溶液配制，其濃度為5? 50mg/mL〇 【專利附圖】

【附圖說明】 圖1不同粒徑的納米金顆粒的透射電子顯微鏡（TEM)圖。（a)15nm，（b)17nm，（c)30nm, (d) 40nm，(e) 50nm。 圖2磁性四氧化三鐵（Fe304)納米微球的透射電子顯微鏡圖。 圖3 Fe304@Si02核-殼結(jié)構(gòu)納米微球的透射電子顯微鏡圖。 圖4 Poly(GMA-co-EDMA)毛細(xì)管整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)圖。 圖5 Poly(MS-co-CMS-co-DVB)毛細(xì)管整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)圖。 圖6基于聚丙烯注射器的聚合物整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)圖 (poly (GMA-c〇-EDMA) (a), poly (BMA-c〇-EDMA) (b), poly (LMA-c〇-EDMA) (c)) 〇 圖7鍵合15nm納米金的p〇ly(GMA-C〇-EDMA)毛細(xì)管整體柱截面的掃描電子顯微鏡 (SEM)圖。 圖8 37°C下游離酶與固定化酶對細(xì)胞色素 C酶解的高效液相色譜（HPLC)對比圖。（1) 細(xì)胞色素 C，（2)納米金整體柱固定化酶催化1.6min，（3)游離酶催化24h。 圖9納米金整體柱固定化酶對細(xì)胞色素 C進(jìn)行酶解的多肽片段的MALDI-T0D-MS圖。 圖10 37°C下游離酶與固定化酶對牛血清白蛋白（BSA)酶解的高效液相色譜（HPLC)對 比圖。（1)牛血清白蛋白（BSA)，（2)納米金整體柱固定化酶催化1.6min，（3)游離酶催化 24h。 圖11納米金整體柱固定化酶對牛血清白蛋白（BSA)進(jìn)行酶解的多肽片段的 MALDI-T0D-MS 圖。 【具體實(shí)施方式】 下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明 的應(yīng)用范圍。 實(shí)施例 實(shí)施例1 :納米金的合成 (1)不同粒徑的納米金的合成 向2000mL的錐形瓶中加入50mg的氯金酸，500mL的超純水，磁力攪拌下加熱至98°C, 再加入一定量的檸檬酸鈉，維持溫度在98°C下反應(yīng)，反應(yīng)液顏色幾秒內(nèi)變藍(lán)繼而變黑，再變 為紅色，繼續(xù)加熱l〇min后停止加熱，繼續(xù)攪拌0. 5h，制備得到納米金膠體溶液，室溫冷卻 后高速離心純化，保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^改變檸檬酸鈉的用量改變合成的納米金的粒徑大小，如表 1所示。利用透射電子顯微鏡（TEM)研究合成的納米金膠體的粒徑大小和形貌（圖1)。 實(shí)施例2 :Fe304@Si02-NH2磁性納米顆粒的合成 (1) 溶劑熱法合成磁性Fe304納米顆粒 將 FeCl3. 6H20(1.35g，5mmol)和 NaAc(3. 6g)溶解在乙二醇（50mL)中，超聲 30min 使固 體充分溶解分散，將分散液轉(zhuǎn)移到帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓釜中密封，200°C下反應(yīng) 8h，反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻，借助磁鐵用無水乙醇和水交替洗4次，60°C真空干燥6h得到磁性 Fe304納米顆粒，其透射電子顯微鏡照片如圖2所示。 (2) Fe304@Si02核-殼結(jié)構(gòu)納米顆粒的合成 將（1)中制備的磁性Fe304納米顆粒350mg分散在160mL的乙醇中，超聲處理0. 5h。依 次加入lmL氨水（25wt% )、40mL H20和lmL正娃酸乙酯，室溫下機(jī)械攪拌6h，借助磁鐵用 50mL乙醇清洗3次，得到Fe30 4@Si02核-殼結(jié)構(gòu)的磁性納米顆粒，其透射電子顯微鏡照片如 圖3所示。 ⑶Fe304@Si02-NH2磁性納米顆粒的合成 將Fe304@Si02核-殼結(jié)構(gòu)納米顆粒分散在60mL異丙醇中，將lmL 3-氨丙基三乙氧基硅 烷滴加到分散液中，室溫下機(jī)械攪拌24h，借助磁鐵用無水乙醇洗4-5次，50°C真空干燥6h 得到Fe304@Si02-NH2磁性納米顆粒。 實(shí)施例3 :金屬有機(jī)框架材料MIL-101的合成 利用水熱法合成MIL-101，具體的步驟如下：稱取2. 0g的Cr (N03) 3. 6H20溶于25mL去 離子水，充分溶解后加入〇. 83g對苯二甲酸，再加入410 μ L氫氟酸。然后將混合溶液移入 100mL的帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，放置于220°C的烘箱中反應(yīng)8h。冷 卻后將產(chǎn)物過濾、洗滌，60°C下抽空干燥，即得到綠色粉末和白色針狀晶體的混合物。產(chǎn)物 依次利用Ν，Ν' -二甲基甲酰胺、三氯甲烷和無水乙醇，以除去白色針狀晶體和堵塞在孔道 內(nèi)的未反應(yīng)的無機(jī)和有機(jī)雜質(zhì)，得到粒徑約為500nm的MIL-101。利用BET法測定MIL-101 的比表面積，為3000m 2/g。 實(shí)施例4 :有機(jī)聚合物整體柱在毛細(xì)管中的合成 (1) 毛細(xì)管內(nèi)壁的活化 將內(nèi)徑為1〇〇 μ m、外徑為365 μ m的石英毛細(xì)管，其內(nèi)壁首先依次采用丙酮和水清洗， 再利用2M NaOH在120°C下活化3h。毛細(xì)管內(nèi)壁利用水洗至中性后，再利用0. 25M的鹽酸 在室溫下活化0. 5h，用水洗至中性，之后用丙酮清洗，氮?dú)獯蹈?，放置?20°C的真空干燥 箱里干燥2h。 (2) 毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合雙鍵 將3-(三甲氧基甲硅烷基）丙基丙烯酸酯溶于無水甲苯中，濃度為20% (v/v)。利用 注射泵以〇. 5 μ L/min的流速將30 μ L的上述溶液連續(xù)泵入活化后的毛細(xì)管內(nèi)反應(yīng)。之后 用丙酮將毛細(xì)管內(nèi)壁沖洗干凈，放置24h后使用。 (3) Poly(GMA-c〇-EDMA)毛細(xì)管整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸 酯（EDMA)，30% (wt% )的環(huán)己醇，30% (wt% )的十二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑的 質(zhì)量）的引發(fā)劑的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后裝入內(nèi)壁鍵合雙鍵的石英毛細(xì)管內(nèi)， 通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)合成毛細(xì)管整體柱。其中，熱引發(fā)采用偶氮二異丁腈（AIBN)為引 發(fā)劑，反應(yīng)條件為在60°C下反應(yīng)24h。光引發(fā)采用2,2_二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA) 為引發(fā)劑，光引發(fā)波長為365nm，光強(qiáng)為12mw/cm 2,光照時間為15min。反應(yīng)完成后利用甲醇 沖洗毛細(xì)管柱2h，以除去柱內(nèi)的致孔劑和未反應(yīng)的物質(zhì)，從而制得poly (GMA-co-EDMA)毛 細(xì)管整體柱。合成的整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)分析如圖4所示。 (4) Poly(BMA-c〇-EDMA)毛細(xì)管整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸丁酯（BMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，40% (wt% )的正丙醇，20% (wt% )的1，4_ 丁二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質(zhì)量）的引發(fā)劑的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后裝入內(nèi)壁鍵合雙鍵的石英毛細(xì)管 內(nèi)，按照（3)中的方法通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)合成poly(BMA-co-EDMA)毛細(xì)管整體柱。 (5) Poly(LMA-c〇-EDMA)毛細(xì)管整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸月桂酯（LMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，40% (wt%)的正丙醇，20% (wt%)的1，4_ 丁二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質(zhì)量）的引發(fā)劑的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后裝入內(nèi)壁鍵合雙鍵的石英毛細(xì)管 內(nèi)，按照（3)中的方法通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)合成poly(LMA-co-EDMA)毛細(xì)管整體柱。 (6) Poly (MS-co-CMS-co-DVB)毛細(xì)管整體柱的合成 將21% (wt% )的甲基苯乙烯（MS)，7% (wt% )的氯甲基苯乙烯（CMS)，12%二乙烯 基苯（DVB)，13% (wt%)的甲苯，47% (wt%)的月桂醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑的質(zhì) 量）的偶氮二異丁腈（AIBN)引發(fā)劑的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后裝入內(nèi)壁鍵合雙 鍵的石英毛細(xì)管內(nèi)，按照（3)中的方法通過原位熱引發(fā)合成poly (MS-co-CMS-co-DVB)毛細(xì) 管整體柱。合成的整體柱截面的掃描電子顯微鏡（SEM)分析如圖5所示。 實(shí)施例5 :有機(jī)聚合物整體柱在聚丙烯注射器中的合成 (1) 聚丙烯注射器內(nèi)壁鍵合雙鍵 將內(nèi)徑為5. 6mm、長度為5. 5cm的聚丙烯注射器，其內(nèi)壁首先依次采用乙醇和丙酮清 洗，氮?dú)獯蹈珊?，加入? 5mL濃度為5wt%的脫氧苯甲酮的甲醇溶液，UV 365nm下光照3min， 光強(qiáng)為20mw/cm2。采用甲醇徹底清洗后，利用氮?dú)獯蹈?，再加?. 5mL濃度為15wt%的二 甲基丙烯酸乙二醇酯的甲醇溶液，UV 365nm下光照3min，光強(qiáng)為20mw/cm2。最后利用甲醇 徹底清洗注射器內(nèi)壁，采用氮?dú)獯蹈伞?(2) P〇ly(GMA-C〇-EDMA)注射器整體柱的合成 將24% (wt%)的甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)，16% (wt%)的乙二醇二甲基丙烯酸 酯（EDMA)，20% (wt%)的環(huán)己醇，40% (wt%)的十二醇和1 % (是功能單體和交聯(lián)劑的質(zhì) 量）的2,2_二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后裝入內(nèi) 壁鍵合雙鍵的聚丙烯注射器內(nèi)，通過原位光引發(fā)合成注射器整體柱，光引發(fā)波長為365nm， 光強(qiáng)為20m W/cm2,光照時間為6min。反應(yīng)完成后利用甲醇沖洗注射器整體柱，以除去柱內(nèi) 的致孔劑和未反應(yīng)的物質(zhì)，從而制得P〇ly(GMA- c〇-EDMA)注射器整體柱，其截面的掃描電 子顯微鏡（SEM)如圖6(a)所示。 (3) P〇ly(BMA-C〇-EDMA)注射器整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸丁酯（BMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，26% (wt% )的正丙醇，34% (wt% )的1，4_ 丁二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質(zhì)量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后 裝入內(nèi)壁鍵合雙鍵的聚丙烯注射器內(nèi)，通過原位光引發(fā)合成注射器整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強(qiáng)為20m W/cm2,光照時間為6min。反應(yīng)完成后利用甲醇沖洗注射器整體柱，以除 去柱內(nèi)的致孔劑和未反應(yīng)的物質(zhì)，從而制得P〇ly(BMA-c〇-EDMA)注射器整體柱，其截面的 掃描電子顯微鏡（SEM)如圖6(b)所示。 (4)P〇ly(LMA-C〇-EDMA)注射器整體柱的合成 將24% (wt%)的甲基丙烯酸月桂酯（LMA)，16% (wt%)的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，26% (wt% )的正丙醇，34% (wt% )的1，4_ 丁二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質(zhì)量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后 裝入內(nèi)壁鍵合雙鍵的聚丙烯注射器內(nèi)，通過原位光引發(fā)合成注射器整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強(qiáng)為20m W/cm2,光照時間為6min。反應(yīng)完成后利用甲醇沖洗注射器整體柱，以除 去柱內(nèi)的致孔劑和未反應(yīng)的物質(zhì)，從而制得poly (LMA-co-EDMA)注射器整體柱，其截面的 掃描電子顯微鏡（SEM)如圖6(c)所示。 實(shí)施例6 :有機(jī)聚合物整體柱在聚丙烯移液槍槍頭中的合成 (1) 聚丙烯移液槍槍頭的內(nèi)壁鍵合雙鍵 將10?200 μ L的聚丙烯移液槍槍頭，其內(nèi)壁首先依次采用乙醇和丙酮清洗，氮?dú)獯蹈?后，加入5 μ L濃度為5wt%的脫氧苯甲酮的甲醇溶液，UV 365nm下光照3min，光強(qiáng)為20mw/ cm2。采用甲醇徹底清洗后，利用氮?dú)獯蹈?，再加? μ L濃度為15wt %的二甲基丙烯酸乙二 醇酯的甲醇溶液，UV 365nm下光照3min，光強(qiáng)為20mw/cm2。最后利用甲醇徹底清洗槍頭內(nèi) 壁，采用氮?dú)獯蹈伞?(2) Poly(GMA-c〇-EDMA)槍頭整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯 酸酯（EDMA)，20% (wt% )的環(huán)己醇，40% (wt% )的十二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑 的質(zhì)量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后裝 入內(nèi)壁鍵合雙鍵的聚丙烯移液槍槍頭內(nèi)，通過原位光引發(fā)合成槍頭整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強(qiáng)為20mw/cm 2,光照時間為6min。反應(yīng)完成后利用甲醇沖洗槍頭整體柱，以除去 柱內(nèi)的致孔劑和未反應(yīng)的物質(zhì)，從而制得poly (GMA-co-EDMA)槍頭整體柱。 (3) Poly(BMA-c〇-EDMA)槍頭整體柱的合成 將24% (wt% )的甲基丙烯酸丁酯（BMA)，16% (wt% )的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，20% (wt%)的環(huán)己醇，40% (wt%)的十二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑的 質(zhì)量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后裝 入內(nèi)壁鍵合雙鍵的聚丙烯移液槍槍頭內(nèi)，通過原位光引發(fā)合成槍頭整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強(qiáng)為20mw/cm 2,光照時間為6min。反應(yīng)完成后利用甲醇沖洗槍頭整體柱，以除去 柱內(nèi)的致孔劑和未反應(yīng)的物質(zhì)，從而制得poly (BMA-co-EDMA)槍頭整體柱。 (4) Poly(LMA-c〇-EDMA)槍頭整體柱的合成 將24% (wt%)的甲基丙烯酸月桂酯（LMA)，16% (wt%)的乙二醇二甲基丙烯酸酯 (EDMA)，20% (wt%)的環(huán)己醇，40% (wt%)的十二醇和1% (是功能單體和交聯(lián)劑的 質(zhì)量）的2, 2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA)的混合溶液超聲混勻，通氮?dú)?min后裝 入內(nèi)壁鍵合雙鍵的聚丙烯移液槍槍頭內(nèi)，通過原位光引發(fā)合成槍頭整體柱，光引發(fā)波長為 365nm，光強(qiáng)為20mw/cm 2,光照時間為6min。反應(yīng)完成后利用甲醇沖洗槍頭整體柱，以除去 柱內(nèi)的致孔劑和未反應(yīng)的物質(zhì)，從而制得poly (LMA-co-EDMA)槍頭整體柱。 實(shí)施例7 :Poly(BMA-c〇-EDMA)和Poly(LMA-co-EDMA)整體柱的表面接枝改性 分別將Poly(BMA-co-EDMA)和Poly(LMA-co-EDMA)整體柱進(jìn)行表面接枝甲基丙烯酸縮 水甘油酯，鍵合環(huán)氧基團(tuán)，以便于后續(xù)的功能化修飾。具體步驟如下：向整體柱中充滿濃度 為5wt%的脫氧苯甲酮的甲醇溶液，UV 365nm下光照15min，光強(qiáng)為20mw/cm2。利用甲醇將 整體柱徹底清洗后，再充滿濃度為15wt%的甲基丙烯酸縮水甘油酯的甲醇溶液，UV 365nm 下光照15min，光強(qiáng)為20mw/cm2,最后將整體柱利用甲醇徹底清洗。 實(shí)施例8 :納米金有機(jī)聚合物毛細(xì)管整體柱的合成 將實(shí)例4(3)中合成的？〇17(6嫩-(：〇40嫩）毛細(xì)管整體柱首先和1111〇1/1的胱胺溶液反 應(yīng)，反應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)時間2h。反應(yīng)完成后，用水將整體柱沖至中性。之后，將整體柱 與0. 25mol/L的二硫蘇糖醇（DTT)或三（2-羰基乙基）磷（TCEP)溶液在室溫下反應(yīng)2h， 即可得到表面修飾巰基的SH-p 〇ly(GMA-C〇-EDMA)整體柱。能量彌撒光譜（EDS)測定顯示 整體柱上的S元素含量為7. 23wt %，表明在整體柱上成功鍵合了巰基（-SH)。最后，將實(shí)例 1中合成的粒徑為15nm的納米金膠體水溶液用注射泵泵入表面修飾巰基的整體柱內(nèi)，在整 體柱上鍵合納米金，直至飽和，得到納米金整體柱，其截面的掃描電子顯微鏡（SEM)如圖7 所示。能量彌撒光譜（EDS)測定顯示納米金整體柱上的Au元素含量為52. 70wt%,表明在 整體柱上成功鍵合了納米金。 實(shí)施例9 :納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應(yīng)器的制備方法 將實(shí)施例8中制備好的AuNPs-poly (GMA-co-EDMA)整體柱，用50mmol/L pH 7. 2的磷酸 緩沖溶液沖洗平衡后，將lmL濃度為50mmol/L的胰蛋白酶泵入AuNPS-p〇ly(GMA- C〇-EDMA) 整體柱中，使酶固定到整體柱表面納米金載體上至飽和，用50mmol/L pH 7. 2的磷酸緩沖液 沖洗該整體柱，除去未被固定的酶，得到納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應(yīng)器。 實(shí)施例10 :納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應(yīng)器酶解細(xì)胞色素 C 將實(shí)施例9中合成的納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應(yīng)器應(yīng)用于酶解細(xì)胞色素 C。具體步驟如下：在100mmol/L(pH 8. 2)的碳酸氫銨溶液中，配置濃度為1.5mg/mL的細(xì) 胞色素 C。采用注射泵在0. 5 μ L/min的流速下，將細(xì)胞色素 C溶液泵入實(shí)施例9中合成的 納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應(yīng)器中，在37°C下發(fā)生酶解反應(yīng)。將流出液體收集于 1. 5mL的樣品瓶中，進(jìn)行液相色譜（HPLC)分析酶解后的多肽片段（圖8)，同時，利用基質(zhì)輔 助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS)分析酶解后的多肽片段（圖9)。 將上述配置的濃度為1. 5mg/mL的細(xì)胞色素 C，用pH = 8. 75的乙酸銨溶液稀釋到 0. 15mg/mL，按物質(zhì)質(zhì)量比為50 : l(w/w)加入胰蛋白酶液，在搖床中37°C下反應(yīng)24h，之后 加入lmL的乙酸溶液終止反應(yīng)，將溶液過濾，進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS)分析酶解后 的多肽片段（圖8)。 實(shí)施例11 :納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應(yīng)器酶解牛血清白蛋白（BSA) 將實(shí)例2中合成的納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應(yīng)器應(yīng)用于酶解牛血清白蛋 白（BSA)。具體步驟如下： (1)在pH值為8. 2的含有8mol/L尿素的碳酸氫銨溶液中，得到濃度為5mg/mL的BSA 溶液。 ⑵取步驟（1)中配置的BSA溶液lmL，加入lmL的45mM的二硫蘇糖醇（DTT)溶液，在 60°C 下反應(yīng) 45min。 (3)將步驟（2)中得到的溶液取出，恢復(fù)至室溫。再加入lmL濃度為100mM的碘乙酰胺 (IAA)溶液，于黑暗環(huán)境中反應(yīng)30min。 (4) 將步驟（3)中得到的溶液加入濃度為50mM的乙酸銨溶液（pH = 8. 75)，用截留分 子量為30000的超濾離心管在6000rpm的轉(zhuǎn)速下離心3次，每次30min。 (5) 將步驟（4)中離心后的溶液用濃度為50mM的乙酸銨溶液（pH = 8. 75)稀釋至 0· 15mg/mL〇 (6) 采用注射泵在0. 5 μ L/min的流速下，將步驟（5)中得到的BSA溶液泵入實(shí)例2中 合成的納米金整體柱固載胰蛋白酶生物微反應(yīng)器中，在37°C下發(fā)生酶解反應(yīng)。將流出液體 收集于1. 5mL的樣品瓶中，進(jìn)行液相色譜（HPLC)分析酶解后的多肽片段（圖10)，同時，利 用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS)分析酶解后的多肽片段（圖11)。 ⑵將步驟（5)中配置的濃度為0. 15mg/mL的BSA溶液，按物質(zhì)質(zhì)量比為50 : 1 (w/w) 加入胰蛋白酶液，在搖床中37°C下反應(yīng)24h，之后加入lmL的乙酸溶液終止反應(yīng)，將溶液過 濾，進(jìn)行液相色譜（HPLC)分析酶解后的多肽片段（圖10)。 實(shí)施例12 :納米金整體柱固載米根毛霉脂肪酶生物微反應(yīng)器的制備方法 將米根毛霉脂肪酶溶解在pH 7. 6的磷酸緩沖溶液中，濃度為50mmol/L。利用注射泵以 0. 5 μ L/min的流速，室溫下將米根毛霉脂肪酶溶液泵入實(shí)例1中合成的納米金整體柱內(nèi)， 直至飽和。之后，用0. 5mL 50mmol/L pH 7. 2的磷酸緩沖溶液沖洗該整體柱，除去未鍵合的 米根毛霉脂肪酶，即得到納米金固定化米根毛霉脂肪酶生物微反應(yīng)器。 實(shí)例13 :納米金整體柱固載米根毛霉脂肪酶生物微反應(yīng)器手性拆分布洛芬丙酯 將實(shí)例10中合成的納米金整體柱固載米根毛霉脂肪酶生物微反應(yīng)器應(yīng)用于手性拆分 布洛芬。在40°C下，0· 03mol/L的外消旋布洛芬和0· 06mol/L的正丙醇溶于正己烷中，以 0. 5uL/min的流速，進(jìn)行連續(xù)催化，對外消旋布洛芬進(jìn)行手性拆分，轉(zhuǎn)化率為46,選擇性E值 為9。而米根毛霉脂肪酶在游離狀態(tài)下的選擇性E值僅為2。 表1合成不同粒徑大小的納米金膠體所用的氯金酸和檸檬酸鈉的用量。 表2納米金整體柱固定化酶對細(xì)胞色素 C進(jìn)行酶解的多肽片段經(jīng)過二級分析后比對 正確的多肽片段。 表3納米金整體柱固定化酶對牛血清白蛋白（BSA)進(jìn)行酶解的多肽片段經(jīng)過二級分 析后比對正確的多肽片段。 表1

【權(quán)利要求】
1. 一種納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器的制備方法，其特征在于包括：步驟A，制 備納米材料；納米材料包括納米金、納米銀、納米二氧化娃、足球烯C 6(l、碳納米管、石墨烯、 磁性四氧化三鐵、金屬-有機(jī)框架材料MOF或共價有機(jī)骨架COF ;其中，納米材料的粒徑在 5 ?lOOOnm ; 步驟B，有機(jī)聚合物整體柱的合成：包括質(zhì)量百分比為5?30%功能單體、5?30%交 聯(lián)劑和30?80%致孔劑，并且功能單體、交聯(lián)劑和致孔劑的質(zhì)量總和為100%，另外還加 入功能單體和交聯(lián)劑質(zhì)量的〇. 2?5%的引發(fā)劑的混合溶液，通過原位熱引發(fā)或光引發(fā)在 不銹鋼色譜柱、毛細(xì)管、聚丙烯基槍頭、聚丙烯基注射器、高硼硅玻璃板和硅晶片中合成多 孔有機(jī)聚合物整體柱；其中不銹鋼色譜柱的內(nèi)徑為3-6mm，長度為6-30cm ;毛細(xì)管的內(nèi)徑為 50-600 μ m，長度為5-50cm ;聚丙烯基槍頭的體積為0. Ol-lOmL ;聚丙烯基注射器的體積為 0· Ι-lOmL ;熱引發(fā)反應(yīng)溫度為45?85°C，反應(yīng)時間6?48h ;光引發(fā)波長為254nm或365nm， 光強(qiáng)為6-30mW/cm2,光照時間為5-60min ;功能單體包括甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯 酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸月桂酯、丙烯酸、丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、甲基 丙烯酸丙炔基酯、縮水甘油基炔丙基醚、2-乙烯基-4,4-二甲基-2-惡唑啉-5-酮、2-甲 基-2-丙烯酸_2, 3-二羥基丙酯、苯乙烯或4-乙烯基吡啶；交聯(lián)劑包括乙二醇二甲基丙烯 酸酯、三烯丙基異三聚氰酸酯、二乙烯基苯、Ν，Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺；致孔劑包括甲苯、正 庚烷、環(huán)己醇、十二醇、正丙醇、1，4_ 丁二醇或不同分子量的聚乙二醇；引發(fā)劑包括偶氮二 異丁臆、偶氮二異庚臆、2, 2-二甲氧基_2_苯基苯乙酮或2-輕基-2-甲基-1-苯基丙酮； 步驟C，合成納米材料整體柱：對多孔有機(jī)聚合物整體柱進(jìn)行功能化修飾； 步驟D，以納米材料為中間配體，在整體柱上實(shí)現(xiàn)酶的固定化，設(shè)計制備納米材料整體 柱固載酶生物微反應(yīng)器。
2. 如權(quán)利要求1所述的納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器的制備方法，其特征在 于：酶溶液是用pH 6. 5?8. 0的磷酸緩沖溶液配制，其濃度為5?50mg/mL。
3. 用權(quán)利要求1或2所述的制備方法制備的納米材料整體柱固載酶生物微反應(yīng)器。
【文檔編號】C12M1/40GK104195042SQ201410361654
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月27日
【發(fā)明者】呂永琴, 譚天偉, 王紅霞, 朱正禮, 林祥華 申請人:北京化工大學(xué)