基于氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法
【專利摘要】一種基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基于氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到氯化物過(guò)氧化物酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿菌表達(dá)載體pET‐22b(+)中得到含有氯化物過(guò)氧化物酶編碼基因的重組表達(dá)載體；再將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株，篩選得到氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的由于氯化物過(guò)氧化物酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)酶且表達(dá)量較低導(dǎo)致的應(yīng)用范圍和效果嚴(yán)重受限等不足，應(yīng)用基因工程手段實(shí)現(xiàn)其體外的大量表達(dá)合成并最終實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的快速降解。
【專利說(shuō)明】基于氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 木質(zhì)素是由四種醇單體（對(duì)香豆醇、松柏醇、5 -羥基松柏醇、芥子醇）形成的一種 復(fù)雜酚類聚合物。木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一，具有聯(lián)結(jié)強(qiáng)化細(xì)胞的作用。此外， 木質(zhì)素也是一種含許多負(fù)電集團(tuán)的多環(huán)高分子有機(jī)物，對(duì)土壤中的高價(jià)金屬離子有較強(qiáng)的 親和力。
[0003]根據(jù)單體的不同，可將木質(zhì)素分為3種類型：由紫丁香基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成 的紫丁香基木質(zhì)素 （S -木質(zhì)素），由愈創(chuàng)木基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的愈創(chuàng)木基木質(zhì)素 (G -木質(zhì)素）和由對(duì)-羥基苯基丙烷結(jié)構(gòu)單體聚合而成的對(duì)-羥基苯基木質(zhì)素 （H -木質(zhì) 素）。一般而言，木質(zhì)素在裸子植物主要存在類型為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G)，雙子葉植物主要 含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質(zhì)素 （G - S)，單子葉植物則為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對(duì)-羥基苯 基木質(zhì)素 （G - S - H)。從植物學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)，木質(zhì)素就是包圍于管胞、導(dǎo)管及木纖維等纖維束 細(xì)胞及厚壁細(xì)胞外的物質(zhì)；從化學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，木質(zhì)素是由高度取代的苯基丙烷單元隨機(jī)聚 合而成的高分子，它與纖維素、半纖維素一起，形成植物骨架的主要成分，在數(shù)量上僅次于 纖維素。木質(zhì)素填充于纖維素構(gòu)架中增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度，利于輸導(dǎo)組織的水分運(yùn)輸和 抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。
[0004] 木質(zhì)素單體同時(shí)含有多種活性官能團(tuán)，如羥基、羰基、羧基、甲基及其它側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。 其中羥基在木質(zhì)素中存在較多，以醇羥基和酚羥基兩種形式存在，而酚羥基的多少又直接 直接影響木質(zhì)素的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)，如能反映出木質(zhì)素的醚化和縮合程度，同時(shí)也能衡量 木質(zhì)素的溶解性能和反應(yīng)能力；在木質(zhì)素的側(cè)鏈上，有對(duì)羥基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、 對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸等酯型結(jié)構(gòu)存在，這些酯型結(jié)構(gòu)存在于側(cè)鏈的α位或 γ位。在側(cè)鏈 α位除了酯型結(jié)構(gòu)外，還有醚型連接，或作為聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的碳-碳聯(lián)結(jié)。同酚羥基一樣，木質(zhì) 素的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)也直接關(guān)系它的化學(xué)特性。
[0005]由于木質(zhì)素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，高分子量及高度疏水性，與纖維素與半纖維素相比，木 質(zhì)素的降解相對(duì)較難。已發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素降解酶主要有3類：木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidase)、猛過(guò)氧化物酶（Manganese peroxidase)和漆酶（Laccase)，此外，還有一些 輔助酶也參與木質(zhì)素的降解如氯化物過(guò)氧化物酶（Chloro - peroxidase)和芳基醇氧化酶 (Aryl alcohol oxidase)。灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)作為一種廣泛 存在于土壤的細(xì)菌，具有很強(qiáng)的木質(zhì)素降解能力并得到了研究者越來(lái)越多的關(guān)注。研究灰 略紅鏈霉菌降解木質(zhì)素的分子機(jī)制，克隆關(guān)鍵木質(zhì)素降解酶基因序列，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型木質(zhì) 素降解酶制劑進(jìn)而實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的快速降解具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種基于氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌及其 實(shí)現(xiàn)方法，通過(guò)本發(fā)明所述的方法能夠高效表達(dá)一種克隆自灰略紅鏈霉菌氯化物過(guò)氧化物 酶，可以克服氯化物過(guò)氧化物酶在原始菌株內(nèi)表達(dá)量較低等缺點(diǎn)，有助于解決肥料利用率 較低等問(wèn)題，此外對(duì)于實(shí)現(xiàn)土壤中銨鹽的快速轉(zhuǎn)化進(jìn)而培肥土壤，最終實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)具有 重大意義。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明涉及一種氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌，該工程菌為外源表達(dá)氯化物過(guò)氧化 物酶的大腸桿菌。
[0009] 所述的胞內(nèi)氯化物過(guò)氧化物酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD -1氯化物過(guò)氧化物酶大亞基基因 SG -CP，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列為825bp，編碼274個(gè)氨基酸。
[0010] 所述的氯化物過(guò)氧化物酶編碼基因通過(guò)全基因組測(cè)序和PCR擴(kuò)增的方式克隆獲 得。
[0011] 所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國(guó)普通 微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所郵編100101。
[0012] 本發(fā)明涉及上述工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到氯化物過(guò)氧化物酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿 菌表達(dá)載體PET - 22b (+)中得到含有氯化物過(guò)氧化物酶編碼基因的重組表達(dá)載體；再將重 組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株，篩選得到氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌。
[0013] 所述的含有酶切位點(diǎn)的引物包括：
[0014] CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC
[0015] CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA
[0016] 所述的PCR擴(kuò)增的條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個(gè) 循環(huán)后68°C終延伸3min。
[0017] 所述的大腸桿菌表達(dá)菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0018] 本發(fā)明涉及一種氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌的應(yīng)用，將其應(yīng)用于氯化物過(guò)氧化物 酶的體外高效表達(dá)，并最終實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的快速降解。 技術(shù)效果
[0019] 現(xiàn)有氯化物過(guò)氧化物酶在灰略紅鏈霉菌內(nèi)為胞內(nèi)酶且表達(dá)量很低，因此嚴(yán)重限制 了其使用范圍和效果；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種全新的氯化物過(guò)氧化物酶基因 序列；在特殊條件下（如高溫以及堿性）具有更穩(wěn)定的生物學(xué)活性；本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建外源 表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了氯化物過(guò)氧化物酶的體外過(guò)表達(dá)，并通過(guò)在表達(dá)重組蛋白C端添加聚組 氨酸標(biāo)簽的方法，維持蛋白活性的同時(shí)也最大程度的保證了蛋白純度。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為灰略紅鏈霉菌氯化物過(guò)氧化物酶信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖；
[0021] 圖2為灰略紅鏈霉菌氯化物過(guò)氧化物酶3D結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。 實(shí)施例1
[0023] 本實(shí)施例包括以下步驟：
[0024] 1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養(yǎng)
[0025] 灰略紅鏈霉菌分離自上海市浦江鎮(zhèn)收集的腐爛秸桿，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5706。 將該菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，32 °C培養(yǎng)48h。
[0026] 上述LB液體培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養(yǎng)基中加入15. 0 - 20. Og/L瓊脂即得LB固體培養(yǎng)基。
[0027] 2)基因組DNA提取
[0028] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶菌酶 (20mg/mL)和 20yL EDTA 溶液（0.5M，pH 8.0)，37°C 處理 45min，加入 4yL RNase A(100mg/ mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說(shuō)明完成 剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過(guò)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質(zhì)量，確保 無(wú)明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無(wú)降解、無(wú)污染。
[0029] 3)基因組測(cè)序：確定全基因組鳥(niǎo)槍法（WGS)策略，采用第二代測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建不同 插入片段長(zhǎng)度的文庫(kù)，采用Illumina Miseq(2X250bp)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。收集測(cè)序的原始數(shù) 據(jù)，對(duì)帶接頭、低質(zhì)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，隨后采用Newbler v2. 8對(duì)去除接頭的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行 從頭拼接，構(gòu)建contig及scaffold，最后使用GapCloser程序進(jìn)行缺口填補(bǔ)得到鏈霉菌基 因組草圖。
[0030] 4)蛋白編碼基因功能預(yù)測(cè)：采用Glimmer 3. 0軟件對(duì)全基因組序列進(jìn)行基因預(yù) 測(cè)?；蝾A(yù)測(cè)模型選取自我訓(xùn)練基因預(yù)測(cè)模型，即提取拼裝序列中最長(zhǎng)的序列，以該序列作 為基因預(yù)測(cè)模型訓(xùn)練的序列。然后以該序列構(gòu)建的基因預(yù)測(cè)模型，對(duì)所有序列進(jìn)行基因預(yù) 測(cè)，設(shè)定開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為ll〇bp，其余參數(shù)為Glimmer 3. 0的默認(rèn)設(shè)置。
[0031] 5)氯化物過(guò)氧化物酶膜定位預(yù)測(cè)：采用SignalP 4. 1分別對(duì)氯化物過(guò)氧化物酶氨 基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽模擬預(yù)測(cè)，如圖1所示。結(jié)果表明氯化物過(guò)氧化物酶不存在明顯的信 號(hào)肽序列，推測(cè)該酶為胞內(nèi)酶。
[0032] 6)氯化物過(guò)氧化物酶3D模型預(yù)測(cè)：運(yùn)用PHYRE 2在線程序?qū)β然镞^(guò)氧化物 酶的3D空間模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明氯化物過(guò)氧化物酶與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中已有蛋白模型 (c4d9jl)的最高相似度分別可達(dá)33%，預(yù)測(cè)結(jié)果具有100%可信度。如圖2所示，該氯化物 過(guò)氧化物酶C端（已注明）裸露在蛋白外面，判定此處為聚組氨酸（HIS 6 · Tag)的連接位 點(diǎn)。
[0033] 7)氯化物過(guò)氧化物酶核苷酸序列驗(yàn)證：根據(jù)全基因組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)PCR引物如 下：
[0034] CP - F:ATGCCGTTCGTCACCGCCGGCG
[0035] CP - R:TCAGCTCTCGATGAAGTCGAGCAGGTC
[0036] 以灰略紅鏈霉菌JSD -1基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳 檢測(cè)，結(jié)果表明片段約為800bp，將PCR產(chǎn)物切膠回收，使用DNA A - Tailing Kit(TaKaRa) 加 A后連接到T - Vector PMD? 19 - T (TaKaRa)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌，在氨 芐（50 μ g/mL)抗性平板挑選陽(yáng)性克隆，搖菌提取質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入片段與基因 組測(cè)序結(jié)果完全吻合，即為本發(fā)明序列表中的SEQ ID NO. 1。
[0037] 上述PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延伸 45s ;30個(gè)循環(huán)后68°C終延伸3min。
[0038] 上述 PCR 反應(yīng)使用的 DNA 聚合酶為 PrimeSTAR? GXL Polymerase (TaKaRa)。。 實(shí)施例2
[0039] 氯化物過(guò)氧化物酶表達(dá)載體構(gòu)建
[0040] 1)根據(jù)氯化物過(guò)氧化物酶序列，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，序列如下：
[0041] CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC
[0042] CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA
[0043] 2)以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有 Nco I和EcoR I酶切位點(diǎn)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得氯化物過(guò)氧化物酶基因序列，使用DNA A - Tailing Kit 加 A 后連接到 T - Vector PMD? 19 - T (TaKaRa)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 DH5 α 大腸桿菌內(nèi)。挑選陽(yáng)性克隆，搖菌提取質(zhì)粒測(cè)序。Nco I和EcoR I進(jìn)行雙酶切（37°C)，回 收氯化物過(guò)氧化物酶DNA片段CP。用相同內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體pET-22b (+)并回收載體 DNA片段。將CP與載體片段混合，T4DNALigase(TaKaRa)過(guò)夜連接（16°C )，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)抗性平板及菌落PCR篩選含有質(zhì)粒pET - 22 - CP的 陽(yáng)性克隆。挑取陽(yáng)性克隆接種于含有氨芐青霉素（50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm、 37 °C培養(yǎng)16小時(shí)后提取質(zhì)粒。
[0044] 上述PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸45s ;30個(gè)循環(huán) 后68°C終延伸3min。
[0045] 3)氯化物過(guò)氧化物酶過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株的構(gòu)建：
[0046] 將上述氯化物過(guò)氧化物酶表達(dá)載體pET - 22 - CP轉(zhuǎn)入Transetta(DE3)大腸桿菌， 并在含有氨芐青霉素（50 μ g/mL)和氯霉素（34 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基上篩選，獲得氯化 物過(guò)氧化物酶過(guò)表達(dá)菌株。
[0047] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA，可有效提高外源基 因，尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。
【權(quán)利要求】
1. 一種氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達(dá)氯化物過(guò)氧化 物酶的大腸桿菌； 所述的胞內(nèi)氯化物過(guò)氧化物酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1氯化物過(guò)氧化物酶大亞基基因 SG - CP,其核苷酸序列如SEQ ID No· 1所示,其氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列為825bp，編碼274個(gè)氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到氯化物過(guò)氧化物酶編碼基因； 然后將該基因插入大腸桿菌表達(dá)載體PET -22b (+)中得到含有氯化物過(guò)氧化物酶編碼基因 的重組表達(dá)載體；再將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株，篩選得到氯化物過(guò)氧化物酶 的工程菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點(diǎn)的引物包括： CP - Nco I - F:GCCATGGTGCCGTTCGTCACCGCCGGCGAC CP - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCTCTCGATGAAGTCGAGCA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴(kuò)增的條件為：98°C預(yù)變性 311^11;98°(：變性1〇3,681：延伸453;30個(gè)循環(huán)后68°(：終延伸31^11。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達(dá)菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種含有上述任一權(quán)利要求所述的氯化物過(guò)氧化物酶的工程菌及其應(yīng)用，其特征在 于，將其用于氯化物過(guò)氧化物酶的體外高效表達(dá)，并最終實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的快速降解。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK104152391SQ201410374652
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】周培, 馮海瑋, 孫玉靜, 支月娥, 羅艷青 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)