一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽粕多肽及其酶解制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的漢麻籽粕多肽的酶解制備方法，包括：將漢麻籽粕干燥，粉粹成粉末，加入水均勻攪拌，pH調(diào)至8.0~10.5，溫度調(diào)至30~80℃，勻速攪拌0.5h~2h，離心，上清液pH調(diào)至3~6，得蛋白沉淀；將蛋白加水溶解，比例為2~7g：100mL，pH調(diào)至7.0~9.5，再加入堿性蛋白酶，蛋白重量與該酶酶活之比0.1~5：1000，溫度50~75℃，時(shí)間1~4h；將酶解液通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂和葡聚糖凝膠柱分離純化，收集干燥，得α-葡萄糖苷酶抑制活性肽粉。本發(fā)明為α-葡萄糖苷酶抑制活性物質(zhì)增加了新來(lái)源，實(shí)現(xiàn)了原料的充分利用，具有產(chǎn)品活性高、制備過(guò)程方便可行、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種具有抑制Cl -葡萄糖苷酶活性的漢麻籽粕多肽及其酶解制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物肽及其制備方法與應(yīng)用，具體涉及一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽及其酶解制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]漢麻，又稱(chēng)火麻，在人類(lèi)歷史發(fā)展上發(fā)揮著重要的作用，是制造紙張、服裝、繩索等的重要原料。漢麻籽是漢麻加工后的重要副產(chǎn)物，也是一種珍貴的藥食同源物質(zhì)，含有豐富的蛋白質(zhì)、卵磷脂、亞麻酸、維生素以及鈣、鐵等人體必需的礦物質(zhì)元素，是營(yíng)養(yǎng)的重要來(lái)源；對(duì)便秘、高血脂、高血壓、糖尿病及腸胃病等均有良好的預(yù)防作用，是長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)——巴馬縣一一百歲老人長(zhǎng)期食用的“天然保健品”。
[0003]目前，我國(guó)大部分漢麻產(chǎn)區(qū)將漢麻籽作為油料，僅用于提取漢麻籽油，而含有豐富蛋白質(zhì)、氨基酸的漢麻籽柏則被廢棄為飼料和肥料，從而導(dǎo)致漢麻籽資源的浪費(fèi)，漢麻籽柏沒(méi)有得到充分利用。本發(fā)明采用可控酶解的方法，通過(guò)生物蛋白酶對(duì)漢麻籽柏蛋白進(jìn)行酶解催化作用，有可能把其中所隱藏的抑制α-葡萄糖苷酶活性肽片段釋放出來(lái)，從而制備具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽。漢麻作為一種天然產(chǎn)物植物來(lái)源，來(lái)源廣泛，如能提取出較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽來(lái)降低部分人群體內(nèi)的血糖含量，對(duì)于漢麻籽柏的廢物利用以及豐富降血糖多肽資源、防治糖尿病及并發(fā)癥具有廣闊的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種具有抑制α -葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽及其酶解制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明方法能夠?qū)崿F(xiàn)原料的高效利用，具有高活性、高安全、簡(jiǎn)單可控、環(huán)境溫和的制備特點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明的目的由以下方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種具有抑制α -葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，包括如下步驟:
[0007](I)取漢麻籽柏干燥至含水量3%以下，粉碎成細(xì)粉；
[0008](2)干粉與水的比例為5~20g:100mL，將漢麻籽柏溶液pH調(diào)至8.0~10.5，溫度調(diào)至30~80°C，以100~300r/min的速度均勻攪拌0.5h~2h加速溶解，然后取上清液。將上清液PH調(diào)至3~6，離心，將沉淀冷凍干燥，制得漢麻籽柏蛋白。
[0009](3)將漢麻籽柏蛋白加水溶解，漢麻籽柏蛋白與水的比例為2~7g:100mL，控制pH值在7.5~9.5，再加入堿性蛋白酶為生物催化劑，蛋白酶與全蝎蛋白重量之比:0.1~5:1000,反應(yīng)溫度為50~75°C，以100~300r/min勻速攪拌I~4h ;煮沸1min，滅酶活，結(jié)束反應(yīng)。10000r/min離心,收集上清液,干燥,得到粗多肽粉末。
[0010](4)大孔吸附樹(shù)脂裝柱:根據(jù)層析柱體積稱(chēng)取適量填料DA201-C進(jìn)行預(yù)處理，反復(fù)傾倒上清液除去懸浮破碎顆粒，將填料加入層析柱，層析柱規(guī)格2.6 X 30cm，待穩(wěn)定后，用3倍柱體積去離子水洗脫液(條件與洗脫時(shí)的相同)沖柱。
[0011](5)多肽粉加水溶解，倒入DA201-C大孔吸附樹(shù)脂交換柱，以O(shè)~100%不同濃度乙醇溶液梯度洗脫，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)分別收集洗脫液，目的在于將粗多肽分離純化，去除色素及其它雜質(zhì)，富集75%乙醇洗脫下來(lái)小肽組分，干燥得到多肽粉末。
[0012](6)葡聚糖凝膠裝柱:根據(jù)層析柱體積稱(chēng)取適量填料S^hadex G_15進(jìn)行預(yù)處理，反復(fù)傾倒上清液除去懸浮破碎顆粒，將填料加入層析柱，層析柱規(guī)格1.5X80cm,待穩(wěn)定后，用3倍柱體積去離子水洗脫液(條件與洗脫時(shí)的相同)沖柱。
[0013](7)多肽粉加水溶解，倒入Sephadex G_15葡聚糖凝膠柱，以去離子水洗脫，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)分別收集洗脫液，目的在于將粗多肽進(jìn)一步分離純化，去除低活性肽，富集高活性的小肽組分，濃縮，干燥，得漢麻籽柏多肽粉末。
[0014](8)漢麻籽柏多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性指標(biāo)評(píng)價(jià)。采用α-葡萄糖苷酶抑制活性對(duì)多肽的降血糖進(jìn)行體外活性評(píng)價(jià)。
[0015]優(yōu)選地,所述的漢麻品種為漢麻Cannabis sativa L.。
[0016]優(yōu)選地，所述堿性蛋白酶為Alcalase2.4L，酶的活力為393235U/g。
[0017]優(yōu)選地，步驟(2)和步驟(3)中所述pH調(diào)至8.0~10.5，控制pH值在7.5~9.5具體為:用0.1~2.0mol/L的氫氧化鈉(NaOH)溶液將pH調(diào)至所需pH值；所述將pH調(diào)至3~6，具體為:用0.1~2.0mol/L的鹽酸(HCl)溶液將pH調(diào)至所需值。
[0018]優(yōu)選地，漢麻籽柏蛋白重量與堿性蛋白酶酶活之比0.1~5:1000，優(yōu)選0.2~4:1000。
[0019]優(yōu)選地，步驟(5)中所述的以O(shè)~100%不同濃度乙醇溶液梯度洗脫，具體為0% ,25% ,50% ,75% , 100%乙醇，所述富集為大孔吸附樹(shù)脂交換柱中的75%乙醇洗脫組分。
[0020]優(yōu)選地，步驟(7)中所述的富集高活性的小肽組分為第四洗脫組分。
[0021]一種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽，所述漢麻多肽的分子量范圍為< 100Da0
[0022]一種具有α -葡萄糖苷酶抑制活性的漢麻多肽應(yīng)用于制備具有降血糖、預(yù)防糖尿病功效的功能性食品，所述功能性食品為粉劑、片劑、口服液或膠囊。
[0023]本發(fā)明的原理:在堿性條件下，以水解酶為催化劑，使?jié)h麻籽柏蛋白進(jìn)行水解，將酶解液進(jìn)行分離純化，Wa-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)，制備得到漢麻籽活性多肽。
[0024]漢麻柏多肽產(chǎn)品以口服的形式進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)人體消化酶:胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶解消化，在小腸被吸收利用，發(fā)揮功效。
[0025]本發(fā)明所制備的漢麻酶解多肽液，可直接噴霧干燥，制成降血糖多肽粉，也可加入乳糖、甘露醇等，混合均勻，分裝，冷凍干燥，制成凍干粉劑、片劑，也可制成口服液方便人體快速吸收，還可制成膠囊，直接透過(guò)胃消化液進(jìn)入小腸，更好的保護(hù)多肽的活性，發(fā)揮高功效。
[0026]與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0027]1.本發(fā)明提高了漢麻籽柏的生物活性利用率。選定簡(jiǎn)便可控的Alcalase 2.4L堿性蛋白酶，將漢麻蛋白進(jìn)行酶解利用。蛋白質(zhì)中肽鏈打開(kāi)，獲得小分子活性多肽。此蛋白酶相比于傳統(tǒng)的催化用酶，具有高效的酶解能力，在較短時(shí)間內(nèi)即可完成對(duì)底物蛋白的高度水解，方便針對(duì)任一水解段地目標(biāo)多肽進(jìn)行分離篩選，可控性高，相比傳統(tǒng)的直接口服，水煮提藥、醇提給藥等提取方法更為高效，所得產(chǎn)品主要成分為多肽類(lèi)，成分簡(jiǎn)單，安全可靠，能高效被人體吸收。
[0028]2.產(chǎn)品的活性高。本發(fā)明采用酶解法得到高α-葡萄糖苷酶抑制活性的酶解物，再通過(guò)分離純化得到具有更高活性的多肽類(lèi)，見(jiàn)表1和圖1，2。當(dāng)經(jīng)過(guò)凝膠Sephadex G_15分離純化后，所得多肽活性達(dá)到IC5tl:0.llmg/mL，高于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的IC5tl值1.1Omg/mL。
[0029]3.多肽為小分子肽類(lèi)，分子量小于lOOODa，見(jiàn)圖3。進(jìn)入人體被吸收后，可以直接穿過(guò)小腸壁進(jìn)入血液高效發(fā)揮作用，穩(wěn)定性高。
[0030]4.用途明確，可作為降血糖、防治糖尿病的原料，輔以乳糖、甘露醇等，制成粉劑、片劑、膠囊或口服液。目前尚未發(fā)現(xiàn)有漢麻柏蛋白多肽應(yīng)用于降血糖功能性食品的報(bào)道。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為采用堿性蛋白酶對(duì)漢麻柏蛋白酶解所得不同水解度酶解物的活性比較；
[0032]圖2為酶解產(chǎn)物過(guò)凝膠S印hadex G_15分離柱的分離峰圖。
[0033]圖3為經(jīng)凝膠Sephadex G_15分尚出的第四個(gè)組分的分子量分布圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0035]以下實(shí)施例中過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱前，交換柱的處理步驟為稱(chēng)取填料DA201-C進(jìn)行預(yù)處理，先用80%乙醇浸泡洗滌三次，去除上清液；再用蒸餾水同樣浸泡洗滌三次，反復(fù)傾倒上清液除去懸浮破碎顆粒,將填料加入層析柱,層析柱規(guī)格2.6 X 30cm,待穩(wěn)定后，用3倍柱體積去離子水洗脫液沖柱，流速控制在1.0mL/min。
[0036]過(guò)葡聚糖凝膠S ephadex G_15柱前,葡聚糖凝膠Sephadex G_15柱的處理步驟為:稱(chēng)取填料Sephadex G_15進(jìn)行預(yù)處理,反復(fù)傾倒上清液除去懸浮破碎顆粒,將填料加入層析柱，層析柱規(guī)格1.5X80cm，待穩(wěn)定后，用3倍柱體積去離子水洗脫液沖柱，流速控制在0.3mL/min。
[0037]實(shí)施例1
[0038]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為5g:1OOmL, pH調(diào)至10，溫度調(diào)至50°C，以200r/min的速度均勻攪拌2h，取上清液，再將pH調(diào)至4，得到蛋白沉淀，將其pH調(diào)至6.5，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為7g:1OOmL,控制pH值在8.0,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比0.5:1000，反應(yīng)溫度為55°C，攪拌速度為100r/min，反應(yīng)時(shí)間3.5h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以0，25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.53mg/mL的降血糖多肽粉。
[0039]實(shí)施例2
[0040]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為10g:100mL，pH調(diào)至9.5，溫度調(diào)至40°C,以250r/min的速度均勻攪拌1.5h，取上清液，再將pH調(diào)至4.5，最后得到蛋白沉淀，將其PH調(diào)至7.0，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為5g:1OOmL,控制pH值在8.5,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比2:1000，反應(yīng)溫度為65°C，攪拌速度為150r/min，反應(yīng)時(shí)間4h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè), 25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.36mg/mL的降血糖多肽粉。
[0041]實(shí)施例3
[0042]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為15g: 100mL，pH調(diào)至10，溫度調(diào)至55°C，以lOOr/min的速度均勻攪拌lh，取上清液，再將pH調(diào)至4.0，最后得到蛋白沉淀，將其pH調(diào)至6.8，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為4g: 10mL,控制pH值在8.5,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥),蛋白重量與該酶酶活之比0.1~5:1000,反應(yīng)溫度為50~75°C，攪拌速度為200r/min，反應(yīng)時(shí)間4h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè)，25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α-葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.llmg/mL的降血糖多肽粉。
[0043]實(shí)施例4
[0044]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為20g:100mL，pH調(diào)至10.5，溫度調(diào)至40°C，以200r/min的速度均勻攪拌1.5h，取上清液，再將pH調(diào)至4.5，最后得到蛋白沉淀，將其PH調(diào)至6.5，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為4g:1OOmL,控制pH值在8.8,再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比0.3:1000,反應(yīng)溫度為55°C，攪拌速度為250r/min，反應(yīng)時(shí)間3.8h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè)，25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.26mg/mL的降血糖多肽粉。
[0045]實(shí)施例5
[0046]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為5g:1OOmL, pH調(diào)至10，溫度調(diào)至45°C，以150r/min的速度均勻攪拌1.5h，取上清液，再將pH調(diào)至4.2，最后得到蛋白沉淀，將其pH調(diào)至7.0，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為6g:1OOmL,控制pH值在8.5,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比1:1000，反應(yīng)溫度為65°C，攪拌速度為200r/min，反應(yīng)時(shí)間3.6h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè), 25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.42mg/mL的降血糖多肽粉。
[0047]實(shí)施例6
[0048]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為8g:1OOmL, pH調(diào)至9.5，溫度調(diào)至55°C，以200r/min的速度均勻攪拌1.5h，取上清液，再將pH調(diào)至4.2，最后得到蛋白沉淀，將其pH調(diào)至6.8，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為4g:1OOmL,控制pH值在8.6,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比3.5:1000，反應(yīng)溫度為60°C，攪拌速度為220r/min，反應(yīng)時(shí)間3.8h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè)，25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.25mg/mL的降血糖多肽粉。
[0049]實(shí)施例7
[0050]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為15g: 100mL，pH調(diào)至10，溫度調(diào)至35°C，以120r/min的速度均勻攪拌2h，取上清液，再將pH調(diào)至4，最后得到蛋白沉淀，將其pH調(diào)至7.0，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為3.5g:1OOmL,控制pH值在8.2,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比2:1000，反應(yīng)溫度為55°C，攪拌速度為180r/min，反應(yīng)時(shí)間3.7h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè), 25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.56mg/mL的降血糖多肽粉。
[0051]實(shí)施例8
[0052]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為20g:100mL，pH調(diào)至9.2，溫度調(diào)至45°C,以200r/min的速度均勻攪拌1.5h，取上清液，再將pH調(diào)至4.6，最后得到蛋白沉淀，將其PH調(diào)至6.8，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為
3.5g: 10mL,控制pH值在9.0,再加入Alcalase2.4L蛋白酶(Novozymes公司,丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比3.5:1000,反應(yīng)溫度為60°C，攪拌速度為200r/min，反應(yīng)時(shí)間3.9h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè)，25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.68mg/mL的降血糖多肽粉。
[0053]實(shí)施例9
[0054]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為10g:100mL，pH調(diào)至9.0，溫度調(diào)至40°C，以250r/min的速度均勻攪拌lh，取上清液，再將pH調(diào)至4.6，最后得到蛋白沉淀，將其pH調(diào)至7.0，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為4g:10mL,控制pH值在8.0,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比4:1000，反應(yīng)溫度為60°C，攪拌速度為100r/min，反應(yīng)時(shí)間3.5h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè), 25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75 %乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.45mg/mL的降血糖多肽粉。
[0055]實(shí)施例10
[0056]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為16g: 100mL，pH調(diào)至10，溫度調(diào)至50°C，以120r/min的速度均勻攪拌1.5h，取上清液，再將pH調(diào)至4.2，最后得到蛋白沉淀，將其pH調(diào)至6.8，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為5g:1OOmL,控制pH值在8.6,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比2.5:1000，反應(yīng)溫度為55°C，攪拌速度為200r/min，反應(yīng)時(shí)間4h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè), 25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.22mg/mL的降血糖多肽粉。
[0057]實(shí)施例11
[0058]取500g漢麻籽柏干粉，干粉與水的比例為10g:100mL，pH調(diào)至9.0，溫度調(diào)至40°C,以200r/min的速度均勻攪拌1.6h，取上清液，再將pH調(diào)至4.2，最后得到蛋白沉淀，將其pH調(diào)至6.8，干燥，制得漢麻籽柏蛋白。將此蛋白加入水中溶解，蛋白與水的比例為4g:10mL,控制pH值在8.2,再加入Alcalase 2.4L蛋白酶(Novozymes公司，丹麥)，蛋白重量與該酶酶活之比2.5:1000，反應(yīng)溫度為55°C，攪拌速度為150r/min，反應(yīng)時(shí)間3.6h。煮沸l(wèi)Omin，將酶解液過(guò)大孔吸附樹(shù)脂交換柱(DA201-C)，從純凈水開(kāi)始逐漸增大乙醇濃度，以O(shè)，25，50，75，100%不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，流速控制在1.0mL/min，在波長(zhǎng)214nm處測(cè)定吸光度，以吸收峰來(lái)收集75%乙醇洗脫組分洗脫液，再經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S^hadex G_15柱，收集第四洗脫組分，冷凍干燥得α -葡萄糖苷酶抑制活性為IC5tl:0.32mg/mL的降血糖多肽粉。
[0059]實(shí)施例12
[0060]本發(fā)明采用體外α -葡萄糖苷酶抑制活性指標(biāo)對(duì)活性成分的降血糖效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)方法如下:(以下的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性試驗(yàn)所用到的漢麻籽柏多肽是用實(shí)施例8所制備得到的產(chǎn)物進(jìn)行試驗(yàn)的)
[0061]1.材料:PNPG(4_硝基酚-α-D-批喃葡萄糖苷)、α-葡萄糖苷酶，阿卡波糖，均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。
[0062]2.步驟:本檢測(cè)在96微孔板上進(jìn)行。微孔板上加112 μ L磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)，再加入0.2U/mL α -葡萄糖苷酶溶液20 μ L，8 μ L樣品溶液，混勻，然后37°C恒溫15min，加入20 μ L 2.5mmol/L PNPG，混勻后再37°C恒溫反應(yīng)15min。最后加入0.2mol/L的Na2CO3溶液80 μ L，于405nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD)，計(jì)算公式為:

【權(quán)利要求】
1.一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)取漢麻籽柏干燥，粉碎成細(xì)粉；加水溶解，干粉與水的比例為5~20g:100mL, pH調(diào)至8.0-10.5，溫度調(diào)至3(T80°C，以10(T300r/min的速度均勻攪拌0.5h~2h以加速溶解，取上清液調(diào)PH至3飛，離心，將沉淀冷凍干燥，制得漢麻籽柏蛋白； (2)將漢麻籽柏蛋白加水溶解，比例為2~7g..100 mL，控制pH值在7.5^9.5，再加入堿性蛋白酶為生物催化劑，反應(yīng)溫度為5(T75°C，以10(T300 r/min勻速攪拌I~4h ;煮沸l(wèi)Omin，滅酶活，結(jié)束反應(yīng)；10000r/min離心，收集上清液，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂和葡聚糖凝膠，以水洗脫，收集洗脫液，富集洗脫下來(lái)的高活性多肽組分，濃縮，干燥，得漢麻籽柏多肽粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，其特征在于:所述的漢麻品種為漢麻CazwaAi1S sativa L.。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，其特征在于:所述取漢麻籽柏干燥中干燥具體為:干燥至漢麻籽柏的含水量小于3%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，其特征在于:所述堿性蛋白酶為Alcalase2.4L，酶的活力為393235 U/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，其特征在于:制備過(guò)程中，用lmol/L的氫氧化鈉(NaOH)溶液將pH調(diào)至8.(Tl0.5，用lmol/L的鹽酸(HCl)溶 液將pH調(diào)至3飛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，其特征在于:漢麻籽柏蛋白重量與堿性蛋白酶酶活之比0.1~5:1000ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，其特征在于:分離純化所用大孔吸附樹(shù)脂類(lèi)型為DA201-C，將75%乙醇洗脫組分收集，冷凍干燥；所述過(guò)大孔吸附樹(shù)脂具體為:將上清液倒入DA201-C大孔吸附樹(shù)脂交換柱，以0-100%不同濃度乙醇溶液梯度洗脫，在波長(zhǎng)214 nm處測(cè)定吸光度，富集75%乙醇洗脫下來(lái)小肽組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽的酶解制備方法，其特征在于:分離純化所用葡聚糖凝膠類(lèi)型為Sephadex G_15，收集第4洗脫組分，冷凍干燥。
9.由權(quán)利要求1-8所述制備方法制備得到一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽，其特征在于，所述漢麻多肽的分子量范圍為< 1000 Da。
10.權(quán)利要求9所述的一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的漢麻籽柏多肽應(yīng)用于制備具有α-葡萄糖苷酶抑制活性功效的降血糖功能性食品，所述功能性食品為粉劑、片劑、口服液或膠囊。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104131059SQ201410374772
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】吳暉, 任堯, 梁凱 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)