用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物及造紙方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物及造紙方法和應(yīng)用，所述組合物主要由以下組分組成：對纖維具有氧化功能的生物酶組分，所述生物酶組分為通過氧化還原反應(yīng)來改變纖維表面性質(zhì)的纖維氧化酶；和對纖維氧化酶具有增加催化活性的輔助組分，所述輔助組分為對纖維氧化酶具有催化作用的蛋白質(zhì)，所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0.4-50。所述組合物處理紙漿，所制得的紙張不但其強度顯著增強，且紙漿的濾水性能大大提高。
【專利說明】用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物及造紙方法 和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物酶和使用生物酶改善纖維物理化學(xué)性質(zhì)的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉 及一種用纖維氧化酶改變和改善纖維表面性質(zhì)的組合物及造紙方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 中國造紙工業(yè)在2000-2010年間連續(xù)10年保持高增長率，到2011年我國紙及紙 板的生產(chǎn)量和消費量均超過1億噸，均居世界第一位。紙或紙板的組成原料主要是纖維，由 于制漿、造紙需要大量的原料，而且對環(huán)境有一定的影響，目前世界各國造紙行業(yè)都在壓縮 制漿生產(chǎn)，以保證森林資源，加上國內(nèi)原料林基地建設(shè)遲緩，供材有限，而非木漿發(fā)展受到 清潔生產(chǎn)新技術(shù)開發(fā)滯后的影響，中國造紙工業(yè)發(fā)展面臨的資源、能源和環(huán)境的約束日益 突顯。
[0003] 目前，中國造紙企業(yè)近80%的生產(chǎn)原料為非木纖維的原料，其中約70%為回收纖 維和10%為草漿、蘆葦漿和甘蔗渣漿等。這些原料的纖維本身很多性能遠(yuǎn)比木纖維差，而且 其表面活性低，纖維之間的結(jié)合力差，由此帶來很多生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量問題。
[0004] 例如，為使產(chǎn)品的物理指標(biāo)滿足要求，造紙企業(yè)目前采用的辦法是：
[0005] (1)增加產(chǎn)品的定量，增加紙張密度；此方法的缺點是增加生產(chǎn)成本，浪費資源；
[0006] (2)增加磨漿，提高纖維表面分絲帚化，提高紙張強度；此方法的缺點是能耗高， 降低制漿的游離度，降低纖維得率和增加烘干能耗；
[0007] (3)使用干強劑/濕強劑等化學(xué)品，例如使用陽離子淀粉、陰離子淀粉、羧甲基纖 維素鈉、聚丙烯酰胺、陰離子聚丙烯酰胺，以及低分子量陽離子聚合物等，來增加紙漿的脫 水性能或強度，此方法的缺點是成本高，鈍化纖維，對造紙水系統(tǒng)循環(huán)不利，增加C0D排放； 和
[0008] (4)提高木纖維漿料比例，此方法缺點是成本高，增加進(jìn)口原料的依賴性?？梢?，這 些方法有多方面的問題，制漿造紙工業(yè)目前迫切需要一種高效的方法來解決這些難題。
[0009] 早在上世紀(jì)六十年代，人們開始研究使用生物酶來改變紙漿和改善造紙。 1986年努等人報道了木聚糖酶對漂白化學(xué)楽的酶法打楽作用（NoeP.etal.，Actionof xylanasesonchemicalpulpfibers,J.WoodChern.Techno.，6:167, 1986) 〇 近一二十年 來，人們對生物技術(shù)在制漿造紙工業(yè)的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，研究范圍幾乎涉及了制漿 造紙工業(yè)的各個方面（Bajpai，BiotechnologyforPulpandPaperProcessing，2012, Springer,ISBN978-1-4614-1408-7)。美國專利US4, 923, 565，US5, 110, 412 和US5, 308, 449 提出使用纖維素酶或半纖維素酶提高造紙紙漿的脫水性。US5, 725, 732提出使用纖維素酶 和半纖維素酶解決纖維的掉毛缺陷，US6, 066, 233建議用纖維素酶和果膠酶結(jié)合使用可通 過紙漿的濾水性。美國專利US5, 582, 681提出用纖維素酶、半纖維素酶和脂肪水解酶等混 合酶制劑提高衛(wèi)生紙的柔韌性。此外用纖維素酶、半纖維素酶處理紙漿，還可改善纖維壓縮 性，使紙頁微孔性下降，密度提高，透明度提高。
[0010] 造紙行業(yè)目前使用的所謂"纖維改性酶"都是利用纖維素水解酶，包括內(nèi)切纖維素 酶和外切纖維素酶，對纖維的（_1，4苷糖鍵（b-l，4-linkedD-glucoseunits)進(jìn)行水解反 應(yīng)，逐步降解（depolymerization)成為較小分子量的多糖。應(yīng)用的結(jié)果顯示，纖維素水解 酶對于降低磨漿能耗和提高網(wǎng)部脫水有一定的效果。但是，基于纖維水解酶的"打漿酶"技 術(shù)有幾個極大弊病：
[0011] (a)纖維素水解酶對纖維的作用在造紙過程中具有不可控性和不可逆性，當(dāng)纖維 素的濃度或作用時間過長時，纖維素酶會首先潰解纖維細(xì)胞，對纖維表面的纖絲象剃胡須 一樣的剪除，甚至對纖維整體進(jìn)行切斷，致使纖維損傷，其結(jié)果導(dǎo)致紙產(chǎn)品"發(fā)脆"和強度指 標(biāo)（特別是撕裂度和耐破度等）大幅度下降，甚至導(dǎo)致紙漿作廢，給企業(yè)造成經(jīng)濟損失。
[0012] (b)纖維素水解酶對纖維的（-1，4苷糖鍵進(jìn)行水解反應(yīng)，降低纖維的聚合度 (degreeofpolymerization),最終產(chǎn)生葡聚糖和單糖，致使纖維溶解。當(dāng)纖維素酶的用量 過高或者停留時間過長時，纖維的降解率可高達(dá)1%，不僅造成纖維損失，降低纖維的綜合 利用率，而且大大增加白水中的C0D含量，不利于節(jié)能減排。
[0013] (c)纖維素水解酶對底物"比較很挑剔"，只對較純凈的纖維素才有較顯著作用，甚 至只對某種纖維素有明顯的作用。例如，現(xiàn)有纖維素酶大多數(shù)對漂白化學(xué)針葉漿有較顯著 的作用，而對漂白化學(xué)闊葉漿的作用較小。如果纖維含量木素，例如未漂針葉漿，受表面木 素的影響，纖維素分解酶的作用很小。對含木素高的機械漿，纖維素水解酶就失去其作用。
[0014] 為了避免常規(guī)纖維素酶對纖維過分剪切而降低纖維強度的缺陷，美國專利 US6, 294, 366 和US6, 635, 146 公開了使用截短的纖維素酶（CBD-truncatedcellulose)處 理紙漿，截短的酶缺少纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)，使用這樣的纖維素酶處理紙漿，可以避免 這樣的纖維強度的損失。在相似的紡織工業(yè)應(yīng)用中，US5, 916, 799公開了含有纖維二糖水 解酶和內(nèi)切葡聚糖酶的纖維素酶組合物，這兩種酶己經(jīng)進(jìn)行了有限的蛋白水解，從而將酶 的核心和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開，發(fā)現(xiàn)得到的酶組合物降低返染。W096/23928公開了使用 截短的纖維素酶處理含有纖維素的織物，發(fā)現(xiàn)能夠減少染料的再沉積并增加磨損。
[0015]Shoseyov等（Chapter8:ModulationofWoodFibersandPaperby Cellulose-BindingDomain,InApplicationsofEnzymestoLign°Cellulosics； EditedbyMansfieldetal. .ACSSymposiumSeries；AmericanChemical S°Ciety:Washington,DC, 2003,pagell6-132)發(fā)現(xiàn)，單獨使用纖維素親合結(jié)構(gòu)域 (cellulose-bindingdomain,CBD)蛋白能提高紙張的強度，而且聚合纖維結(jié)合蛋白（即 由兩個或更多的單體纖維結(jié)合蛋白組成的聚合分子，又稱纖維鍵聯(lián)蛋白）比單體纖維 結(jié)合蛋白對紙張強度的提高更有效。Levy等（Cellulose，2002, 9:91-98)報道，經(jīng)過纖 維結(jié)合蛋白質(zhì)處理后的紙張的強度和紙面防濕性都大大地提高。Pala等（Chapter7: Cellulose-BindingDomainasaToolforPaperRecycling,InApplicationsof EnzymestoLign°Cellulosics；EditedbyMansfieldetal. .ACSSymposiumSeries； AmericanChemicalS°Ciety:Washington,DC, 2003，pagel05_115)報道，用CBD處理后的 回收廢紙的強度有顯著增加。Kitaoka等（JWoodSci.，2001，47:322-324)描述了使用纖維 素親合結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)和陰離子聚合物聚丙烯酰胺（CBD-APAM)合成新的聚合物，作為干強 度或濕強度添加劑，比常規(guī)干強/濕度添加劑更有效。
[0016] 中國專利"一種用于改變和改善纖維表面性質(zhì)的組合物和造紙方法"（專利號： ZL201010566132.2)提出聯(lián)合使用纖維素酶和纖維結(jié)合蛋白（CBP)和纖維素酶處理纖維紙 漿，通過纖維結(jié)合蛋白選擇吸附在纖維的非晶型區(qū)域表面，庇護(hù)該區(qū)域不受纖維素酶的作 用，從而避免纖維素酶對纖維非晶型纖維的過度剪切。但是在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，由于纖維結(jié) 合蛋白（CBP)吸附的可逆性，特別是當(dāng)聚能酶"產(chǎn)品在磨漿之前加入時，經(jīng)過磨漿之后紙漿 產(chǎn)生大量新生表面，這些新纖維表面將被暴露在纖維素酶的"攻擊"之下，如果停留時間較 長，纖維被過度剪切，導(dǎo)致紙產(chǎn)品的強度下降。
[0017] 因此，制漿造紙工業(yè)迫切需要一種既能與纖維反應(yīng)使纖維表面活化、又不會潰解 纖維導(dǎo)致纖維強度下降的新型生物酶技術(shù)，而且這種生物酶能對不同纖維材料（包括木纖 維、非木纖維和回收纖維）都具有顯著活性的廣譜性生物酶，這樣的新型生物酶技術(shù)將對 中國造紙工業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于改變和改善制漿造紙纖維材料性質(zhì)的纖維 氧化酶組合物，通過使用該組合物處理紙漿原料，能顯著提高纖維之間的結(jié)合力，改善紙張 的質(zhì)量和紙漿的脫水效率。
[0019] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
[0020] -種用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其含有：
[0021] i)對纖維具有氧化功能的生物酶組分，所述生物酶組分為通過氧化還原反應(yīng)來改 變纖維表面性質(zhì)的纖維氧化酶；和
[0022] ii)對所述纖維氧化酶具有增加催化活性的輔助組分，所述輔助組分為對纖維氧 化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)；
[0023] 所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0. 4-50。
[0024] 在其中一些實施例中，所述纖維氧化酶為一族分子量在20_50KDa、具有銅依賴性 的小分子金屬酶的聚糖加氧酶；或/及
[0025] 所述對纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)為有催化活性的生物酶或無催化活性 的纖維素結(jié)合蛋白。
[0026] 在其中一些實施例中，所述有催化活性的生物酶為氧化還原酶、非纖維素水解酶 的水合酶或纖維素水解酶；所述氧化還原酶選自纖維二糖脫氫酶、漆酶、葡糖氧化酶、過氧 化氫歧化酶、酒精脫氫酶或木質(zhì)素過氧化酶中一種或多種，所述非纖維素水解酶的水合酶 選自淀粉酶、木聚糖酶、果膠酶或酯酶中一種或多種。
[0027] 在其中一些實施例中，所述氧化還原酶為纖維二糖脫氫酶和漆酶，所述纖維二糖 脫氫酶和漆酶的重量比為1:1-5。
[0028] 在其中一些實施例中，所述無催化活性的蛋白質(zhì)為纖維結(jié)合蛋白和/或纖維膨脹 蛋白。
[0029] 在其中一些實施例中，所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0. 4-30。
[0030] 在其中一些實施例中，所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0. 4-10。
[0031] 在其中一些實施例中，所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0. 4-5。
[0032] 在其中一些實施例中，所述纖維氧化酶組合物還包括纖維氧化酶反應(yīng)產(chǎn)物的清除 齊U;所述纖維氧化酶和清除劑的重量比為1:卜5。
[0033] 在其中一些實施例中，所述清除劑選自抗壞血酸、沒食子酸、木質(zhì)素、錳（II)鹽、 銅（II)鹽或鐵（II)鹽中的一種或多種。
[0034] 在其中一些實施例中，所述纖維氧化酶的反應(yīng)底物為氧氣、空氣或者氧氣釋放化 合物；所述氧氣釋放化合物為過氧化物或者臭氧。
[0035] 在其中一些實施例中，所述過氧化物為過氧化氫、過氧化鈉、過氧化鈣或過氧化鉀 中的至少一種。
[0036] 本發(fā)明的另一目的提供新的造紙方法，該方法比現(xiàn)有技術(shù)更有效地利用纖維原 料、提高紙產(chǎn)品的性能和品質(zhì)，改善生產(chǎn)效率和降低能耗。
[0037] 實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
[0038] 一種造紙方法，主要包括以下步驟：
[0039] a)形成含水的纖維素造紙漿料，
[0040]b)將上述一種用于改變和改善纖維性能的纖維氧化酶組合物加入到紙漿料中充 分反應(yīng)；
[0041]c)將紙漿送上網(wǎng)，由此通過濾出水而由纖維等固體組分形成紙頁，
[0042]d)將紙頁經(jīng)過壓榨段和干燥段，最終生產(chǎn)出紙產(chǎn)品。
[0043] 在其中一些實施例中，所述纖維氧化酶用量為每噸干漿料0.01-10千克，所述輔 助組分的用量為每噸干漿料〇. 05-10千克。
[0044] 在其中一些實施例中，所述纖維氧化酶用量為每噸干楽料〇. 05-10千克，所述輔 助組分的用量為每噸干漿料〇. 1-5千克。
[0045] 在其中一些實施例中，所述纖維氧化酶用量為每噸干漿料0. 05-2千克，所述輔助 組分的用量為每噸干漿料〇. 1-5千克。
[0046] 在其中一些實施例中，所述反應(yīng)的時間為5-600分鐘，pH為3-10，溫度為20-80°C。
[0047] 在其中一些實施例中，所述反應(yīng)的時間為20-300分鐘，pH為5-10,溫度為 30-65。。。
[0048] 在其中一些實施例中，所述反應(yīng)的時間為20-200分鐘，pH為5-7，溫度為40-65 °C。
[0049] 本發(fā)明的另一目的在于提供纖維氧化酶組合物或纖維氧化酶在造紙工藝中作為 改變和改善纖維性質(zhì)的增強劑或助留助濾劑的應(yīng)用。
[0050] 現(xiàn)有造紙技術(shù)中紙漿制漿存在的問題是主要是纖維的活性低，纖維之間的反應(yīng)度 低，為了達(dá)到紙產(chǎn)品的質(zhì)量要求，通常的辦法是增加打漿度，但是增加磨漿會導(dǎo)致纖維被切 斷，產(chǎn)生大量的細(xì)小纖維，不僅降低制漿的脫水性能，增加造紙的烘干能耗，而且可能導(dǎo)致 細(xì)小纖維流失，原料利用率下降。現(xiàn)有的"打漿酶"是利用纖維素水解酶對纖維進(jìn)行水解反 應(yīng)，雖然目前該技術(shù)還在初級應(yīng)用階段，但已經(jīng)暴露出嚴(yán)重問題，即纖維素水解酶對紙漿纖 維的反應(yīng)是不可控性的和不可逆性的，稍有不當(dāng)，將造成紙漿強度明顯下降，甚至產(chǎn)生次品 或廢品。
[0051] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果：
[0052] 本發(fā)明經(jīng)發(fā)明人的實驗和研究，得出纖維氧化酶及其組合物能改變和改善纖維表 面性質(zhì)，并確定了纖維氧化酶組合物的最佳組分及其配比，所述纖維氧化酶組合物或纖維 氧化酶對不同纖維材料（包括木纖維、非木纖維和回收纖維）都具有顯著反應(yīng)活性，采用 所述纖維氧化酶組合物或纖維氧化酶處理紙漿原料，如：木漿/化學(xué)漿，主要是漂白和未漂 白的木漿/化學(xué)漿的處理，包括二次回收纖維；還有木漿/機械漿，及非木漿（秸桿、稻草、 蘆葦和煙葉等），處理過程中，纖維氧化酶集中在晶型纖維表面的反應(yīng)，激活該部分纖維的 表面活性，增加纖維反應(yīng)活性，提高纖維間的結(jié)合力，而不會潰解纖維導(dǎo)致纖維強度下降； 采用該種纖維氧化酶及其組合物處理上述紙漿，不僅能改善制得的紙張的各種物理強度， 如：叩解度、抗張指數(shù)、撕裂度、層間結(jié)合力、耐破度和白度（特別是廢紙的白度），還能改善 紙漿的濾水性能（尤其是非木漿的濾水性能），同時降低制漿的有游離度，還能夠改變紙漿 (尤其是木片漿）的打漿性能，大大地降低打漿能耗，且環(huán)保，這對造紙生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)具有重要 意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1為實施例3中生物酶處理木片的流程示意圖；
[0054] 圖2為實施例3中不同處理條件對TMP漿的游離度與磨漿能耗的關(guān)系圖；
[0055] 圖3為實施例4中復(fù)合生物酶處理TMP漿對磨漿能耗的影響結(jié)果圖；
[0056] 圖4為實施例6中纖維氧化酶處理非木漿對紙張抗張強度的影響結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0057] 對于本發(fā)明所述技術(shù)術(shù)語的說明如下：
[0058] 纖維素水解酶：本發(fā)明中的"纖維素水解酶"是指所有的通過水解反應(yīng)來降解纖 維素的生物酶，目前常常把纖維素水解酶和纖維素酶、纖維水解酶和纖維酶等術(shù)語交替使 用。根據(jù)纖維素酶降解底物時不同的作用方式可將其分成3類：
[0059] (1)內(nèi)切纖維素酶又稱之為內(nèi)切葡聚糖酶（Endoglucanase，EG;EC3. 2. 1. 4);
[0060] (2)外切纖維素酶又稱之為纖維二糖水解酶（Cellobiohydrolase，CBH; EC3.2. 1. 91)；
[0061] (3) -葡萄糖昔酶（-glucosidase，BGL;EC3. 2. 1. 21)。
[0062] (a)內(nèi)切纖維素酶（又稱內(nèi)切葡聚糖酶，endo-1, 4_P-D-glucanase,EC3. 2. 1. 4) ，該類酶主要作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解0 -1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子 截短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素，其分子量大小約為23-146KD;
[0063] (b)外切纖維素酶（又稱外切葡聚糖酶，exo-1, 4-P-D-glucanase,EC3. 2. 1. 91) ，該類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解0 -1，4-D-14糖苷鍵，依次切下一個纖維二糖分 子，故又稱為纖維二糖水解酶（cellobiohydrolase，CBH)，分子量約38-118KD。
[0064](c)纖維二糖酶（又稱 3-葡萄糖苷酶，3-1，4_glucosidase，EC3. 2. 1. 21)，簡稱 BG。這類酶一般將纖維二糖或可溶性的纖維糊精水解成葡萄糖分子，其分子量約為76KD。
[0065] 纖維素酶的酶活性（CMCase):本發(fā)明中纖維素水解酶的酶活性是指纖維素酶組 分在它們將纖維素降解成葡萄糖、纖維二糖和二糖的能力方面的萄聚糖的酶活性。纖維素 酶的活性一般用羧甲基纖維素的溶液粘度的降低來確定。
[0066] 纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)（cellulosebindingprotein，CBP):本發(fā)明中的"纖維素結(jié)合 蛋白質(zhì)"是指對纖維素表面具有特別親和力、能強烈地吸附在纖維素表面的、但其本身對纖 維素沒有催化水解反應(yīng)活性的蛋白質(zhì)。在文獻(xiàn)中，又稱為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Cellulose BindingDomain,CBD)，纖維素結(jié)合模塊（CelluloseBindingModule,CBM)，纖維素吸附結(jié) 構(gòu)域，纖維素親合結(jié)構(gòu)域。
[0067] 纖維膨脹蛋白（Swollenin或者Expansin):本發(fā)明中的"纖維膨脹蛋白"系指一種 能使結(jié)晶纖維素和半纖維素等天然底物的纖維結(jié)構(gòu)膨脹疏松的蛋白/多肽化合物，這類蛋 白對纖維素沒有降解的催化功能，但能提高纖維素酶對微晶纖維素的水解能力。"纖維膨脹 蛋白"也稱為纖維膨脹因子，英文稱Swollenin和Expansin,是一類植物細(xì)胞壁擴展蛋白， 其具有纖維素酶典型結(jié)構(gòu)域組成（含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD))的非水解活性蛋白。源于 植物的纖維擴張蛋白主要有兩類，分別命名為a-expansin和0-expansin。兩類纖維擴 張蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上有較高的同源性：a-expansin分子量約25kDa，氨基酸序列高度保 守，同源性達(dá)70%?90% ; 0 -expansin分子量約29kDa，但氨基酸序列變化較大。
[0068] 纖維氧化酶（CelluloseOxidativeEnzymes):本發(fā)明中的"纖維氧化酶"是指 聚糖氧合酶（polysaccharidemonooxygenase，PM0)，所述"聚糖氧合酶"是指是一族分子 量在20_50KDa、含有銅（II)的小分子金屬酶（metalloenzyme)，能與纖維表面進(jìn)行加氧或 者去氫的氧化反應(yīng)，從而改變纖維表面化學(xué)性質(zhì)的生物酶。聚糖氧合酶的其它名稱包括聚 葡糖加氧酶或者稱聚葡糖單加氧酶（polysaccharidemonooxygenase，PM0)，裂解性聚糖 氧合酶（lyticpolysaccharidemonooxygenase,LPM0)，以及糖苷水化酶 61 族（glycosyl hydrolase61,GH61)。
[0069] 纖維氧化酶與纖維素水解酶的區(qū)別在于：纖維素水解酶是通過對P-1，4-D-14糖 苷鍵進(jìn)行水解反應(yīng)，使纖維素降解；而纖維氧化酶是通過對纖維素進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，反 應(yīng)所改變的鍵位不限于0-1，4-D-14糖苷鍵。雖然PM0早在1974年就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，由于 用CMCase(即測試內(nèi)切纖維素酶的活性方法）分析方法，發(fā)現(xiàn)PM0對0 -1，4-D-14糖苷 鍵的水解反應(yīng)非常微弱，于是人們對該酶種的作用和其反應(yīng)機理沒有進(jìn)行更深入的研究 認(rèn)識，CAZy(CarbohydrateActiveEnzymes，簡稱CAZy，http://www.cazy.org/)把它們 劃分為GlycosylHydrolases61族（GH61)。然而，最新研究表面，PM0實際是一種銅-依 賴性單氧加合酶（Copper-dependentmonooxygenases，EC1. 14. 17.X)，它是通過氧化反應(yīng) 而對纖維進(jìn)行作用的，而不像普通的纖維素水解酶那樣通過水解反應(yīng)對纖維進(jìn)行作用，因 此PM0是氧化酶而非水解酶。經(jīng)典的纖維素水解酶具有許多酶族，相反，PM0只有兩個家 族，即carbohydratebindingmodulefamily33(CBM33,碳水結(jié)合域家族 33)和glycosyl hydrolase(GH61，糖苷水解酶家族61)。CAZy最近將PM0重新列分為AA9類和AA10類生物 酶。前者主要來源是真菌（fungus)，而后者主要來自于細(xì)菌、病毒和某些真菌。
[0070]PM0存在于很多木素纖維降解的微生物中，可以依此提純和表達(dá)，或者通過現(xiàn)代 蛋白工程技術(shù)對酶蛋白進(jìn)行重組表達(dá)。例如，美國專利USPat. 7, 273, 738,美國專利申 請USA2009/099079，美國專利申請USA2013/0052698公開了一系列新的GH61酶種的列 序。美國專利US8,298,795和美國專利申請USA2012/0083019公開了從真菌宿主菌株 Myceliophthorathermophila(又稱Chrysosporiumlucknowense)獲得重組GH61 蛋白 (recombinantGH61proteins)以及聯(lián)合使用該GH61和和纖維素酶（cellulase)組合物處 理木質(zhì)纖維類物質(zhì)增加生物精煉效率、提高酒精產(chǎn)量的技術(shù)。迄今，有關(guān)PM0的應(yīng)用都在生 物精煉（biorefinery)，還沒有PM0在制漿造紙中應(yīng)用的報道。
[0071] 截止2013年2月，CAZy的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)收集了 249種PM0(即GH61)蛋白氨基酸列 序數(shù)據(jù)，大部分屬于子囊屬菌株（ascomycetous)和擔(dān)子菌（basidiomycetous)。而在NCBI/ JGIBlast的搜索結(jié)果顯示，目前共有761套GH61的基因系統(tǒng)。隨著研究深入，可以預(yù)見PMO的數(shù)據(jù)會繼續(xù)迅速增加。
[0072] 纖維氧化酶組合物：本發(fā)明中的"纖維氧化酶組合物"是指該組合物含有如下兩 種組分，一個組分是聚糖氧合酶（polysaccharidemonooxygenase)，和另外一個組分是能保 持或者增加對維氧化酶活性的輔助物，其中該輔助物可以是以下化合物的一個或多個化合 物，（1)纖維氧化酶的反應(yīng)底物氧氣或者氧氣釋放化合物（oxygenprecursors)、（2)反應(yīng) 產(chǎn)物的清除劑（radicalscavengers)、和（3)對纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)。
[0073] 本發(fā)明的"纖維氧化酶的反應(yīng)底物"是指除了纖維以外，聚糖氧化酶發(fā)生反應(yīng)所必 需的電子受體一氧氣；該反應(yīng)底物可以通過如下方式提供：氧氣、空氣或者氧氣釋放化合 物，本發(fā)明中的氧氣釋放化合物是指過氧化物或者臭氧，其中過氧化物包括過氧化氫、過氧 化鈉、過氧化鈣、過氧化鉀。
[0074] 本發(fā)明的"對纖維氧化酶的有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)"是指能增加聚糖氧化酶反應(yīng)活 性的生物酶、纖維素結(jié)合蛋白、和纖維膨脹蛋白；其中對聚糖氧化酶有促進(jìn)作用的生物酶 是指除了纖維素水解酶以外的其它類水解酶（包括淀粉酶、果膠酶、脂肪酶、酯酶或木聚糖 酶）和氧化還原酶（包括纖維二糖脫氫酶、漆酶、葡糖氧化酶、過氧化氫歧化酶、酒精脫氫酶 或木質(zhì)素過氧化酶）。
[0075] 本發(fā)明的"纖維氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物清除劑"是指能降低聚糖氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物過 氧化氫濃度的化合物，包括抗壞血酸（ascorbate)、沒食子酸（gallate)、木質(zhì)素（lignin)、 銅（II)鹽即二價銅鹽、鐵（II)鹽即二價鐵鹽、錳（II)鹽即二價錳鹽和鋅（II)鹽即二價鋅 鹽。
[0076] 本發(fā)明涉及使用纖維氧化酶來處理制漿造紙的纖維原料，以改變纖維表面的化學(xué) 性質(zhì)，提高纖維的反應(yīng)活性，增加纖維之間的結(jié)合力，從而提高紙張的強度指標(biāo)，增加脫水 烘干效率，降低能耗，為造紙企業(yè)節(jié)約生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟利潤。
[0077] 本發(fā)明所涉及的纖維素氧化酶可以是以其單個酶組分的產(chǎn)品分別加入造紙過程 中，以可以將兩組分分別加入不同的位置或者是混合成一個產(chǎn)品配方加入造紙過程中同意 位置，以達(dá)到最佳的效果。
[0078] 本發(fā)明所涉及的使用纖維氧化酶的目的和效果是通過氧化酶對纖維表面的晶型 區(qū)域反應(yīng)，產(chǎn)生表面反應(yīng)活性很高的鍵位，使纖維之間的結(jié)合力增加。而且纖維氧化酶對纖 維的反應(yīng)可以通過控制在纖維表面，不會對纖維有過度的反應(yīng)，從而達(dá)到選擇性的纖維表 面改性和修復(fù)。因此，與傳統(tǒng)的纖維素水解酶相比，從而避免了傳統(tǒng)纖維素水解酶的降解纖 維的問題。
[0079] 本發(fā)明所述單位"kg/T"是指每噸絕干漿中添加物料的千克數(shù)。
[0080] 以下將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0081] 實施例1纖維氧化酶和氧化酶組合處理機械闊葉漿對其紙張強度的影響
[0082] -、實驗?zāi)康?br> [0083] 通過對比分析評價纖維氧化酶組合物處理機械闊葉漿對其紙張強度的影響。
[0084] 二、實驗方法
[0085] (1)試驗材料準(zhǔn)備
[0086] 本實驗所述機械闊葉漿由山東萬國紙業(yè)26號機的紙漿廠提供。
[0087] 纖維氧化酶（PM0)由美國Dyadic公司提供的GH61，該酶種從菌株 Myceliophthorathermophila制取，其氨基酸列序在美國專利US8, 298, 795和美國專利申 請USA2012/0083019有詳細(xì)表述。
[0088] 漆酶和纖維二糖脫氫酶為DuPont集團(tuán)Genencor公司的商業(yè)產(chǎn)品。
[0089] (2)造紙方法
[0090] A、制漿：將200克漿板和1300克去離子水放置在10升的水力碎漿機中，碎漿10 分鐘，然后再加2500克水，配得得到5%的漿。
[0091] B:反應(yīng)：
[0092] (1)取上述配好的漿400克，放入1000ml混合攪拌器中，用恒溫控制器控制漿的溫 度在50°C。
[0093] (2)本實驗分為實驗組和對照組；
[0094] 對照組1為空白樣品：不加任何藥劑；
[0095] 對照組1為：100g/T、400g/T漆酶處理；
[0096] 對照組2為：100g/T、250g/T纖維二糖脫氫酶處理；
[0097] 實驗組為經(jīng)酶處理的樣品，其中，
[0098] 實驗組1為：250g/T(絕干漿）纖維氧化酶（PM0)處理；
[0099]實驗組2為纖維氧化酶+漆酶組合物處理：100g/T，250g/T纖維氧化酶（PM0)，加 上的漆酶一起處理，漆酶用量為400g/T;
[0100] 實驗組3為纖維氧化酶+纖維二糖脫氫酶組合物處理：250g/T纖維氧化酶（PM0)， 加上100g/T纖維二糖脫氫酶一起處理；
[0101] 實驗組4為纖維氧化酶+漆酶+纖維二糖脫氫酶組合物處理：100g/T纖維氧化酶 +200g/T漆酶+100g/T纖維二糖脫氫酶一起處理；
[0102] 上述各組的反應(yīng)條件均為：反應(yīng)溫度為50°C，反應(yīng)時間為150分鐘，反應(yīng)pH為 5. 7-6. 0,恒速攪拌。
[0103]C、手抄紙準(zhǔn)備和強度測量：將上述制備好的漿，加自來水稀釋到1. 0 %的漿濃，混 勻，測量溫度和漿濃度，按TAPPI方法，精確制備10-12張6. 5克重的手抄紙。烘干后，手抄 紙放在恒溫和恒濕度的控制箱中24小時，然后按TAPPI測量方法測量其厚度（密度）、抗張 強度、撕裂強度和結(jié)合強度。
[0104] 三、實驗結(jié)果
[0105] 實驗結(jié)果參見表1，從表1中可知：纖維氧化酶單獨處理紙漿和與其他氧化酶（漆 酶和/或纖維二糖脫氫酶）聯(lián)合使用時對紙張的各種強度性質(zhì)的影響結(jié)果，如：叩解度、抗 張指數(shù)、撕裂度和層間結(jié)合力。與空白條件相比，加入單獨加入漆酶或者纖維二糖脫氫酶處 理機械闊葉漿，對紙張的各種強度性質(zhì)的影響不顯著。但是，當(dāng)漆酶或者纖維二糖脫氫酶與 纖維氧化酶聯(lián)合使用時，紙張各種強度都顯著增加；特別是當(dāng)纖維氧化酶、漆酶和纖維二糖 脫氫酶三者一起使用時，紙張的抗張強度和撕裂度提高了 40%和60%。這些結(jié)果表明，纖 維氧化酶和漆酶及纖維二糖脫氫酶，纖維氧化酶集中在晶型纖維表面的反應(yīng)，激活該部分 纖維的表面活性，增加纖維反應(yīng)活性，并且提高纖維間的結(jié)合力，進(jìn)而顯著提高了機械闊葉 漿制得的紙張的各種物理強度。
[0106] 表1實驗組和對照組處理機械闊葉漿對紙張物理指標(biāo)的影響結(jié)果表
[0107]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是，包括以下組成： i) 對纖維具有氧化功能的生物酶組分，所述生物酶組分為通過氧化還原反應(yīng)來改變纖 維表面性質(zhì)的纖維氧化酶；和 ii) 對纖維氧化酶具有增加催化活性的輔助組分，所述輔助組分為對纖維氧化酶具有 促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)； 所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0. 4-50。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是， 所述纖維氧化酶為一族分子量在20-50KDa、具有銅依賴性的小分子金屬酶的聚糖加氧酶； 或/及 所述對纖維氧化酶具有促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)為有催化活性的生物酶或無催化活性的纖 維素結(jié)合蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是， 所述有催化活性的生物酶為氧化還原酶、非纖維素水解酶的水合酶或纖維素水解酶；所述 氧化還原酶選自纖維二糖脫氫酶、漆酶、葡糖氧化酶、過氧化氫歧化酶、酒精脫氫酶或木質(zhì) 素過氧化酶中一種或多種，所述非纖維素水解酶的水合酶選自淀粉酶、木聚糖酶、果膠酶或 酯酶中一種或多種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是， 所述無催化活性的蛋白質(zhì)為纖維結(jié)合蛋白和/或纖維膨脹蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是， 所述生物酶組分和輔助組分的重量比例為1:0. 4-10。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其 特征是，所述纖維氧化酶組合物還包括纖維氧化酶的反應(yīng)產(chǎn)物的清除劑；所述纖維氧化酶 和清除劑的重量比為1:1-5。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物，其特征是， 所述清除劑選自抗壞血酸、沒食子酸、木質(zhì)素、錳（II)鹽、銅（II)鹽或鐵（II)鹽中的一種 或多種。
8. 纖維氧化酶或如權(quán)利要求1-7任一項所述的纖維氧化酶組合物在造紙工藝中作為 改變和改善纖維性質(zhì)的增強劑或助留助濾劑的應(yīng)用。
9. 一種造紙方法，其特征是，主要包括以下步驟： a) 形成含水的纖維素造紙漿料， b) 將權(quán)利要求1-7任一項所述用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維氧化酶組合物加入到 造紙漿料中進(jìn)行反應(yīng)， c) 將步驟b)中得到的所述造紙漿料送上網(wǎng)，由此通過濾出水而由纖維固體組分形成 紙頁， d) 將紙頁經(jīng)過壓榨段和干燥段，最終生產(chǎn)出紙產(chǎn)品。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的造紙方法，其特征是，所述用于改變和改善纖維性質(zhì)的纖維 氧化酶組合物中的纖維氧化酶用量為每噸干漿料0. 01-10千克，所述輔助組分的用量為每 噸干漿料〇. 05-10千克；或/及 所述反應(yīng)時間為5-600分鐘，反應(yīng)pH為3-10,反應(yīng)溫度為20-80°C。
【文檔編號】C12N9/24GK104342424SQ201410366879
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月29日
【發(fā)明者】王祥槐, 謝焱 申請人:瑞辰星生物技術(shù)（廣州）有限公司