一種賴氨酸的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種賴氨酸的生產(chǎn)方法，該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)2-6小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加促進(jìn)劑，在發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前6-8小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加無(wú)機(jī)鹽，在發(fā)酵培養(yǎng)16-20小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)40-42小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加氨基酸，在發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)42-48小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加維生素，其中，該促進(jìn)劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨基三乙酸鈉中的一種或多種。本發(fā)明提供的方法能夠提高終點(diǎn)賴氨酸含量、單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率。
【專利說(shuō)明】一種賴氨酸的生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種賴氨酸的生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 賴氨酸是人和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的八種必需氨基酸之一，它對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡、提高體 內(nèi)對(duì)谷類蛋白質(zhì)的吸收、改善人類膳食營(yíng)養(yǎng)和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、醋精生長(zhǎng)發(fā)育均有重要作用。目前 主要用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)，從消費(fèi)結(jié)構(gòu)上看，賴氨酸在飼料中的消費(fèi)占了近90%，而 在食品及醫(yī)藥中間體的消費(fèi)僅占10%。
[0003] -般情況下賴氨酸的生產(chǎn)是通過將賴氨酸發(fā)酵菌種經(jīng)過種子培養(yǎng)后接種至發(fā)酵 培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生賴氨酸。在賴氨酸發(fā)酵過程中，需要碳水化合物、蛋白質(zhì)和前體等物質(zhì)提 供能量和構(gòu)成特定產(chǎn)物的需要，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一般包括碳源、氮源（有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源）、無(wú) 機(jī)鹽及微量元素、生長(zhǎng)因子、前體、產(chǎn)物促進(jìn)和抑制劑等。
[0004] 在賴氨酸的發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，賴氨酸酸度逐漸提高，且隨著碳源和氮 源的流加以及發(fā)酵過程中的放料，發(fā)酵罐中碳、氮以外的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度逐漸降低，賴 氨酸菌種過早衰老、自溶，代謝能力下降，發(fā)酵產(chǎn)酸速率呈下降趨勢(shì)；最終因發(fā)酵產(chǎn)酸速率 緩慢而放罐，致使限制了賴氨酸的產(chǎn)能，成本較高，經(jīng)濟(jì)效益較低；另外，培養(yǎng)基中的各底物 避免不了相互之間的抑制，降低有效成分，同時(shí)也降低了發(fā)酵水平，不利于賴氨酸的產(chǎn)能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中賴氨酸產(chǎn)能不高的缺陷的提供一種新的賴氨酸 的生產(chǎn)方法。
[0006] 本發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，根據(jù)賴氨酸不同的生長(zhǎng)周期的營(yíng)養(yǎng)需求，對(duì)賴氨酸 的發(fā)酵過程進(jìn)行調(diào)控，優(yōu)化出合理的培養(yǎng)基成分的添加順序和添加周期：即在發(fā)酵培養(yǎng) 2-6小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加促進(jìn)劑，在發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)后至 發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前6-8小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加無(wú)機(jī)鹽，在發(fā)酵培養(yǎng)16-20小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng) 40-42小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加氨基酸，在發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)42-48小時(shí)內(nèi) 向發(fā)酵液中流加維生素，能夠提高終點(diǎn)賴氨酸含量、單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率，即提高賴氨酸產(chǎn) 能，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。這可能是因?yàn)楦鶕?jù)賴氨酸發(fā)酵不同周期產(chǎn)賴氨酸變化，流加賴氨 酸發(fā)酵所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以減少培養(yǎng)基底物之間的相互抑制和減少底物之間的美拉德反 應(yīng)，進(jìn)而提高培養(yǎng)基中有效成分的利用率；此外，促進(jìn)劑可以促進(jìn)葡萄糖氧化酶的形成，保 證TCA循環(huán)酶系活力，改進(jìn)了細(xì)胞膜的滲透性，同時(shí)增強(qiáng)了氧的傳遞速度，改善了菌體對(duì)氧 的有效利用，以增加賴氨酸的積累。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種賴氨酸的生產(chǎn)方法，該方法包括將賴氨酸發(fā) 酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中， 在發(fā)酵培養(yǎng)2-6小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加促進(jìn)劑，在發(fā)酵培養(yǎng)12-16 小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前6-8小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加無(wú)機(jī)鹽，在發(fā)酵培養(yǎng)16-20小時(shí)后至 發(fā)酵培養(yǎng)40-42小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加氨基酸，在發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)42-48 小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加維生素，其中，所述促進(jìn)劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨 基三乙酸鈉中的一種或多種。
[0008] 本發(fā)明提供的賴氨酸的生產(chǎn)方法，可提高終點(diǎn)賴氨酸含量、單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率， 即提1?賴氣酸廣能，從而提1?經(jīng)濟(jì)效益。
[0009] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0011] 本發(fā)明提供了一種賴氨酸的生產(chǎn)方法，該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸 發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，在發(fā)酵培養(yǎng)2-6小 時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加促進(jìn)劑，在發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)后至發(fā)酵培 養(yǎng)結(jié)束前6-8小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加無(wú)機(jī)鹽，在發(fā)酵培養(yǎng)16-20小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)40-42 小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加氨基酸，在發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)42-48小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵 液中流加維生素，其中，所述促進(jìn)劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨基三乙酸鈉中 的一種或多種。
[0012] 需要說(shuō)明的是，"在發(fā)酵培養(yǎng)2-6小時(shí)后"指的是在發(fā)酵培養(yǎng)2-6小時(shí)的時(shí)間段內(nèi) 選擇流加促進(jìn)劑的時(shí)間起點(diǎn)，"至發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)內(nèi)"指的是在發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)內(nèi) 選擇流加促進(jìn)劑的時(shí)間終點(diǎn)，在選擇的流加促進(jìn)劑的時(shí)間起點(diǎn)至選擇的流加促進(jìn)劑的時(shí)間 終點(diǎn)的這個(gè)時(shí)間段內(nèi)可以采用間歇流加或連續(xù)流加方式，向發(fā)酵液流加無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和 維生素的時(shí)間段的選擇與此類似。
[0013] 為了更好的提高賴氨酸產(chǎn)能，優(yōu)選地，在發(fā)酵培養(yǎng)2-6小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)12-15小 時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加促進(jìn)劑，在發(fā)酵培養(yǎng)13-15小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前6-8小時(shí)內(nèi)向發(fā) 酵液中流加無(wú)機(jī)鹽，在發(fā)酵培養(yǎng)16-18小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)40-42小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加氨 基酸，在發(fā)酵培養(yǎng)20-22小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)45-48小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加維生素。
[0014] 本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指微生物發(fā)酵所需的供微 生物生長(zhǎng)和維持用的人工配制的養(yǎng)料。
[0015] 本發(fā)明中，促進(jìn)劑是指那些細(xì)胞生長(zhǎng)非必需的且既不是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又不是前體，但 卻能提1?廣量的添加劑。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，所述促進(jìn)劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨基三乙酸鈉中 的一種或多種?？紤]到有機(jī)金屬離子螯合劑的螯合能力和螯合物的穩(wěn)定性受發(fā)酵培養(yǎng)所需 的pH值的影響，優(yōu)選情況下，所述促進(jìn)劑為乙二胺四乙酸。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，所述賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基可以為含有促進(jìn)劑的培養(yǎng)基或不含促進(jìn)劑的 培養(yǎng)基?？紤]到利于賴氨酸的生長(zhǎng)，優(yōu)選情況下，所述賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為含有促進(jìn)劑的培 養(yǎng)基。
[0018] 本發(fā)明對(duì)賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的其他成分（碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和維生素） 無(wú)特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的物質(zhì)，例如，可以用淀粉質(zhì)原料液化清液、糖蜜、玉 米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、蘇氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、生物素、煙 酰胺和維生素 B1等配制本發(fā)明的培養(yǎng)基。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，每升賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu) 選情況下，相對(duì)于每升賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，淀粉質(zhì)原料液化清液的用量可以為30-70克， 糖蜜的用量可以為20-40克，玉米漿（干重為18-52重量％ )的用量可以為25-50克，硫 酸銨的用量可以為30-50克，磷酸二氫鉀的用量可以為0. 4-1. 2克，硫酸鎂的用量可以為 0. 2-0. 5克，硫酸亞鐵的用量可以為0. 01-0. 05克，硫酸錳的用量可以為0. 01-0. 08克， 蘇氨酸的用量可以為〇. 1-0. 4克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 5克，谷氨酸的用量可以為 0. 2-0. 6克，生物素的用量可以為0. 05-0. 8毫克，煙酰胺的用量可以為0. 1-1. 0毫克，維生 素 B1的用量可以為0. 2-0. 8毫克，促進(jìn)劑的用量可以為9-25克。
[0020] 其中，所述淀粉質(zhì)原料液化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法 制糖工藝制備。從工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備投資少，生產(chǎn)成本較低的方面考慮，優(yōu)選通過干法制糖工 藝制備。
[0021] 干法制糖工藝是指淀粉質(zhì)原料不經(jīng)浸泡直接進(jìn)行破碎和酶解。干法制糖工藝可以 包括：將淀粉質(zhì)原料粉碎，將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物調(diào)漿，并加入淀粉酶對(duì)淀粉進(jìn)行第一 次水解（酶解），然后進(jìn)行碘試，碘試呈本色合格，不需進(jìn)行二次酶解，若碘試不合格，需進(jìn) 行二次水解（酶解）：在第一水解產(chǎn)物中加入淀粉酶進(jìn)行第二次水解，碘試合格，對(duì)二次水 解產(chǎn)物進(jìn)行固液分離得到淀粉質(zhì)原料液化清液。
[0022] 優(yōu)選地，粉碎使淀粉質(zhì)原料過60目篩的通過率大于66%，更優(yōu)選過60目篩的通過 率為100%。其中，所述調(diào)漿的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，優(yōu)選地，調(diào)漿的方法可以包括 將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以 為14-17波美度（波美度是表示溶液濃度的一種方法，是通過波美比重計(jì)檢測(cè)溶液得到的 度數(shù)）。
[0023] 所述淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)域公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備賴氨酸的含有 淀粉的原料，例如，可以為選自玉米、薯類（如木薯）和小麥中的一種或幾種。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，在第一次水解中，以每克粉碎后的產(chǎn)物的干重計(jì)，淀粉酶的用量可以 為110-130個(gè)酶活力單位，酶解的溫度可以為82-84°C，酶解的時(shí)間可以為90-120分鐘，酶 解的pH值可以為5. 8-6.0。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，在第二次水解中，以每克液相組分計(jì)，淀粉酶的用量可以為10-30個(gè) 酶活力單位，酶解的溫度可以為90-95°C，酶解的時(shí)間可以為10-20分鐘，酶解的pH值可以 為5. 8-6. 0。固液分離的條件沒有特別的限定，優(yōu)選地，固液分離的條件使得到的液相組分 中的固含量為19-22重量％，更優(yōu)選為20-21重量％。
[0026] 本發(fā)明酶活力單位的定義為：在pH值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫 克淀粉轉(zhuǎn)化為還原性糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
[0027] 淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述淀粉酶一般包括α -淀粉 酶、β-淀粉酶。
[0028] α -淀粉酶又稱淀粉1，4-糊精酶，它能夠任意地、不規(guī)則地切開淀粉鏈內(nèi)部的 α -1，4-糖苷鍵，將淀粉水解為麥芽糖、含有6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生 產(chǎn)此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。
[0029] β -淀粉酶又稱淀粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從淀粉分子非還原性末端切開1，4-糖 苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用于淀粉的產(chǎn)物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和 內(nèi)孢霉產(chǎn)生。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶。
[0031] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述淀粉質(zhì)原料液化清液中的葡萄糖含量為20-30重量％。
[0032] 在本發(fā)明中，發(fā)酵液為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的概念，指接入微生物菌株的液體培 養(yǎng)基經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后所得產(chǎn)物。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，流加的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和維生素為本領(lǐng)域的公知的各種 碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和維生素。優(yōu)選情況下，所述碳源為淀粉質(zhì)原料液化清液；所述 氮源為銨鹽，所述銨鹽為硫酸銨；所述無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳和磷酸二氫鉀中 的一種或多種；所述氨基酸為蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸中的一種或多種；所述維生素為生 物素、煙酰胺和維生素 Β1中的一種或多種。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明，流加促進(jìn)劑的量使發(fā)酵液中促進(jìn)劑的濃度控制在8-12克/升；流 加無(wú)機(jī)鹽的量使發(fā)酵液中無(wú)機(jī)鹽的濃度控制在〇. 01-1. 2克/升，流加氨基酸的量使發(fā)酵 液中氨基酸的濃度控制在〇. 1-0. 6克/升，流加維生素的量使發(fā)酵液中維生素的濃度控制 在0. 05-1毫克/升。優(yōu)選情況下，為了進(jìn)一步提高賴氨酸的產(chǎn)能，流加促進(jìn)劑的量使發(fā)酵 液中促進(jìn)劑的濃度控制在9-11克/升；流加硫酸鎂的量使發(fā)酵液中硫酸鎂的濃度控制在 0. 2-0. 5克/升，流加硫酸亞鐵的量使發(fā)酵液中硫酸亞鐵的濃度控制在0. 01-0. 05克/升， 流加硫酸錳的量使發(fā)酵液中硫酸錳的濃度控制在〇. 01-0. 08克/升，流加磷酸二氫鉀的量 使發(fā)酵液中磷酸二氫鉀的濃度控制在〇. 4-1. 2克/升；流加蘇氨酸的量使發(fā)酵液中蘇氨酸 的濃度控制在〇. 1-0. 4克/升，流加蛋氨酸的量使發(fā)酵液中蛋氨酸的濃度控制在0. 1-0. 5 克/升；流加谷氨酸的量使發(fā)酵液中谷氨酸的濃度控制在〇. 2-0. 6克/升；流加生物素的 量使發(fā)酵液中生物素的濃度控制在〇. 05-0. 8毫克/升，流加煙酰胺的量使發(fā)酵液中煙酰 胺的濃度控制在〇. 1-1毫克/升，流加維生素 Β1的量使發(fā)酵液中維生素 Β1的濃度控制在 0. 2-0. 8毫克/升。對(duì)于流加各物質(zhì)的濃度和流速無(wú)特殊要求，只要使發(fā)酵液中各物質(zhì)的濃 度控制在上述范圍內(nèi)即可。
[0035] 本發(fā)明提供的賴氨酸的生產(chǎn)方法相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)主要在于根據(jù)賴氨酸生 長(zhǎng)周期，對(duì)賴氨酸的發(fā)酵過程進(jìn)行調(diào)控，優(yōu)化出合理的培養(yǎng)基成分的添加順序和添加周期。 因此，對(duì)于賴氨酸發(fā)酵的其他條件和操作沒有特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的條件和操 作。
[0036] 本發(fā)明中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，賴氨酸發(fā) 酵菌種的接種量?jī)?yōu)選為10-18體積％。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，賴氨酸發(fā)酵菌種在 被接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中之前，采用常規(guī)方法將賴氨酸發(fā)酵菌種經(jīng)過種子罐培養(yǎng)，然后再將 菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。在種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、〇D (optical density)值測(cè)定對(duì)賴氨酸發(fā)酵菌種的生長(zhǎng)進(jìn)行觀察，當(dāng)通過上述方法觀察菌體形態(tài)正常、 測(cè)定0D值達(dá)到0. 8以上時(shí)停止培養(yǎng)，將此時(shí)種子罐中的種子液稱為成熟種子液，然后再將 成熟種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。因此，本發(fā)明中，賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量?jī)?yōu)選為10-18體 積％，指的是接入發(fā)酵培養(yǎng)基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發(fā)酵培養(yǎng)基體積 的 10-18%。
[0037] 本領(lǐng)域中一般均采用0D值來(lái)表示種子液中賴氨酸發(fā)酵菌種的數(shù)量，本發(fā)明也沿 用本領(lǐng)域的采用0D值來(lái)表示種子液中賴氨酸發(fā)酵菌種的數(shù)量的習(xí)慣。且本發(fā)明中，0D值 用722N可見光分光光度計(jì)測(cè)定。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明，種子罐培養(yǎng)可以采用一級(jí)種子罐培養(yǎng)也可以采用二級(jí)種子罐培養(yǎng)， 一級(jí)種子罐培養(yǎng)即將賴氨酸發(fā)酵菌種在一個(gè)種子罐中一直培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度；二級(jí)種 子罐培養(yǎng)即先將賴氨酸發(fā)酵菌種在一個(gè)種子罐中培養(yǎng)一段時(shí)間后再轉(zhuǎn)入另一個(gè)種子罐繼 續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度。二級(jí)種子罐培養(yǎng)在各個(gè)種子罐的培養(yǎng)時(shí)間沒有具體限定， 只要最終能培養(yǎng)到所需的培養(yǎng)程度即可。為了操作方便，本發(fā)明的種子罐培養(yǎng)優(yōu)選采用一 級(jí)種子罐培養(yǎng)。
[0039] 本發(fā)明中，對(duì)于種子罐培養(yǎng)基的成分無(wú)特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的種子罐 培養(yǎng)基，例如，可以用淀粉質(zhì)原料液化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸、 蛋氨酸、谷氨酸、生物素、煙酰胺和維生素 B1等配制種子罐培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，每升種子 罐培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每升種子罐培養(yǎng)基中，淀粉 質(zhì)原料液化清液的用量可以為25-45克，玉米楽（干重為18-52重量％ )的用量可以為 65-80克，磷酸二氫鉀的用量可以為0. 3-1. 8克，硫酸鎂的用量可以為0. 2-1. 5克，硫酸銨的 用量可以為6-12克，蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 8克，蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 5克，谷 氨酸的用量可以為〇. 2-0. 8克，生物素的用量可以為0. 01-0. 1毫克，煙酰胺的用量可以為 0. 1-5暈克，維生素 B1的用量可以為0. 2-1. 0暈克。
[0040] 本發(fā)明中，優(yōu)選情況下，流加碳源的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度控制在4-10克 /升，流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在〇. 8-1克/升。此處"流加碳源的量使發(fā)酵 液中還原性糖的濃度控制在4-10克/升，流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在0. 8-1 克/升"是指通過控制流加碳源和流加氮源的速度來(lái)使在整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)過程中發(fā)酵液中還 原性糖的濃度維持在4-10克/升，使發(fā)酵液中氮的濃度維持在0. 8-1克/升。
[0041] 本發(fā)明中，當(dāng)?shù)礊殇@鹽時(shí)，培養(yǎng)基中氮的濃度以銨根離子的濃度表示，氮的濃度 控制在0. 8-1克/升，則銨根離子的濃度控制在1. 0-1. 3克/升。
[0042] 本發(fā)明的發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于碳源和氮源的流加，以及各種培養(yǎng)基成分的 流加，連續(xù)流加比間歇流加的發(fā)酵效果好，因此，本發(fā)明中的流加優(yōu)選為連續(xù)流加。
[0043] 本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)的設(shè)備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)應(yīng)該在空氣中進(jìn)行。為了有 效利用發(fā)酵罐的產(chǎn)能，接種后且流加碳源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積優(yōu)選為 發(fā)酵罐體積的30-60%，隨著流加碳源和流加氮源以及流加各種培養(yǎng)基成分，發(fā)酵罐中的培 養(yǎng)基的體積逐漸增大，為了保證發(fā)酵罐中的空氣量，優(yōu)選為當(dāng)流加碳源和流加氮源以及流 加所述促進(jìn)劑、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和維生素至發(fā)酵罐體積的70-80%時(shí)放料，為了保證放料后 發(fā)酵罐中的菌種數(shù)量，不影響放料后發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)，放料體積優(yōu)選為放料前發(fā)酵罐 中培養(yǎng)基體積的5-10%。
[0044] 現(xiàn)有技術(shù)中，將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮 源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，賴氨酸酸度逐漸提高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸降低，發(fā) 酵產(chǎn)酸速率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降低到一定程度后，發(fā)酵產(chǎn)酸速率降低到一定程度即 判斷為發(fā)酵終點(diǎn)，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)即放罐，放罐是指將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基全部從發(fā)酵罐中放 出，即停止發(fā)酵?，F(xiàn)有技術(shù)中一般發(fā)酵培養(yǎng)40-50小時(shí)后放罐。本發(fā)明由于在發(fā)酵培養(yǎng)過程 中流加各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此可適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間，優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)42-54小時(shí)后放罐。 [0045] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，為了得到純度較高的賴氨酸產(chǎn)品，本發(fā)明方法還 包括從放料或放罐的溶液中提取賴氨酸。對(duì)于提取賴氨酸的方法無(wú)特殊要求，可以采用本 領(lǐng)域常用的各種方法，例如，采用連續(xù)離子交換分離提取方法，向放料或放罐的溶液中加入 大量的濃硫酸調(diào)pH至2. 0-3. 0進(jìn)行酸化，酸化后經(jīng)過金屬膜或陶瓷膜過濾除去菌體，得到 賴氨酸膜濾液即賴氨酸清液，或?qū)⑺峄蟮馁嚢彼岚l(fā)酵液經(jīng)絮凝過濾除菌體后得到賴氨酸 清液，除菌體后的賴氨酸清液采用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂進(jìn)行吸附交換，樹脂吸附飽和后 用稀氨水進(jìn)行洗脫，洗脫下來(lái)的賴氨酸經(jīng)濃縮、鹽酸調(diào)節(jié)pH值、結(jié)晶、固液分離、烘干，得到 賴氨酸鹽酸鹽成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使賴氨酸發(fā)酵液酸化，經(jīng)過濾或離 心等方法除去菌體。在除去菌體后的賴氨酸清液中加入氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值至8. 0-11. 5,使 賴氨酸清液中的鹽、膠體等雜質(zhì)生成不溶物，經(jīng)固液分離后得到賴氨酸溶液，將賴氨酸溶液 濃縮至每毫升賴氨酸溶液中賴氨酸的含量為0. 6-0. 8g，再經(jīng)過過濾可以得到高純度的賴氨 酸溶液，然后經(jīng)濃縮、鹽酸調(diào)節(jié)pH值、結(jié)晶、固液分離、烘干，得到賴氨酸鹽酸鹽成品。
[0046] 本發(fā)明中，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的條件無(wú)特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的條件，優(yōu)選情況 下，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：溫度為35-38°C，壓力為0. 05-0. IMPa，pH值為6. 7-7. 4,通氣 量為0. 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘。
[0047] 本發(fā)明中，對(duì)賴氨酸發(fā)酵菌種的種類無(wú)特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常用的菌種，優(yōu) 選為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和黃色短桿菌中的至少一種。
[0048]另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，接入種子罐進(jìn)行培養(yǎng)的菌種為經(jīng)過活化后 進(jìn)行增殖培養(yǎng)后的菌種?；罨驮鲋撑囵B(yǎng)為本領(lǐng)域的公知常識(shí)，在此不再贅述。
[0049] 以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0050] 在下述實(shí)施例和對(duì)比例中：甜菜糖蜜購(gòu)于山東聊城盈動(dòng)商貿(mào)有限公司。
[0051] 0D值測(cè)定：將取樣的發(fā)酵液進(jìn)行26倍稀釋，采用722N可見光分光光度計(jì)，在波長(zhǎng) 562納米可見光下測(cè)定吸光值，即為0D值。
[0052] 按照GB/T5009. 7-2008的方法測(cè)定發(fā)酵液中還原性糖的濃度。
[0053] 按照GB3595-83的方法測(cè)定發(fā)酵液中銨根離子的濃度。
[0054] 按照GB/T 1274-2011的方法測(cè)定發(fā)酵液中磷酸二氫鉀的濃度。
[0055] 按照GB/T 664-93的方法測(cè)定發(fā)酵液中硫酸亞鐵的濃度。
[0056] 按照GB/T671-1998的方法測(cè)定發(fā)酵液中硫酸鎂的濃度。
[0057] 按照GB/T15899-1995的方法測(cè)定發(fā)酵液中硫酸錳的濃度。
[0058] 按照GB/T 21979-2008的方法測(cè)定發(fā)酵液中蘇氨酸的濃度。
[0059] 按照GB/T 17810-2009的方法測(cè)定發(fā)酵液中蛋氨酸的濃度。
[0060] 按照生物傳感儀法測(cè)定發(fā)酵液中谷氨酸的濃度。
[0061] 按照GB/T 23180-2008的方法測(cè)定發(fā)酵液中生物素的濃度。
[0062] 按照GB/T 7301-2002的方法測(cè)定發(fā)酵液中煙酰胺的濃度。
[0063] 按照GB/T 14700-2002的方法測(cè)定發(fā)酵液中維生素 B1的濃度。
[0064] 按照GB10794-89標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)發(fā)酵液中的賴氨酸濃度（以賴氨酸鹽酸鹽計(jì)）。
[0065] 單罐供酸量=(放罐的賴氨酸濃度X放罐體積+中間放料賴氨酸濃度X中間放 料體積）。
[0066] 轉(zhuǎn)化率（％ )=單罐供酸量/總糖的重量X100%，其中總糖的重量包括種子罐用 糖重量和發(fā)酵罐用糖重量。
[0067] 在下述實(shí)施例和對(duì)比例中：淀粉質(zhì)原料液化清液按照以下方法制備：
[0068] (1)將收獲的100重量份玉米通過機(jī)械加工將玉米顆粒粉碎，使玉米粉過60目篩 的通過率為80%。
[0069] (2)將粉碎后的產(chǎn)物加水調(diào)漿至14Β?°，相對(duì)于每克粉碎產(chǎn)物的干重，加入120個(gè) 酶活力單位的淀粉酶（諾維信公司，α -淀粉酶），在84°C、pH為5. 8的條件下酶解100分 鐘，然后進(jìn)行碘試，碘試呈本色合格，不需進(jìn)行二次酶解，若碘試不合格，需加入20個(gè)酶活 力單位的淀粉酶，在90°C、pH為6. 0的條件下繼續(xù)酶解20分鐘，然后進(jìn)行二次碘試，碘試合 格，得到酶解產(chǎn)物，然后將酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機(jī)進(jìn)行壓濾，分離出酶解清液即 淀粉質(zhì)原料液化清液（固含量為20重量％ )，淀粉質(zhì)原料液化清液中的葡萄糖含量約為25 重量％。
[0070] 實(shí)施例1
[0071] 本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明提供的賴氨酸的生產(chǎn)方法。
[0072] (1)配制種子罐培養(yǎng)基，具體組成為：相對(duì)于每升培養(yǎng)基，取淀粉質(zhì)原料液化清液 的用量為35克，玉米楽（干重為35重量％ )的用量為80克，磷酸氫二鉀的用量為1. 0克， 硫酸鎂的用量為〇. 5克，硫酸銨的用量為10克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為 〇. 2克，谷氨酸的用量0. 2克，生物素的用量為0. 01暈克，煙酰胺的用量為0. 1暈克，維生 素 B1的用量為0.2毫克。將培養(yǎng)基加熱到121°C消毒，維持20分鐘后降溫至37°C并保持 恒定。開啟攪拌，調(diào)節(jié)罐壓為〇. IMPa，按照通風(fēng)量與培養(yǎng)基1:0. 5體積比通入無(wú)菌空氣，用 氨水調(diào)節(jié)pH至6. 8并保持恒定。將黃色短桿菌菌種（菌株原種FB42購(gòu)自江南大學(xué)）活化 和增殖后接入種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每隔120分鐘取樣鏡檢并測(cè)定0D值，當(dāng)鏡檢 菌體形態(tài)正常且0D值達(dá)到0. 8時(shí)停止培養(yǎng)，得到成熟種子液。
[0073] (2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，具體組成為：相對(duì)于每升發(fā)酵培養(yǎng)基，取淀粉質(zhì)原料液化清 液的用量為50克，甜菜糖蜜的用量為40克，玉米楽（干重為35重量％ )的用量為30克， 硫酸銨的用量為30克，磷酸二氫鉀的用量為1. 0克，硫酸鎂的用量為0. 5克，硫酸錳的用量 為0. 01克，硫酸亞鐵的用量為0. 01克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克，谷 氨酸的用量為〇. 3克，生物素的用量為0. 05暈克，煙酰胺的用量為0. 1暈克，維生素 B1的 用量為0.2毫克，乙二胺四乙酸（EDTA)的用量為9克。將培養(yǎng)基加熱到121°C消毒30分鐘 后降溫至37 °C并保持恒定，用氨水調(diào)節(jié)pH至6. 9。
[0074] (3)在發(fā)酵罐中裝入步驟（2)中配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為發(fā)酵 罐體積的30%。將步驟（1)所得的成熟種子液，接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以 接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，步驟（2)所得的成熟種子液的接種量為15體積％。接種后連 續(xù)流加淀粉質(zhì)原料液化清液和硫酸銨，流加淀粉原料液化清液的量使發(fā)酵液中還原性糖的 濃度控制在6-8克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制在1. 0-1. 3克/ 升。將罐壓控制為0. IMPa，發(fā)酵溫度控制為37°C，通氣量為0. 7立方米空氣/立方米的培 養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)pH維持在7. 0進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。分別在發(fā)酵培養(yǎng)2小時(shí)后至發(fā)酵 培養(yǎng)12小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中連續(xù)流加 EDTA，流加 EDTA的量使發(fā)酵液中EDTA的濃度控制在9 克/升；在發(fā)酵13小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前6小時(shí)向發(fā)酵液中連續(xù)流加磷酸二氫鉀、硫酸 鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳，流加磷酸二氫鉀的量使發(fā)酵液中磷酸二氫鉀的濃度控制在0. 4克/ 升，流加硫酸鎂的量使發(fā)酵液中硫酸鎂的濃度控制在〇. 2克/升，流加硫酸亞鐵的量使發(fā)酵 液中硫酸亞鐵的濃度控制在〇. 01克/升，流加硫酸猛的量使發(fā)酵液中硫酸猛的濃度控制在 0. 01克/升；在發(fā)酵培養(yǎng)16小時(shí)至發(fā)酵培養(yǎng)42小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中連續(xù)流加蘇氨酸、蛋氨 酸和谷氨酸，流加蘇氨酸的量使發(fā)酵液中蘇氨酸的濃度控制在〇. 1克/升，流加蛋氨酸的量 使發(fā)酵液中蛋氨酸的濃度控制在〇. 1克/升，流加谷氨酸的量使發(fā)酵液中谷氨酸的濃度控 制在〇. 2克/升；在發(fā)酵培養(yǎng)20小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)45小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中連續(xù)流加生物素、 煙酰胺和維生素 B1，流加生物素的量使發(fā)酵液中生物素的濃度控制在0. 05毫克/升，流加 煙酰胺的量使發(fā)酵液中煙酰胺的濃度控制在〇. 1毫克/升，流加維生素 B1的量使發(fā)酵液中 維生素 B1的濃度控制在0. 2毫克/升。
[0075] 流加淀粉質(zhì)原料液化清液和硫酸銨，以及流加 EDTA、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞 鐵、硫酸錳、蘇氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、煙酰胺和維生素 B1至發(fā)酵罐體積的75%時(shí)放料，放料 體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的8%。發(fā)酵培養(yǎng)42小時(shí)后放罐，測(cè)定放罐的賴氨酸濃 度（即終點(diǎn)賴氨酸含量，下同）和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0076] 實(shí)施例2
[0077] 本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明提供的賴氨酸的生產(chǎn)方法。
[0078] 種子罐培養(yǎng)基配方、種子罐成熟種子液培養(yǎng)方法、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方均與實(shí)施例1 相同。
[0079] 發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的40 %。將成熟種子液接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基 中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，種子液的接種量為12體積％。接種后連 續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料液化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料液化清液的量使發(fā)酵 液中還原性糖的濃度控制在5-7克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制 在1. 0-1. 3克/升，將罐壓控制為0. 08MPa，發(fā)酵溫度控制為35°C，通氣量為0. 8立方米空 氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)pH維持在7. 2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。分別在發(fā)酵培養(yǎng) 6小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中連續(xù)流加 EDTA，流加 EDTA的量使發(fā)酵液中EDTA 的濃度控制在11克/升；在發(fā)酵15小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前7小時(shí)向發(fā)酵液中連續(xù)流加 磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳，流加磷酸二氫鉀的量使發(fā)酵液中磷酸二氫鉀的濃 度控制在1. 2克/升，流加硫酸鎂的量使發(fā)酵液中硫酸鎂的濃度控制在0. 5克/升，流加硫 酸亞鐵的量使發(fā)酵液中硫酸亞鐵的濃度控制在0. 05克/升，流加硫酸錳的量使發(fā)酵液中硫 酸錳的濃度控制在〇. 08克/升；在發(fā)酵培養(yǎng)17小時(shí)至發(fā)酵培養(yǎng)40小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中連 續(xù)流加蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸，流加蘇氨酸的量使發(fā)酵液中蘇氨酸的濃度控制在〇. 4克/ 升，流加蛋氨酸的量使發(fā)酵液中蛋氨酸的濃度控制在0. 5克/升，流加谷氨酸的量使發(fā)酵液 中谷氨酸的濃度控制在〇. 6克/升；在發(fā)酵培養(yǎng)21小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)46小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液 中連續(xù)流加生物素、煙酰胺和維生素 B1，流加生物素的量使發(fā)酵液中生物素的濃度控制在 〇. 8毫克/升，流加煙酰胺的量使發(fā)酵液中煙酰胺的濃度控制在1. 0毫克/升，流加維生素 B1的量使發(fā)酵液中維生素 B1的濃度控制在0. 8毫克/升。
[0080] 流加淀粉質(zhì)原料液化清液和硫酸銨，以及流加 EDTA、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞 鐵、硫酸錳、蘇氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、煙酰胺和維生素 B1至發(fā)酵罐體積的70%時(shí)放料，放料 體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的5%。發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)后放罐，測(cè)定放罐的賴氨酸濃 度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0081] 實(shí)施例3
[0082] 本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明提供的賴氨酸的生產(chǎn)方法。
[0083] 種子罐培養(yǎng)基配方、種子罐成熟種子液培養(yǎng)方法、發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方均與實(shí)施例1 相同。
[0084] 發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基體積為發(fā)酵罐體積的60 %。將成熟種子液接入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基 中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，種子液的接種量為18體積％。接種后連 續(xù)流加制得的淀粉質(zhì)原料液化清液和硫酸銨，流加制得的淀粉質(zhì)原料液化清液的量使發(fā)酵 液中還原性糖的濃度控制在8-10克/升，流加硫酸銨的量使發(fā)酵液中銨根離子的濃度控制 在1. 0-1. 3克/升，將罐壓控制為0. 05MPa，發(fā)酵溫度控制為38°C，通氣量為0. 9立方米空 氣/立方米的培養(yǎng)基/分鐘，并用液氨調(diào)節(jié)pH維持在7. 4進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。分別在發(fā)酵培養(yǎng) 4小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)14小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中連續(xù)流加 EDTA，流加 EDTA的量使發(fā)酵液中EDTA 的濃度控制在10克/升；在發(fā)酵14小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前8小時(shí)向發(fā)酵液中連續(xù)流加 磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳，流加磷酸二氫鉀的量使發(fā)酵液中磷酸二氫鉀的濃 度控制在0. 8克/升，流加硫酸鎂的量使發(fā)酵液中硫酸鎂的濃度控制在0. 4克/升，流加硫 酸亞鐵的量使發(fā)酵液中硫酸亞鐵的濃度控制在0. 03克/升，流加硫酸錳的量使發(fā)酵液中硫 酸錳的濃度控制在〇. 05克/升；在發(fā)酵培養(yǎng)18小時(shí)至發(fā)酵培養(yǎng)41小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中連續(xù) 流加蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸，流加蘇氨酸的量使發(fā)酵液中蘇氨酸的濃度控制在〇. 25克/ 升，流加蛋氨酸的量使發(fā)酵液中蛋氨酸的濃度控制在0. 35克/升，流加谷氨酸的量使發(fā)酵 液中谷氨酸的濃度控制在〇. 4克/升；在發(fā)酵培養(yǎng)22小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)48小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵 液中連續(xù)流加生物素、煙酰胺和維生素 B1，流加生物素的量使發(fā)酵液中生物素的濃度控制 在〇. 2毫克/升，流加煙酰胺的量使發(fā)酵液中煙酰胺的濃度控制在0. 7毫克/升，流加維生 素 B1的量使發(fā)酵液中維生素 B1的濃度控制在0. 5毫克/升。
[0085] 流加淀粉質(zhì)原料液化清液和硫酸銨，以及流加 EDTA、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞 鐵、硫酸錳、蘇氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、煙酰胺和維生素 B1培養(yǎng)過程中底料加流加培養(yǎng)基體 積為至發(fā)酵罐體積的80%時(shí)放料，放料體積為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的10%。發(fā)酵培 養(yǎng)52小時(shí)后放罐，測(cè)定放罐的賴氨酸濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn) 化率見表1。
[0086] 對(duì)比例1
[0087] 按照實(shí)施例3的方法生產(chǎn)賴氨酸，不同的是，在發(fā)酵培養(yǎng)基配制中不加入EDTA，并 且在發(fā)酵過程中不向發(fā)酵液中流加 EDTA、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、蘇氨酸、 蛋氨酸、谷氨酸、生物素、煙酰胺和維生素 B1。發(fā)酵培養(yǎng)52小時(shí)后放罐，測(cè)定放罐的賴氨酸 濃度和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0088] 對(duì)比例2
[0089] 按照實(shí)施例3的方法生產(chǎn)賴氨酸，不同的是，在發(fā)酵培養(yǎng)基配制中不加入EDTA，并 且在發(fā)酵過程中不向發(fā)酵液中流加 EDTA。發(fā)酵培養(yǎng)52小時(shí)后放罐，測(cè)定放罐的賴氨酸濃度 和中間放料的賴氨酸濃度，計(jì)算單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率見表1。
[0090] 表 1
[0091]

【權(quán)利要求】
1. 一種賴氨酸的生產(chǎn)方法，該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中， 在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)2-6小時(shí)后至發(fā) 酵培養(yǎng)12-16小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加促進(jìn)劑，在發(fā)酵培養(yǎng)12-16小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束前 6-8小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加無(wú)機(jī)鹽，在發(fā)酵培養(yǎng)16-20小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)40-42小時(shí)內(nèi)向發(fā) 酵液中流加氨基酸，在發(fā)酵培養(yǎng)20-24小時(shí)后至發(fā)酵培養(yǎng)42-48小時(shí)內(nèi)向發(fā)酵液中流加維 生素，其中，所述促進(jìn)劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉和氨基三乙酸鈉中的一種或多 種。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述碳源為淀粉質(zhì)原料液化清液；所述氮源為銨 鹽，所述銨鹽為硫酸銨；所述無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳和磷酸二氫鉀中的一種或 多種；所述氨基酸為蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸中的一種或多種；所述維生素為生物素、煙酰 胺和維生素 B1中的一種或多種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，流加促進(jìn)劑的量使發(fā)酵液中促進(jìn)劑的濃度控 制在8-12克/升；流加無(wú)機(jī)鹽的量使發(fā)酵液中無(wú)機(jī)鹽的濃度控制在0. 01-1. 2克/升，流加 氨基酸的量使發(fā)酵液中氨基酸的濃度控制在〇. 1-0. 6克/升，流加維生素的量使發(fā)酵液中 維生素的濃度控制在0. 05-1毫克/升。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，以接種后且流加碳源和流加氮源之前的發(fā)酵培 養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為10-18體積％。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述流加碳源的量使發(fā)酵液中還原性糖的濃度 控制在4-10克/升，所述流加氮源的量使發(fā)酵液中氮的濃度控制在0. 8-1克/升。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述流加為連續(xù)流加。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵罐中進(jìn)行，接種后且流加碳 源和流加氮源之前發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基的體積為發(fā)酵罐體積的30-60%，當(dāng)流加碳源和氮源 以及流加所述促進(jìn)劑、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和維生素至發(fā)酵罐體積的70-80%時(shí)放料，放料體積 為放料前發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的5-10%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的方法，其中，發(fā)酵培養(yǎng)42-54小時(shí)后放罐。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述方法還包括從所述放料或所述放罐的溶 液中提取賴氨酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：溫度為35-38°C，壓 力為0· 05-0. IMPa，pH值為6. 7-7. 4,通氣量為0· 5-1. 2立方米空氣/立方米的培養(yǎng)基/分 鐘。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述賴氨酸發(fā)酵菌種為谷氨酸棒桿菌、大腸桿 菌和黃色短桿菌中的至少一種。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104232702SQ201410363392
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】滿云, 陳影, 榮玉鳳, 李長(zhǎng)輝 申請(qǐng)人:中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司