基于纖維素代謝通路關(guān)鍵酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法
【專利摘要】一種基于纖維素代謝通路關(guān)鍵酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA經(jīng)過全基因合成構(gòu)建得到載體為模板，分別與對(duì)應(yīng)含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)應(yīng)分別得到編碼外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列、編碼內(nèi)切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列和編碼β‐1,4‐葡萄糖苷酶的核苷酸序列；然后將擴(kuò)增得到的序列依次連接到共表達(dá)載體，最終得到重組共表達(dá)載體和重組表達(dá)載體；之后將重組共表達(dá)載體先后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因共表達(dá)菌株。本發(fā)明應(yīng)用基因工程手段實(shí)現(xiàn)外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、內(nèi)切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶體外的大量表達(dá)合成，最終實(shí)現(xiàn)纖維素的原位快速降解。
【專利說明】基于纖維素代謝通路關(guān)鍵酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰略紅鏈霉菌的基于外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1，4 -葡萄糖苷酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)纖維素是植物界中最為豐富的天然高分子化合物，是植物通過光合作用產(chǎn)生的主要干物質(zhì)，主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。據(jù)估計(jì)，每年全世界綠色植物光合作用產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素總干重為1730億t，所含總能量高達(dá)2 X 118KJ,相當(dāng)于每年全世界消耗能量的10倍。木質(zhì)纖維素的生物降解和解聚作用是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，涉及眾多酶系的參與。
[0003]木質(zhì)纖維素中的纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機(jī)溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定。纖維素降解需要纖維素酶的參與，而纖維素酶并不是一種簡(jiǎn)單的酶，是由若干種相互關(guān)聯(lián)的酶組成的一個(gè)復(fù)雜的酶系，主要由3類組成:內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶(Endo - β -1,4- glucanase),稱為 Cx 酶；外切葡聚糖酶(EXo - β -1,4- glucanase),稱為Cl酶；β -葡萄糖苷酶(β - glucosidase)，稱為BG酶或CB酶。目前普遍接受的觀點(diǎn)是3種酶協(xié)同作用于纖維素的降解過程，即首先由Cx酶在纖維素聚合物的內(nèi)部起作用，在纖維素的非結(jié)晶部位進(jìn)行切割，產(chǎn)生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纖維二糖為單位，從末端進(jìn)行水解，最后由CB酶將纖維二糖徹底水解為葡萄糖。因此，對(duì)于實(shí)現(xiàn)纖維素的快速?gòu)氐姿馍鲜鋈N酶是缺一不可的。
[0004]已證實(shí)，自然中的細(xì)菌、真菌乃至放線菌均具有上述三種纖維素酶的合成能力。與真核生物相比，原核生物具有生長(zhǎng)速度較快，且基因無內(nèi)含子，具有易克隆、易表達(dá)等優(yōu)勢(shì)。鏈霉菌作為土壤中常見的一類細(xì)菌(放線菌)，對(duì)多數(shù)高分子化合物具有較強(qiáng)的分解能力并在碳循環(huán)中起至關(guān)重要的作用。其中灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens) JSD -1經(jīng)證實(shí)具有很強(qiáng)的纖維素分解能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中外切-β - 1，4 -葡聚糖酶、內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1，4 -葡萄糖苷酶在灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)內(nèi)多為誘導(dǎo)表達(dá)且表達(dá)水平很低的缺陷，提出一種基于纖維素代謝通路關(guān)鍵酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法，通過全基因組測(cè)序分析，從該鏈霉菌基因組分離到與纖維素降解有關(guān)的基因序列，其中包括編碼外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶的基因序列。本發(fā)明通過對(duì)灰略紅鏈霉菌內(nèi)相關(guān)基因(GC含量70%以上)進(jìn)行序列優(yōu)化后進(jìn)行全基因合成，并將目的基因序列插入到共表達(dá)載體中，最終實(shí)現(xiàn)纖維素降解關(guān)鍵酶的體外共表達(dá)。本發(fā)明對(duì)灰色鏈霉菌內(nèi)纖維素降解通路的研究乃至實(shí)現(xiàn)纖維素的快速降解均具有重要意義。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明涉及一種纖維素代謝通路關(guān)鍵酶的工程菌，該工程菌為通過全基因合成獲得的外切-β -1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶和β -1,4-葡萄糖苷酶基因的重組過表達(dá)菌株。
[0008]所述的纖維素代謝通路關(guān)鍵酶是指灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD -1外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶。
[0009]所述的外切-β - 1,4 -葡聚糖酶的核苷酸序列EXjn SEQ ID N0.1所示，內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶的核苷酸序列ENjB SEQ ID N0.2所示，β - 1，4 -葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列BGjB SEQ ID N0.3所示；其中:外切-β - 1，4 -葡聚糖酶的基因序列為1641bp，編碼546個(gè)氨基酸；內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶的基因序列為1029bp，編碼342個(gè)氨基酸；β - 1,4 -葡萄糖苷酶基因的基因序列為1359bp，編碼453個(gè)氨基酸。
[0010]所述的全基因合成是指:通過對(duì)灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶基因序列進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定表達(dá)宿主為 Ε.coli K12,回避 Nde 1、Nco 1、BamH 1、Xho 1、Msc I 和 EcoR I 酶切位點(diǎn)、同時(shí)避免序列中出現(xiàn)不依賴rho因子的轉(zhuǎn)錄終止子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
[0011]所述的灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens) JSD -1,現(xiàn)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5706，保藏日期為2012年I月9日，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所郵編100101。
[0012]本發(fā)明涉及上述工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA經(jīng)過全基因合成構(gòu)建得到的PUC57 - EX、pUC57 - EN和pUC57 - BG載體為模板，分別與對(duì)應(yīng)含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)應(yīng)分別得到編碼外切-β -1，4 -葡聚糖酶的核苷酸序列ΕΧ、編碼內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶的核苷酸序列EN和編碼β -1,4-葡萄糖苷酶的核苷酸序列BG ;然后將擴(kuò)增得到的序列EX和EN依次連接到共表達(dá)載體pACY⑶uet -1、將擴(kuò)增得到的序列BG連接到重組表達(dá)載體pET - 22b (+)，最終得到重組共表達(dá)載體pETDuet -EX-EN和重組表達(dá)載體pET - 22 - BG ;之后將重組共表達(dá)載體pETDuet -EX-EN與重組表達(dá)載體pET - 22 - BG先后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因共表達(dá)菌株。
[0013]所述的含有酶切位點(diǎn)的引物包括:
[0014]EX - Nco 1- F:TACCATGGCTGCTGTTCCGTGCACCGTTGACTACA
[0015]EX - BamH I _ R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAGAAACCGGCGGGTAAGCG
[0016]EN - Nde 1- F:TACATATGGACACCACCCTGTGCGAAGAATTCGGT
[0017]EN - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCGGTACGGCAAGCGGTA
[0018]BG - Msc 1- F:GATGGCCATGGTGACCATCGACTACGCTGCTCTGC
[0019]BG - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCAGCTTCACGAACACGT
[0020]所述的PCR擴(kuò)增的條件為:98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，60°C退火15s，72°C延伸15s ；30個(gè)循環(huán)后72°C終延伸3min。
[0021]所述的大腸桿菌表達(dá)菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0022]本發(fā)明涉及一種纖維素代謝通路的工程菌的應(yīng)用，將其用于木聚糖酶和木糖苷酶的體外高效表達(dá)，并最終實(shí)現(xiàn)纖維素的原位快速降解。
技術(shù)效果
[0023]現(xiàn)有木聚糖酶和木糖苷酶在灰略紅鏈霉菌內(nèi)為胞內(nèi)酶且表達(dá)量很低，因此嚴(yán)重限制了其使用范圍和效果；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種全新的木聚糖酶和木糖苷酶基因序列；在特殊條件下(如高溫以及堿性)具有更穩(wěn)定的生物學(xué)活性；本發(fā)明通過構(gòu)建外源表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了木聚糖酶和木糖苷酶的體外共表達(dá)，并通過在重組蛋白C端添加聚組氨酸標(biāo)簽的方法，保證了純化蛋白的質(zhì)量；使用新型大腸桿菌表達(dá)宿主，最大程度提高蛋白活性與可溶性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為基于JCat預(yù)測(cè)外切-β - 1,4 -葡聚糖酶基因序列優(yōu)化前后密碼子利用率對(duì)比圖；
[0025]圖2為基于JCat預(yù)測(cè)內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶基因序列優(yōu)化前后密碼子利用率對(duì)比圖；
[0026]圖3為基于JCat預(yù)測(cè)β -1，4 _葡萄糖苷酶基因序列優(yōu)化前后密碼子利用率對(duì)比圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
[0028]本實(shí)施例中灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)分離自上海市浦江鎮(zhèn)收集的腐爛
秸桿，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5706。將該菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，32°C培養(yǎng)48 h。
[0029]上述LB液體培養(yǎng)基組分為:蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L, NaCll0.0g/L,pH6.8 - 7.2。在液體培養(yǎng)基中加入15.0 - 20.0g/L瓊脂即得LB固體培養(yǎng)基。
[0030]I)灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)基因組 DNA 提取:收集 2.0mL 菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶菌酶(20mg/mL)和20 μ LEDTA溶液(0.5皿，卩!18.0)，371:處理4511^11，加入4 4 1^ RNase A(100mg/mL)，震蕩混勻 15s，室溫放置5min，隨后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒(TIANGEN)操作說明完成剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質(zhì)量，確保無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0031]2)灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)基因組測(cè)序:確定全基因組鳥槍法(WGS)策略，采用第二代測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建不同插入片段長(zhǎng)度的文庫，采用IlluminaMiseq(2X250bp)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。收集測(cè)序的原始數(shù)據(jù)，對(duì)帶接頭、低質(zhì)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，隨后采用Newbler v2.8對(duì)去除接頭的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼接,構(gòu)建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序進(jìn)行缺口填補(bǔ)得到鏈霉菌基因組草圖。
[0032]3)蛋白編碼基因功能預(yù)測(cè):采用Glimmer 3.0軟件對(duì)全基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。基因預(yù)測(cè)模型選取自我訓(xùn)練基因預(yù)測(cè)模型，即提取拼裝序列中最長(zhǎng)的序列，以該序列作為基因預(yù)測(cè)模型訓(xùn)練的序列。然后以該序列構(gòu)建的基因預(yù)測(cè)模型，對(duì)所有序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，設(shè)定開放閱讀框的長(zhǎng)度為llObp，其余參數(shù)為Glimmerf.0的默認(rèn)設(shè)置。
[0033]4)纖維素代謝通路編碼基因序列的優(yōu)化及人工合成:通過JCat在線程序?qū)衣约t鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)外切-β -1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶基因序列進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定表達(dá)宿主為Ε.coli Κ12，回避Nde
1、Nco 1、BamH 1、Xho 1、Msc I和EcoR I酶切位點(diǎn)、同時(shí)避免序列中出現(xiàn)不依賴rho因子的轉(zhuǎn)錄終止子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)，基因序列優(yōu)化前后密碼子使用頻率對(duì)比圖如圖1和圖2所示。全基因合成優(yōu)化后的基因序列并分別構(gòu)建到PUC57載體，得到pUC57 -EX、pUC57 -EN和pUC57 -BG質(zhì)粒。經(jīng)過序列優(yōu)化，基因密碼子使用率大幅度提高，更適合在大腸桿菌宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。
實(shí)施例2
[0034]共表達(dá)載體的構(gòu)建
[0035]I)根據(jù)優(yōu)化后核苷酸序列，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的PCR引物序列如下:
[0036]EX - Nco 1- F:TACCATGGCTGCTGTTCCGTGCACCGTTGACTACA
[0037]EX - BamH I _ R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAGAAACCGGCGGGTAAGCG
[0038]EN - Nde 1- F:TACATATGGACACCACCCTGTGCGAAGAATTCGGT
[0039]EN - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCGGTACGGCAAGCGGTA
[0040]BG - Msc 1- F:GATGGCCATGGTGACCATCGACTACGCTGCTCTGC
[0041] BG - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCAGCTTCACGAACACGT
[0042]2)以pUC57 - EX為模板，以含有Nco I和BamH I酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增獲得外切-β - 1，4 -葡聚糖酶基因序列，使用DNA A - Tailing Kit加A后連接到T - Vector PMD?19 - T (TaKaRa)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌內(nèi)。挑選陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒測(cè)序。若無誤，Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切(37°C )，回收外切-β - 1，4 -葡聚糖酶DNA片段ΕΧ。用相同內(nèi)切酶酶切共表達(dá)載體pETDuet -1并回收載體DNA片段。將EX與載體片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接(16°C )，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過抗性平板及菌落PCR篩選含有質(zhì)粒pETDuet - EX陽性克隆。挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素(50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm、37°C培養(yǎng)16小時(shí)后提取質(zhì)粒。
[0043]以含有Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶基因序列，加A后連接到PMD? 19-1'，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入0冊(cè)(1大腸桿菌內(nèi)。挑選陽性克隆搖菌并回收質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。若無誤,用Nde I和Xho I雙酶切該質(zhì)粒，回收內(nèi)切-β -1,4 -葡聚糖酶DNA片段ΕΝ。相同內(nèi)切酶處理重組表達(dá)載體pETDuet - EX并回收載體DNA片段。將EN與pETDuet - EX載體片段混合，T4DNA Ligase過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過抗性平板和菌落PCR篩選含有重組共表達(dá)載體pETDuet - EX - EN的陽性克隆。挑取陽性克隆，搖菌并提取其質(zhì)粒。
[0044]以含有Msc I和Xho I酶切位點(diǎn)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得β - 1，4 -葡萄糖苷酶基因序列，加A后連接到PMD? 19-Τ，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌內(nèi)。挑選陽性克隆搖菌并回收質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。若無誤，用Msc I和Xho I雙酶切該質(zhì)粒，回收β - 1,4 -葡萄糖苷酶DNA片段BG。相同內(nèi)切酶處理重組表達(dá)載體pET - 22b (+)并回收載體DNA片段。將BG與pET-22b(+)載體片段混合，T4 DNA Ligase過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過抗性平板和菌落PCR篩選含有重組表達(dá)載體pET - 22 - BG的陽性克隆。挑取陽性克隆，搖菌并提取其質(zhì)粒。
[0045]上述PCR擴(kuò)增條件為:98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，72°C延伸15s ；30個(gè)循環(huán)后72°C終延伸3min。
[0046]上述PCR 反應(yīng)使用的 DNA 聚合酶為 PrimeSTAR? Max DNA Polymerase (TaKaRa)。
[0047]3)重組共表達(dá)菌株的構(gòu)建:
[0048]將上述含有外切-β -1,4-葡聚糖酶和內(nèi)切-β - 1,4 -葡聚糖酶編碼基因的共表達(dá)載體pETDuet -EX-EN與含有β -1,4-葡萄糖苷酶編碼基因的表達(dá)載體pET - 22 - BG先后轉(zhuǎn)入TransB (DE3)大腸桿菌，并在含有氨節(jié)青霉素(50 μ g/mL)、氯霉素(25yg/mL)、卡那霉素(25 μ g/mL)和四環(huán)素(20 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基上抗性篩選，獲得可同時(shí)表達(dá)外切-β - 1，4 -葡聚糖酶、內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶的重組菌株。
[0049]上述的TransB (DE3)具有以下特征:具有卡那霉素(KanR)和四環(huán)素(TetR)抗性，此外，該菌株還包含突變的硫氧還蛋白還原酶(trxB)和谷胱甘肽還原酶(gor)基因，表達(dá)主要還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。
【權(quán)利要求】
1.一種纖維素代謝通路關(guān)鍵酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為通過全基因合成獲得的外切-β - 1,4 -葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶基因的重組過表達(dá)菌株； 所述的纖維素代謝通路關(guān)鍵酶是指灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD-1外切-β - 1，4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1，4-葡聚糖酶和β -1，4-葡萄糖苷酶，其中:外切-β - 1,4 -葡聚糖酶的核苷酸序列EXjB SEQ ID N0.1所示，內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶的核苷酸序列EN^ SEQ ID N0.2所示，β - 1，4 -葡萄糖苷酶的核苷酸序列BGjnSEQ ID N0.3 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌(Streptomycesgriseorubens) JSD -1,現(xiàn)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),保藏編號(hào)為CGMCC N0.5706，保藏日期為2012年I月9日。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的全基因合成是指:通過對(duì)灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)外切-β -1,4-葡聚糖酶、內(nèi)切-β -1,4-葡聚糖酶和β - 1，4 -葡萄糖苷酶基因序列進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)定表達(dá)宿主為E.coli Κ12，回避Nde 1、Nco I> BamH 1、Xho 1、Msc I和EcoR I酶切位點(diǎn)、同時(shí)避免序列中出現(xiàn)不依賴rho因子的轉(zhuǎn)錄終止子及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一所述的工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA經(jīng)過全基因合成構(gòu)建得到的pUC57 - EX、pUC57 - EN和pUC57 - BG載體為模板，分別與對(duì)應(yīng)含 有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)應(yīng)分別得到編碼外切-β - 1，4 -葡聚糖酶的核苷酸序列ΕΧ、編碼內(nèi)切-β - 1，4-葡聚糖酶的核苷酸序列EN和編碼β - 1,4 -葡萄糖苷酶的核苷酸序列BG ;然后將擴(kuò)增得到的序列EX和EN依次連接到共表達(dá)載體pACY⑶uet - 1、將擴(kuò)增得到的序列BG連接到重組表達(dá)載體pET - 22b (+)，最終得到重組共表達(dá)載體pETDuet -EX-EN和重組表達(dá)載體pET - 22 - BG ;之后將重組共表達(dá)載體pETDuet -EX-EN與重組表達(dá)載體pET - 22 - BG先后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株內(nèi)，獲得轉(zhuǎn)基因共表達(dá)菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點(diǎn)的引物包括:
EX - Nco 1- F:TACCATGGCTGCTGTTCCGTGCACCGTTGACTACA
EX - BamH I _ R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAGAAACCGGCGGGTAAGCG
EN -Nde 1- F:TACATATGGACACCACCCTGTGCGAAGAATTCGGT
EN - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCGGTACGGCAAGCGGTA
BG -Msc 1- F:GATGGCCATGGTGACCATCGACTACGCTGCTCTGC
BG - Xho 1- R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCAGCTTCACGAACACGT?
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，所述的PCR擴(kuò)增的條件為:98°C預(yù)變性3min ;98°C變性 10s，55。。退火 15s，72。。延伸 15s ；30 個(gè)循環(huán)后 72°C終延伸 3min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達(dá)菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
8.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的纖維素代謝通路關(guān)鍵酶的工程菌的應(yīng)用，其特征在于，將其用于外切-β - 1，4 -葡聚糖酶、內(nèi)切-β - 1，4 -葡聚糖酶和β - 1,4 -葡萄糖苷酶的體外高效表達(dá)，并最終實(shí)現(xiàn)纖維素的原位快速降解。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104178444SQ201410374224
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】周培, 馮?，|, 孫玉靜, 支月娥, 羅艷青 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)