調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的多核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的多核苷酸序列及其應(yīng)用。該多核苷酸如序列表中SEQ?ID?NO:1所示。本發(fā)明通過(guò)StBAM1、StBAM9基因獲得所述多核苷酸序列后，在馬鈴薯中同時(shí)干涉StBAM1和StBAM9兩個(gè)基因，可極顯著降低還原糖的含量，提高馬鈴薯抗低溫糖化的能力，遠(yuǎn)超過(guò)StAmy23、StBAM1、StBAM9單獨(dú)在低溫糖化中的功能。
【專利說(shuō)明】調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的多核苷酸序列及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的多核苷 酸序列，及其在提高馬鈴薯塊莖抗低溫糖化能力、優(yōu)良加工品種選育方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯iMerios-- L.)是繼水稻、小麥和玉米之后的世界第四大糧食作 物，同時(shí)也是蔬菜、飼料和工業(yè)原料作物，在世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛分布種植。隨著我 國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，馬鈴薯用作糧食的比例正逐步減少，而作為快餐食品、加工制 品的比例大量增加。
[0003] 用于加工的馬鈴薯塊莖，除要求具有普通馬鈴薯對(duì)于營(yíng)養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高、抗病、抗 逆、成熟期適中等要求外，更重要的具有干物質(zhì)含量高、還原糖含量低和抗低溫糖化等特點(diǎn) (張永成&阮建平，2005)。其中，塊莖還原糖含量和抗低溫糖化的水平，將在很大程度上決定 加工品質(zhì)(屈冬玉等，2001)。因?yàn)樵诩庸み^(guò)程中，塊莖內(nèi)的還原糖與氮化合物的α-氨基酸 進(jìn)行"Maillard Reaction"致使薯片或薯?xiàng)l表面顏色加深，味道變苦，并且此反應(yīng)中產(chǎn)生的 丙烯酰胺具有潛在的神經(jīng)毒性，危害消費(fèi)者健康，嚴(yán)重影響加工品質(zhì)(成善漢等，2006)。馬 鈴薯加工業(yè)中，為延長(zhǎng)加工時(shí)間，減少因貯藏期間塊莖失水皺縮、腐爛、發(fā)芽等造成的原料 損失，消除為抑制病蟲害施用化學(xué)藥劑而帶來(lái)的健康問(wèn)題和環(huán)境危害，通常采用低溫條件 來(lái)貯藏收獲后的馬鈴薯塊莖。但這導(dǎo)致了馬鈴薯塊莖中還原糖的積累，即所謂的低溫糖化， 這正是多種品種不適合加工的主要原因。
[0004] 現(xiàn)有研究表明，參與馬鈴薯塊莖低溫糖化的途徑主要是蔗糖降解、糖酵解、淀粉 降解，這些途徑涉及到的關(guān)鍵酶的作用將直接影響塊莖淀粉合成和糖的積累（Malone等， 2006)。其中淀粉降解是低溫下還原糖積累的一種重要途徑，淀粉降解包括淀粉水解和磷酸 解，磷酸解是在淀粉顆粒結(jié)合蛋白R(shí)1、淀粉磷酸合酶（STP)等作用下進(jìn)行的，而淀粉水解主 要是通過(guò)淀粉酶（α-淀粉酶、β-淀粉酶)的作用進(jìn)行。Fulton等（2008)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥基 因組中共有9個(gè)β -淀粉酶基因(似#7-似#幻，原核表達(dá)定位于葉綠體的BAM1、BAM2、BAM3 和ΒΑΜ4蛋白，ΒΑΜ1、ΒΑΜ2和ΒΑΜ3有β -淀粉酶活性而ΒΑΜ4沒(méi)有，并通過(guò)一系列突變體材料 證明β-淀粉酶對(duì)其葉片淀粉降解有較大作用。研究發(fā)現(xiàn)塊莖在低溫貯藏條件下，貯藏前 幾周α-淀粉酶、β-淀粉酶活性急劇上升，同時(shí)還原糖含量大幅上升（Cottrell et al.， 1993)，暗示了貯藏塊莖淀粉降解主要是由淀粉酶的水解作用來(lái)完成。Cochrane等（1991) 通過(guò)分析4°C和10°C儲(chǔ)藏不同時(shí)間的四個(gè)馬鈴薯栽培種（RecorcUWil ja、Pentland Dell和 Brodick)的淀粉酶活、糖含量，發(fā)現(xiàn)低溫下淀粉酶活性與還原糖積累非常相關(guān)。Scheidig 等（2002)通過(guò)反義RNA干擾馬鈴薯葉片葉綠體定位的β -淀粉酶基因表達(dá)，導(dǎo) 致轉(zhuǎn)基因株系葉片淀粉酶活降低，淀粉積累。Bagnaresi等（2008)通過(guò)番爺GeneChip分離 出一些馬鈴薯塊莖低溫貯藏差異表達(dá)基因，其中有兩個(gè)是β -淀粉酶(沒(méi)#77和沒(méi)#77 )，具有 明顯的低溫誘導(dǎo)特性。擬南芥基因組中編碼3個(gè)α -淀粉酶（AMYUAMY2和ΑΜΥ3)，Zeeman 等（2007)發(fā)現(xiàn)葉綠體定位的AMY3有淀粉酶活性。當(dāng)通過(guò)T-DNA插入分別突變和同時(shí)突變 這3個(gè)基因，突變體與野生型葉片淀粉降解速度相同（Yu et al 2005)，對(duì)其淀粉降解無(wú)顯 著作用，可能是體內(nèi)別的蛋白對(duì)其功能有補(bǔ)償作用。Zhang等（2002)研究發(fā)現(xiàn)甘薯收獲后 在20°C儲(chǔ)藏的前60 d淀粉含量的降低與α-淀粉酶活性成正比，說(shuō)明α-淀粉酶與淀粉降 解相關(guān)。擬南芥突變體sex4葉綠體中α-淀粉酶活性降低，夜間淀粉降解速度減慢，葉片 淀粉積累，表明 α-淀粉酶活性影響淀粉降解（Zeeman et al 1998 ;Zeeman and ap Rees 1999)。Gausing等（1990)申請(qǐng)了 a-淀粉酶基因?qū)＠≒CT/DK1990/000108)，通過(guò)遺傳 轉(zhuǎn)化馬鈴薯，反義抑制淡表達(dá)，8°C低溫處理的轉(zhuǎn)基因株系塊莖淀粉降解受到抑 制，還原糖含量下降；超量表達(dá)增加了淀粉降解，還原糖含量升高，初步顯示 可調(diào)節(jié)塊莖低溫糖化。
[0005] 馬鈴薯基因組中含有如下7個(gè)β -淀粉酶基因：泣似#7、泣似#￥、 泣似#5、泣似#6、泣似#7 (若按與擬南芥9個(gè)β -淀粉酶基因同源程度命名的話，則對(duì)應(yīng)命 名％ StBAMl、StBAM3、StBAM4、StBAM5、StBAM7、StBAM8、StBAM9)琳 a -淀犧基里 StAmyl、 汾^野(Zhang et al 2014)。目前，關(guān)于泣似#7-泣似挪在馬鈴薯塊莖低溫糖化代謝過(guò) 程中的作用并無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明利用馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的相應(yīng)序列設(shè)計(jì)引物，以野生種馬鈴 薯5：知riAaWiiicDNA為模板，克隆了泣似#7、泣似J份基因，并構(gòu)建同時(shí)干涉泣似#7和 的雙干涉載體，遺傳轉(zhuǎn)化馬鈴薯進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)雙干涉轉(zhuǎn)基因株系可提 高馬鈴薯塊莖抗低溫糖化的能力，效果顯著優(yōu)于單獨(dú)干涉汾也?Jd泣似#八泣似i份的轉(zhuǎn)基 因株系。
[0008] 鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的多核苷酸序列及其應(yīng) 用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明創(chuàng)造性地選擇基因編碼區(qū)751-989bp (239bp) 和泣似J份基因編碼區(qū)976-1193bp (218bp)為雙干涉片段區(qū)域，基于Gateway和重疊 PCR原理，分別設(shè)計(jì)各自干涉區(qū)域片段擴(kuò)增引物，分別以質(zhì)粒pMD-泣似#7、pMD-泣似J份為 模板，擴(kuò)增泣似#7干涉片段區(qū)域751-989bp T1T2和泣似J份干涉片段區(qū)域976-1193bp T3T4,回收相應(yīng)目的片段，再將兩種回收產(chǎn)物混合，并以此混合物為模板，BlB9-Tl-attBl、 BlB9-T4-attB2為引物進(jìn)行重疊PCR，將兩個(gè)片段拼接一起，得到一個(gè)457bp的多核苷酸序 列。采用該多核苷酸序列構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)化，所得馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株的馬鈴薯塊莖抗低溫糖化能 力得到了顯著的提升。
[0010] 因此，本發(fā)明第一個(gè)方面提供了一種多核苷酸序列，它的多核苷酸如序列表中SEQ ID NO: 1 所示。 toon] 本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了分別包含上述多核苷酸序列的表達(dá)載體；其中優(yōu)選的 表達(dá)載體是pHellsgate8載體。
[0012] 本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了分別包含上述表達(dá)載體的細(xì)胞；其中優(yōu)選的細(xì)胞是大 腸桿菌DH5a或農(nóng)桿菌LBA4404。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)干涉泣似#2、份這兩個(gè)基因的雙干涉轉(zhuǎn)基因 株系中，還原糖含量極顯著降低，效果明顯優(yōu)于汾也?jd泣似#2、泣似J份單獨(dú)在低溫糖化 中的功能，極大的提高了馬鈴薯抗低溫糖化的能力，并改善了加工品質(zhì)。因此，本發(fā)明的第 四個(gè)方面提供了上述多核苷酸序列或似挪基因的工業(yè)應(yīng)用。即：上述的多核苷 酸序列SEQ ID NO: 1在馬鈴薯抗低溫糖化中的應(yīng)用?；蛘撸浩?7聯(lián)用泣似J份在馬鈴薯 抗低溫糖化中的應(yīng)用。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明人通過(guò)泣似#2、泣似J份基因獲得所述多核苷酸序列后， 在馬鈴薯中同時(shí)干涉和份兩個(gè)基因，可極顯著降低還原糖的含量，提高馬鈴薯 抗低溫糖化的能力，遠(yuǎn)超過(guò)StAmy23、StMMl、5?似單獨(dú)在低溫糖化中的功能。
[0015]

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1 :泣似泣似#7基因編碼區(qū)擴(kuò)增結(jié)果圖，其中，泳道1: Trans2K plus，泳道 2_. StBAM9，m StBAMl。
[0017] 圖2 :干涉載體RNAi-(泣似#7+泣似#沒(méi)）結(jié)構(gòu)圖。
[0018] 圖3 :轉(zhuǎn)基因株系不同溫度處理塊莖炸片圖片。
[0019] 圖4 :轉(zhuǎn)基因株系低溫貯藏4°C、30d塊莖炸片色澤指數(shù)。
[0020] 圖5 :轉(zhuǎn)基因株系低溫貯藏4°C、30d塊莖葡萄糖、果糖、還原糖、蔗糖含量。
[0021] 圖6 :轉(zhuǎn)基因株系低溫貯藏4°C、30d塊莖β -淀粉酶活性。
[0022] 圖7 :轉(zhuǎn)基因株系低溫貯藏4°C、30d塊莖淀粉含量。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出更詳細(xì)的描述。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征。并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的前提 下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。本發(fā)明通過(guò)在馬鈴薯 中同時(shí)干涉泣似被和泣似挪這兩個(gè)基因，顯著的提高了馬鈴薯塊莖抗低溫糖化的能力，效 果明顯優(yōu)于單獨(dú)干涉汾卸成?、泣似i//、泣似i份的轉(zhuǎn)基因株系。同時(shí)干涉泣似#7、泣似i份這 兩個(gè)基因在抗低溫糖化、油炸加工品質(zhì)方面的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] .洶盼基因的克隆與分析 本發(fā)明中的2個(gè)基因是根據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Potato Genome Sequence Consortium)公布的序列 PGSC0003DMC400002800 (泣似#7)、PGSC0003DMC400018848 (泣似設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因全長(zhǎng)序列，引物序列如下： StBAMlV (5f -ATGGCGATGAGTATGCCACAC-3,) StBAMIR (5f -TTAGTGCATGAGGGCCATTGC-3,) StBAM9F (5f -ATGGAGGTTTCAGTGATGGGAA-3,) StBAM9R (5f -CTAAGCTGCTTGCATCTGGAGATGA-3,) 由以上全長(zhǎng)〇RF引物，通過(guò)PCR的方法，以野生種馬鈴薯5：知riAaWiiicDNA為模板， 擴(kuò)增泣似#7、份編碼區(qū)(見(jiàn)圖1 )，膠回收相應(yīng)目標(biāo)片段做AT克隆連接至PMD18-T載體， 連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，酶切檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證序列，測(cè)序工 作由上海桑尼公司完成。
[0025] 基因全長(zhǎng)開放閱讀框?yàn)?740bp，編碼579個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子， 用Pfam程序分析，屬于Glycosyl hydrolase family 14,與目前公布的擬南芥似#7序列 有76%同源性，屬于一個(gè)新的與馬鈴薯塊莖抗低溫糖化性狀相關(guān)的候選基因。泣似J份基因 全長(zhǎng)開放閱讀框?yàn)?605bp，編碼534個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，用Pfam程序分析，屬于 Glycosyl hydrolase family 14,與目前公布的擬南芥似挪有63%同源性，也屬于一個(gè)新 的與馬鈴薯塊莖抗低溫糖化性狀相關(guān)的候選基因。
[0026] 雙干涉RNAi -(泣似#7+泣似#幻載體構(gòu)建 選擇泣似#7基因編碼區(qū)751-989bp (239bp)和泣似J份基因編碼區(qū)976-1193bp (218bp)為雙干涉片段區(qū)域，基于Gateway和重疊 PCR原理，分別設(shè)計(jì)各自干涉區(qū)域片段擴(kuò) 增引物，引物序列為： BlB9-Tl-attBl (5' -AAAAAGCAGGCTGTCCAATGCCATTCTGATTTC-3'）、 B1B9-T2 (5' - TAAGTCGTCTCCCAAGATCCCCCCATTCAGGCTTACCAA-3'）、B1B9-T3 (5' - GGTAAGCCTGAATGGGGGGATCTTGGGAGACGACTTATG-3'）、BlB9-T4-attB2 (5, -AGAA AGCTGGGTCCATCTCTGTTGGCTGTGTTAT -3'）， 分別以質(zhì)粒pMD-泣似#7、pMD-泣似J份為模板，擴(kuò)增泣似#7干涉片段區(qū)域751-989bp T1T2和泣似J份干涉片段區(qū)域976-1193bp T3T4,回收相應(yīng)目的片段，再將兩種回收產(chǎn)物混 合，并以此混合物為模板，BlB9-Tl-attBl、BlB9-T4-attB2為引物進(jìn)行重疊 PCR，將兩個(gè)片 段拼接一起（457bp，見(jiàn)序列表中的序列1)，膠回收目的片段產(chǎn)物。以此為模板，利用通用引 物： attBl (5' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'）、 attB2 (5' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'）， 進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，膠回收產(chǎn)物通過(guò)BP反應(yīng)（目的片段1.4ul，ro〇NR221質(zhì)粒lul， BP酶0. 6ul，25°C重組16h，加0. 3 ul蛋白酶K，37°C反應(yīng)10 min)重組到pD0NR221載體，陽(yáng) 性克隆PD0NR221- 似#7+泣似挪)通過(guò)LR反應(yīng)(入門載體1. 2 μ L，phellsgate8 1. 2 μ L， LR 酶 0.6yL，25°C重組 16h，加 0.3 ul 蛋白酶 K，37°C反應(yīng) 10 min。）重組到 pHellsgate8 載體，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，Xhol單酶切檢測(cè)陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確陽(yáng)性克隆 電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404, PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的即為雙干涉載體RNAi-(泣似#7+泣似J份）（見(jiàn) 圖2)。保存陽(yáng)性克隆，用于進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化。
[0027] 遺傳轉(zhuǎn)化 將RNAi-(泣似雙干涉載體的農(nóng)桿菌LBA4404接種于加50 mg/L Spe和 50 mg/L Rif的YEB培養(yǎng)基中，于28°C、200 r/min搖床上培養(yǎng)至0D6QQ為0. 5左右。4000 r/min離心6 min，其沉淀用3%MS液體培養(yǎng)基重新懸浮。將生長(zhǎng)12-16周、直徑0. 5 cm左 右的E3試管薯切成1-2 mm厚的薄片，在上述農(nóng)桿菌菌液中浸泡12 min，每隔3 min搖一 次。浸染結(jié)束后取出薯片，用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液。轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基S1:3%MS+1 (mg/ L)IAA+0· 2 (mg/L)GA3+0. 5(mg/L)6-BA+2(mg/L)ZT 培養(yǎng)皿中，于 23°C 暗培養(yǎng) 2 d 后，轉(zhuǎn)到 S2 培養(yǎng)基：S1+ 75 mg/L Kam+400 mg/L Cef中，置于光照強(qiáng)度2000 lux，光周期16 h/d，溫度 23°C的條件下培養(yǎng)直到抗性芽再生。當(dāng)抗性芽長(zhǎng)達(dá)0.5-1 cm時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基 S3:3%MS+50 mg/L Kam+200 mg/L Cef篩選。對(duì)生根的芽進(jìn)行DNA提取，35S通用引物PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
[0028] 你心· - 6?似幻轉(zhuǎn)基因功能鑒定 發(fā)明人將3個(gè)尺隱1-泣辦?7^(12、15、18)干涉轉(zhuǎn)基因株系、3個(gè)尺隱1-泣似#7(2、3、4) 干涉轉(zhuǎn)基因株系、3個(gè)RNAi-Si^4i^(2、10、14)干涉轉(zhuǎn)基因株系、3個(gè) (10、11、18)雙干涉轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照(轉(zhuǎn)基因所用的受體材料E3)同時(shí)種植在同一個(gè)溫室 大棚中，相同的管理?xiàng)l件，每個(gè)株系種植16盆，植株長(zhǎng)勢(shì)良好，薯塊成熟度高，轉(zhuǎn)基因株系 在田間農(nóng)業(yè)性狀上與對(duì)照無(wú)顯著差異。收獲轉(zhuǎn)基因株系塊莖常溫20°C避光保存7-10天 后，用來(lái)測(cè)定糖、淀粉等指標(biāo)。用來(lái)測(cè)糖的塊莖低溫4°C避光處理10d、15d、30d，常溫20°C 處理0d、30d，每個(gè)處理選取3個(gè)大小均勻（大于50g)的薯進(jìn)行取樣。測(cè)糖的每個(gè)薯縱切一 分為二，薯的一半用來(lái)炸片，炸片所用的工藝流程是：原料馬鈴薯--清洗--去皮--切 片--漂洗一一脫水--油炸(普通調(diào)和油，恒溫170°C，3min)。薯的另一半用來(lái)測(cè)定基因 的表達(dá)量、還原糖含量、淀粉含量、淀粉酶活性等指標(biāo)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
[0029] 首先對(duì)RNAi-汾^野么?、RNAi-泣似#7、RNAi-泣似和RNAi-(泣似#7+泣似#沒(méi)）轉(zhuǎn) 基因株系塊莖4°C分別儲(chǔ)藏0 d、10d、30d和20°C貯藏0d、30d后，進(jìn)行了油炸加工品質(zhì)、色 澤指數(shù)分析，直觀的結(jié)果顯示對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系之間20°C貯藏0d、30d炸片色澤均無(wú)明顯 差別，但是4°C貯藏下，各轉(zhuǎn)基因株系的炸片色澤不等程度的淺于對(duì)照（圖3)。由4°C 30d 的炸片圖片初步可以看出RNAi-S^j^轉(zhuǎn)基因株系塊莖色澤與對(duì)照無(wú)差異，RNAi-S_#7 轉(zhuǎn)基因株系塊莖色澤也無(wú)顯著改善，而RNAi-^i^J份和RNAi-轉(zhuǎn)基因株 系塊莖炸片色澤有一定改善，尤其是RNAi-(泣似#7+泣似#幻轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照相比，炸片 色澤最淺(見(jiàn)圖3)。而且炸片色澤指數(shù)分析結(jié)果顯示，干涉轉(zhuǎn)基因株系與對(duì) 照無(wú)差異，RNAi-泣似#7和RNAi-泣似J份轉(zhuǎn)基因塊莖與對(duì)照相比，色澤指數(shù)較低；而雙干涉 RNAi-(泣似#7+泣似轉(zhuǎn)基因株系炸片色澤指數(shù)顯著低于對(duì)照(見(jiàn)圖4)，直觀上可看出同 時(shí)干涉了泣似#7和泣似J份后效果明顯好于單獨(dú)干涉、泣^^份的轉(zhuǎn)基因株 系，在低溫糖化中的功能優(yōu)于汾卸7力、泣似#7、泣似i份。
[0030] 判斷馬鈴薯塊莖抗低溫糖化能力的重要指標(biāo)是還原糖的積累量， 申請(qǐng)人:對(duì)處理的 轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照材料的塊莖進(jìn)行了葡萄糖、果糖、蔗糖含量的測(cè)定。干涉轉(zhuǎn) 基因株系塊莖4°C儲(chǔ)藏30天時(shí)，葡萄糖、蔗糖含量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，果糖含量稍有下 降(見(jiàn)圖5);RNAi-^i^#7干涉轉(zhuǎn)基因株系4°C儲(chǔ)藏30天塊莖葡萄糖、果糖、蔗糖含量與對(duì)照 相比顯著降低，其中RNAi-^i^#7-3、4株系塊莖葡萄糖含量比E3分別降低了 28%、27% (見(jiàn) 圖5A)，果糖含量比E3降低了 29%、25% (見(jiàn)圖5B) ;3個(gè)RNAi-Si^J份干涉轉(zhuǎn)基因株系4°C 30d塊莖葡萄糖、果糖含量也均小于對(duì)照E3，RNAi-^i^i^-2, 14株系達(dá)到了極顯著水平，其 葡萄糖含量分別比E3降低了 44%、38%(見(jiàn)圖5A)，果糖含量分別比E3降低了 40%、42%(見(jiàn)圖 5B)，蔗糖含量無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖5C);而3個(gè)雙干涉RNAi-(泣似#7+泣似#幻轉(zhuǎn)基因株系塊 莖在4°C儲(chǔ)藏30天的葡萄糖、果糖和蔗糖含量均顯著低于對(duì)照E3,在葡萄糖、果糖含量上這 三個(gè)株系都達(dá)到極顯著水平，還原糖含量顯著下降，尤其是RNAi-(泣似#7+泣似#9) -11株 系葡萄糖含量比E3降低了 58% (見(jiàn)圖5A)，果糖含量比E3降低了 48% (見(jiàn)圖5B)，蔗糖含量 差異不太顯著(見(jiàn)圖5C)。從總的還原糖含量上看，雙干涉RNAi-(泣似#7+泣似轉(zhuǎn)基因 株系還原糖含量顯著低于RNAi-^^T^、RNAi-^i^#7和干涉株系，3個(gè)雙干 涉轉(zhuǎn)基因株系都達(dá)到了極顯著水平(見(jiàn)圖5C)，表明了同時(shí)干涉和份后塊莖還 原糖含量大幅度下降，對(duì)低溫糖化的調(diào)節(jié)效果顯著優(yōu)于單獨(dú)干涉似#7、5?似#沒(méi)。
[0031] 發(fā)明人又對(duì)處理的轉(zhuǎn)基因株系塊莖進(jìn)行了 β-淀粉酶活性和淀粉含量的測(cè)定， 淀粉酶活性用淀粉酶試劑盒(Megazyme，Ireland)測(cè)定，根據(jù)馬鈴薯塊莖淀粉酶特性測(cè)定 方法有改動(dòng)。淀粉含量通過(guò) Amyloglucosidase (Roche 11202367001)測(cè)定（Hargreaves and ap Rees, 1988)。RNAi-泣似#7、RNAi-泣似#9、雙干涉 RNAi-(泣似#7+泣似#9)轉(zhuǎn) 基因株系塊莖4°C處理30天后，其β -淀粉酶活性相比對(duì)照都有一定的下降，尤其是雙 干涉RNAi-(泣似#7+泣似轉(zhuǎn)基因株系β -淀粉酶活性不僅極顯著低于對(duì)照，而且 相比于RNAi-泣似#7、RNAi-泣似J份轉(zhuǎn)基因株系也顯著降低（見(jiàn)圖6)。對(duì)于淀粉含量， RNAi-SiAsjd RNAi-Si^4#7、RNAi-Si^^i^、雙干涉 RNAi-(泣似#7+泣似#9)干涉轉(zhuǎn)基因株 系4°C處理30天的塊莖淀粉都有不同程度的積累，僅有雙干涉RNAi-(泣似#7+泣似轉(zhuǎn)基 因株系達(dá)到顯著水平(見(jiàn)圖7)。結(jié)果暗示了同時(shí)干涉這兩個(gè)基因后，轉(zhuǎn)基因株系塊莖β-淀 粉酶活顯著降低，淀粉積累，且酶活降低程度和淀粉積累程度都顯著高于RNAi-泣辦?jd?、 RNAi-^i^4#7和干涉轉(zhuǎn)基因株系。
[0032] 現(xiàn)有的試驗(yàn)結(jié)果表明，同時(shí)干涉泣似#2、泣似J份這兩基因后，馬鈴薯塊莖還原糖 含量大幅度下降，對(duì)低溫糖化的調(diào)節(jié)效果顯著優(yōu)于單獨(dú)干涉似#7、5?似#9,是在 馬鈴薯塊莖抗低溫糖化上很具潛力的功能基因。
【權(quán)利要求】
1. 調(diào)控馬鈴薯低溫糖化的多核苷酸序列，該序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
2. 包含權(quán)利要求1所述多核苷酸序列的表達(dá)載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于：它是pHellsgate8載體。
4. 包含權(quán)利要求2或3所述表達(dá)載體的細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞，其特征在于：它是大腸桿菌DH5ci或農(nóng)桿菌LBA4404。
6. 權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列SEQ ID NO: 1在馬鈴薯抗低溫糖化中的應(yīng)用。
7. 泣似#7聯(lián)用泣似J份在馬鈴薯抗低溫糖化中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK104120131SQ201410366768
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】宋波濤, 侯娟, 謝從華, 柳俊 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)