斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白h基因序列及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白H基因序列及其制備方法和用途，旨在提供斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白H基因序列，可以作為設(shè)計抗腫瘤藥物的靶位點或者調(diào)節(jié)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程，有利于人工繁殖斑節(jié)對蝦細(xì)胞；該H基因序列的核苷酸如SEQ?ID?NO：1所示；制備方法是通過提取斑節(jié)對蝦總RNA來cDNA第一鏈的合成，再以合成的第一鏈cDNA作為模板，利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-F1、cycH-F2對目的基因的3ˊ末端進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增；然后對斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白H基因的測定，最后進(jìn)行對斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白H基因分布和表達(dá)測定；屬于分子生物學(xué)中基因克隆領(lǐng)域。
【專利說明】斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞周期蛋白Η基因序列，具體地說，是涉及一種斑節(jié)對蝦細(xì)胞 周期蛋白Η基因序列，本發(fā)明還涉及該斑斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，屬 于分子生物學(xué)中基因克隆領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞周期調(diào)控是一個精確調(diào)控的過程。在細(xì)胞分裂過程中真核生物的細(xì)胞周期可 以概括為兩個大的階段：細(xì)胞分裂間期（即G1時期、S時期和G2時期）和細(xì)胞分裂期（即 Μ時期），在細(xì)胞分裂時期，需要許多周期蛋白參與調(diào)控以保證其精確性。
[0003] 周期蛋白Η基因做為CAK的重要組成部分，從酵母到人類具有高度的保守型。CAK 的激活需要周期蛋白Η基因與CDK7及ΜΑΤΙ結(jié)合，通過對CAK的磷酸化來實現(xiàn)其激酶活性。 周期蛋白Η基因也參與通用轉(zhuǎn)錄復(fù)合物TFIIH的構(gòu)成。TFIIH是一個多蛋白復(fù)合物，在轉(zhuǎn) 錄、DNA修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用。與其他周期蛋白相比周期蛋白Η基因在整個 細(xì)胞周期中表達(dá)量穩(wěn)定，所有周期時相均有表達(dá)。另有證據(jù)表明CDK2、CDK4及CDK6等的磷 酸化都與周期蛋白Η基因密切相關(guān)，周期蛋白Η基因通過對這些底物的磷酸化從而實現(xiàn)對 細(xì)胞周期的準(zhǔn)確調(diào)控，進(jìn)而可以實現(xiàn)對卵巢發(fā)育的調(diào)控。
[0004] 長期以來，斑節(jié)對蝦的人工繁育問題一直都是限制斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù) 瓶頸。在實際生產(chǎn)過程中，親蝦的性腺成熟參差不齊，難以集中育苗的問題是對蝦養(yǎng)殖過程 中一個非常重要的限制因素。眼柄切除手術(shù)作為促進(jìn)親蝦性腺同步成熟的常用方法，對親 蝦本身存在非常大破壞性，不利于可持續(xù)養(yǎng)殖，加大了養(yǎng)殖成本。因此出于尋求一種新的對 蝦繁育方法的需求，對對蝦卵巢發(fā)育機(jī)理及其分子調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究勢在必行。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述問題，本發(fā)明的以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計的PCR 擴(kuò)增引物，并通過RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因的全表達(dá)序列，有利于人 工催熟斑節(jié)對蝦。
[0006] 為解決前一技術(shù)問題，本發(fā)明提供的第一個技術(shù)方案是這樣的：該斑節(jié)對蝦細(xì)胞 周期蛋白Η基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0 :1所示。
[0007] 本發(fā)明提供的后一技術(shù)方案是這樣的：該斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制 備方法，依次包括下述方法 ：
[0008] 1)總RNA的提取
[0009] 對斑節(jié)對蝦解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃組織，并分別將 各組織溶于Trizol中勻漿，提取斑節(jié)對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存；
[0010] 2)cDNA第一鏈的合成
[0011] 將步驟1)中的斑節(jié)對奸總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物混合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA 第一鏈；
[0012] 3)斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因的PCR擴(kuò)增、克隆
[0013] 以步驟2)合成的第一鏈cDNA作為模板利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-Fl、 cycH-F2對目的基因的：Τ末端進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增得PCR產(chǎn)物；
[0014] 4)對斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因的測定
[0015] 對步驟3)所得到的PCR產(chǎn)物分離檢測、純化后，再將PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載 體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，測序；
[0016] 5)斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因的分布和表達(dá)
[0017] a)提取斑節(jié)對蝦不同組織以及不同發(fā)育時期的卵巢的總RNA，按照 PremeScriptTM RT reagent Kit操作手冊進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA 稀釋作為模板，采用SYBR Green I染料法，在Eppendorf?熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù) 據(jù)分析；
[0018] b)依照 TaKaRa SYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit 試劑盒說明書進(jìn)行 PCR 反應(yīng)， 實驗數(shù)據(jù)采用相對Λστ法分析斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因在各樣品中的相對表達(dá)量。
[0019] 進(jìn)一步的，上述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，步驟2)所述的 反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物為：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3。
[0020] 進(jìn)一步的，上述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于，步 驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV。
[0021] 進(jìn)一步的，上述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，步驟2)所述的 反應(yīng)條件：42°C 60min，70°C 15min。
[0022] 進(jìn)一步的，上述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，步驟3)所述的 接頭引物為：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
[0023] 進(jìn)一步的，上述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，步驟3)所述的
[0024] cycH-Fl ：5>AACCATTCCGCCCAGTAGAAG<3 ；
[0025] cycH-F2 :5>AACCTCCTGCCTCGGACACT〈3。
[0026] 進(jìn)一步的，上述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟3)中兩次 擴(kuò)增的所述反應(yīng)條件均為：94°C，5min ;94°C，30s ;55°C，45s，35cycles ;72°C，60s ;72°C， 10min〇
[0027] 進(jìn)一步的，上述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白H基因序列的制備方法，步驟b)中PCR 反應(yīng)使用引物步驟b)中PCR反應(yīng)使用引物為：
[0028] RTCYCH-F ：5>CGTGAGATTGAAGGCAAGTTAGA<3 ；
[0029] RTCYCH-R :5>GCTTCCCCAATGCAGGAA〈3。
[0030] 該斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列作為設(shè)計抗腫瘤藥物的靶位點或者調(diào)節(jié)斑 節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點：
[0032] 1、本發(fā)明提供的技術(shù)方案是以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計的 PCR擴(kuò)增引物，并通過RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因的全表達(dá)序列；此外 通過斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因設(shè)計熒光定量PCR引物，對周期蛋白Η基因在斑節(jié)對蝦 卵巢各個發(fā)育時相的分布情況及在不同組織中的分布情況進(jìn)行研究分析，更好的了解生物 體細(xì)胞中的信號通路的機(jī)制。不僅為研究斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因在卵巢發(fā)育中的作 用奠定基礎(chǔ)，而且可以為斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖過程中所出現(xiàn)的性腺發(fā)育參差不齊的情況從分子層 面提供理論基礎(chǔ)；有利于人工繁育斑節(jié)對蝦，并且減小了養(yǎng)殖成本。
[0033] 2、本發(fā)明提供的細(xì)胞周期蛋白Η作為細(xì)胞周期調(diào)控中一個重要的蛋白，在細(xì)胞分 裂、細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生、DNA的轉(zhuǎn)錄修復(fù)等方面起重要作用，也是對相關(guān)方向進(jìn)行研究 的一個重要突破點，可以用來作為抗腫瘤藥物設(shè)計的靶位點，在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程中 起重要作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1是斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因 mRNA組織表達(dá)模式；
[0035] 其中：垂直線表示平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差（重重復(fù)樣品數(shù)=4)，不同的字母表示存在 顯著性差異（P〈〇. 05)。
[0036] 圖2是斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因 mRNA卵巢發(fā)育六期表達(dá)模式；
[0037] 其中：垂直線表示平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差（重重復(fù)樣品數(shù)=4)。不同的字母表示存 在顯著性差異（P〈〇. 05)。

【具體實施方式】
[0038] 為了更好的理解、實施本發(fā)明的權(quán)利要求，下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明的權(quán)利 要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于下述實施例，而是以權(quán)利要求為限。
[0039] 1、總RNA的提取
[0040] 試驗所用的雌雄斑節(jié)對蝦（鮮重200g左右）均取自于海南三亞，室內(nèi)水族箱內(nèi)暫 養(yǎng)三天，水溫控制在24?25°C之間。解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃等組 織，并分別將組織于lmL Trizol(Invitrogen，日本）中勻楽，按Trizol試劑盒使用手冊提 取斑節(jié)對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，電泳觀察所提取RNA的完整性，并置于-80°C保存。
[0041] 1、總RNA具體提取步驟：
[0042] (1)加 200 μ L 預(yù)冷氯仿，渦旋振蕩 lmin 混勻，靜置 5min，12000g，4°C，15min。
[0043] (2)取三分之一上清溶液，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，冰上放置 lOmin，12000g，4°C，lOmin。
[0044] (3)倒掉上清，加 lmL75%乙醇重懸沉淀，7500g，4°C離心5min。
[0045] (4)重復(fù)步驟3 -次，并用槍頭吸出上清，干燥5?lOmin
[0046] (5)加 40 μ LddH20 溶解沉淀
[0047] (6) RNA的電泳檢測：將電泳槽、梳齒等置于3% H202過夜浸泡，配置1. 5%的瓊脂 糖凝膠（用〇. 5 X TBE溶液配制），取5 μ L總RNA加1 μ L上樣緩沖液，進(jìn)行30min電泳檢 測，對提取的RNA質(zhì)量進(jìn)行測定。
[0048] 2、cDNA第一鏈的合成
[0049] 取步驟1中斑節(jié)對蝦總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物（5>GGCCACGCGACTAGTAC (T) 16〈3) (10pmol/L)混合在反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA-鏈，
[0050] cDNA的反轉(zhuǎn)錄實驗按照相關(guān)試劑盒（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa))操作方法進(jìn)行。
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 制備權(quán)利要求1所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的方法，其特征在于，依次 包括下述方法： 1) 總RNA的提取 對斑節(jié)對蝦解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、腦、心臟、腸、精巢、胃組織，并分別將各組 織溶于Trizol中勻漿，提取斑節(jié)對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存； 2. cDNA第一鏈的合成 將步驟1)中的斑節(jié)對奸總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物混合，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第 一鏈； 3) 斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因的PCR擴(kuò)增、克隆 以步驟2)合成的第一鏈cDNA作為模板利用降落PCR法，用接頭引物和cycH-F 1、 cycH-F2對目的基因的：Τ末端進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增得PCR產(chǎn)物； 4) 對斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因的測定 對步驟3)所得到的PCR產(chǎn)物分離檢測、純化后，再將PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體中， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，測序； 5) 斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因的分布和表達(dá) a) 提取斑節(jié)對奸不同組織以及不同發(fā)育時期的卵巢的總RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手冊進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA稀釋作為模板，采用 SYBR Green I染料法，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析； b) 依照TaKaRaSYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，實驗 數(shù)據(jù)采用相對△CT法分析斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因在各樣品中的相對表達(dá)量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄引物為：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16〈3。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟2)所述的反應(yīng)條件：42°C 60min，70°C 15min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟3)所述的接頭引物為：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟 3)所述的 cycH-Fl 為：5>AACCATTCCGCCCAGTAGAAG〈3 ; cycH-F2 為：5>AACCTCCTGCCTCGGACACT〈3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列的制備方法，其特征在 于，步驟3)中兩次擴(kuò)增所述的反應(yīng)條件均為：94°C，5min ;94°C，30s ;55°C，45s，35cycles ; 72°C，60s ;72°C，lOmin。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白H基因序列的制備方法，其特征在于， 步驟b)中PCR反應(yīng)使用引物為： RTCYCH-F ：5>CGTGAGATTGAAGGCAAGTTAGA<3 ； RTCYCH-R : 5>GCTTCCCCAATGCAGGAA〈3。
10.權(quán)利要求1所述的斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Η基因序列作為設(shè)計抗腫瘤藥物的靶位 點或者調(diào)節(jié)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程。
【文檔編號】C12N15/70GK104099339SQ201410366921
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】趙超, 邱麗華, 江世貴, 周發(fā)林, 傅明駿 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所