一種土壤或沉積物樣品的微生物采集方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種低生物量環(huán)境中土壤或沉積物微生物的采集與保存方法，包含以下步驟：在除菌處理過的堿性高滲透壓緩沖液中加入土壤或沉積物樣品，攪拌均勻后靜置，收集上層液體；在上層液體中加入土壤或沉積物樣品，攪拌均勻后靜置，收集上層液體；重復(fù)步驟2；最后將所得上層液體密封后常溫保存。本發(fā)明所述方法通過野外現(xiàn)場震蕩攪拌方法收集微生物細(xì)胞，操作步驟簡單，可在短時(shí)間收集大量微生物細(xì)胞，并在常溫下保存與運(yùn)輸樣品，適用于沙漠、戈壁、凍土區(qū)、海洋等微生物量低的環(huán)境中土壤或沉積物微生物的采集與保存。
【專利說明】一種土壤或沉積物樣品的微生物采集方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種低微生物量的土壤或沉積物樣品的微生物采集方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前用于分子生物學(xué)分析的微生物樣品采集和保存方法主要是現(xiàn)場采集后迅速低溫冷凍，即在野外現(xiàn)場取一定量土壤或沉積物樣品密封后，使用冰箱、液氮或干冰等方法冷凍保存，運(yùn)輸過程全程需保持低溫冷凍狀態(tài)。該方法存在以下問題:
[0003]I)對(duì)溫度要求嚴(yán)格。低溫冷凍保存必須保證樣品從采集到運(yùn)輸過程，均需要嚴(yán)格保證低溫過程，而在野外施工時(shí)常常難以保證低溫。
[0004]2)運(yùn)輸困難。使用冰箱、干冰或液氮保存的冷凍樣品，從野外運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室的過程，實(shí)現(xiàn)起來比較困難。
[0005]3)低生物量樣品難以操作。在沙漠、戈壁灘、凍土區(qū)、海洋等微生物含量比較低的極端環(huán)境使用時(shí)，需要采集大量樣品進(jìn)行冷凍保存，才能保證微生物量能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，這對(duì)樣品的采集和保存運(yùn)輸均提出了較高的要求。
[0006]鑒于低溫冷凍方法存在的弊端，開發(fā)一種簡潔有效的樣品采集與保存方法對(duì)于低微生物量的土壤或沉積物樣品的后續(xù)分子生物學(xué)分析尤為重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有冷凍保存的弊端，為低微生物量的野外現(xiàn)場土壤或沉積物樣品提供一種新的微生物采集方法。
[0008]本發(fā)明提供的土壤或沉積物樣品的微生物采集方法，包含以下步驟:
[0009]I)在除菌處理過的堿性高滲透壓緩沖液中加入土壤或沉積物樣品，攪拌均勻后靜置，收集上層液體；
[0010]2)在上層液體中加入同樣的土壤或沉積物樣品，攪拌均勻后靜置，收集上層液體；
[0011]3)重復(fù)步驟2;
[0012]4)將所得上層液體密封后常溫保存。
[0013]作為優(yōu)選，所述步驟I)中堿性高滲透壓緩沖液為pH為8.0-10.0的高滲緩沖液。
[0014]更優(yōu)選地,所述高滲緩沖液為鹿糖緩沖液。
[0015]作為優(yōu)選，所述除菌處理為用孔徑為0.2um的水系微孔濾膜處理。
[0016]作為優(yōu)選，所述蔗糖緩沖液成分為:10-50mmol/L EDTA, 100_500m mol/L NaCl,
0.5-2Μ 蔗糖，20-100m mol/L Tris-HCl0
[0017]作為優(yōu)選，步驟3)所述重復(fù)為至少重復(fù)3次。
[0018]作為優(yōu)選，步驟I)與步驟2)液體體積與樣品重量以ml/g計(jì)為(20-50):1。
[0019]作為優(yōu)選，所述步驟4)重復(fù)至少3次。
[0020]試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用本發(fā)明所述方法采集樣品提取的DNA濃度比常規(guī)冷凍方法提取的DNA濃度高；通過PCR擴(kuò)增進(jìn)一步確認(rèn)本發(fā)明所用方法保存的DNA的有效性，擴(kuò)增產(chǎn)物使用濃度為1.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效率，結(jié)果顯示，使用本發(fā)明所述方法采集保存的DNA，用于PCR擴(kuò)增時(shí)，可獲得更為高效的擴(kuò)增結(jié)果。以上結(jié)果說明，本發(fā)明所述方法作為常規(guī)冷凍保存方法的替代方法，適用于沙漠、戈壁、凍土區(qū)、海洋等微生物量低的環(huán)境中土壤或沉積物分子生物學(xué)樣品的采集與保存。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為低微生物量的樣品細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。M為分子量Marker，泳道1-6為本發(fā)明所述保存方法提取的DNA，泳道7-12為常規(guī)冷凍保存方法提取的DNA。
[0022]圖2為低微生物量的樣品細(xì)胞DNA使用16S rDNA引物349F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后的瓊脂糖凝膠電泳圖。M為分子量Marker，泳道1_10為常規(guī)冷凍樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道11-20為本發(fā)明所述方法保存樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明公開了一種低微生物量的分子生物學(xué)樣品采集與保存方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0024]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0025]實(shí)施例1:
[0026]所涉及區(qū)域是青藏高原一塊高海拔草甸區(qū)，該地區(qū)屬于永久凍土帶，地表有少量植被，微生物量低，土壤樣品中含有大量石塊。要在該地區(qū)開展天然氣水合物等勘探，研究微生物多樣性，需要布設(shè)大規(guī)模測線或測網(wǎng)，需要采集大量地表土壤樣品。使用常規(guī)方法采樣，因微生物量低，每個(gè)站點(diǎn)需采集大量樣品，既耗時(shí)又難以運(yùn)輸，且高海拔野外地區(qū)難以實(shí)現(xiàn)樣品快速冷凍。
[0027]本發(fā)明所述低微生物量的樣品采集與保存方法具體實(shí)施步驟如下:
[0028]1.根據(jù)實(shí)際勘探情況，在工作區(qū)選取已布設(shè)的測線2條，樣品采集間距為250m，采樣深度為20cm。
[0029]2.每個(gè)采樣點(diǎn)按照常規(guī)方法采集兩份相同樣品，一份用于冷凍保存，一份用于本發(fā)明所述方法保存。所有樣品使用20目樣品篩過篩處理。
[0030]3.配制蔗糖緩沖液，其成分為:10-50mmol/L EDTA, 100-500mmol/L NaCl, 0.5-2M蔗糖，20-100m mol/L Tris_HCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH值；使用微孔濾膜過濾除菌；取一定體積上述過濾除菌的緩沖液倒入燒杯中，加入一定質(zhì)量土壤(或沉積物)樣品，劇烈震蕩或攪拌，之后自然沉淀；重復(fù)收集細(xì)胞:將上步驟中的上層液體轉(zhuǎn)出，再次加入一定質(zhì)量土壤(或沉積物)樣品，劇烈震蕩或攪拌，自然沉淀。此過程根據(jù)實(shí)際情況至少重復(fù)3次；上述收集細(xì)胞時(shí)所加入緩沖液與樣品(或沉積物)的比例為(20-50)ml/g，震蕩或攪拌時(shí)間不少于5min，使樣品中的細(xì)胞充分懸浮，沉淀過程不少于3min，使土壤(或沉積物)樣品盡可能沉淀。若樣品中含有較多石塊、草根等雜物，需使用20目以上樣品篩過篩處理，樣品篩使用前用酒精灼燒滅菌。
[0031]4.冷凍樣品按照常規(guī)方法_20°C冷凍，干冰運(yùn)輸，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)-20°C冰箱冷凍保存，化學(xué)試劑保存樣品常溫運(yùn)輸，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)室溫保存。保存周期均為30天。
[0032]實(shí)施例2:本發(fā)明所述方法與常規(guī)冷凍方法對(duì)比
[0033]實(shí)驗(yàn)室采用相同方法取兩種樣品提取DNA，提取參考專利號(hào):ZL201010536640.6所提及的方法?；静僮魅缦?
[0034]取一定量樣品放入提取緩沖液，加入蛋白酶K和溶菌酶，37°C震蕩，之后加入SDS65°C水浴，充分裂解細(xì)胞釋放DNA，離心取上清得到DNA裂解液。加入聚乙二醇4°C沉淀DNA,離心收集DNA。
[0035]為保證兩種提取方法所用樣品量一致，操作如下:冷凍樣品秤取lg。本發(fā)明使用方法采樣時(shí)收集土壤樣品20g，最后所有上層液體保存于10ml離心管中，提取DNA時(shí)，液體充分震蕩混勻后，取5ml液體(相當(dāng)于Ig 土壤樣品)。
[0036]取提取的DNA使用濃度為0.8% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)比兩種方法提取的DNA片段長度，以檢測本發(fā)明保存方法的有效性。冷凍樣品和化學(xué)試劑保存樣品DNA如圖1所示，圖1展示的是兩種保存方式保存的樣品DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，其中1-6為本發(fā)明所述方法保存的DNA，泳道7-12為常規(guī)冷凍保存方法提取的DNA，泳道1、7為同一個(gè)采樣點(diǎn)樣品，以此類推。電泳上樣量均為10ul。結(jié)果顯示，使用本專利所述方法采集樣品提取的DNA濃度比常規(guī)冷凍方法提取的DNA濃度高。具體分析原因如下:一方面本發(fā)明使用的高滲蔗糖緩沖液可以在保存過程中裂解細(xì)胞，釋放DNA，另一方面堿性緩沖環(huán)境可以保護(hù)DNA，防止降解。
[0037]取本發(fā)明所述方法提取DNA溶液稀釋10倍，使用引物349F(5/ -AGGCAGCAGTDRGGAAT-3')和 806R(5' -GGACTACYVGGGTATCTAAT-3')進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。該對(duì)引物可用于擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列，適用于微生物多樣性研究。
[0038]通過PCR擴(kuò)增進(jìn)一步對(duì)比確認(rèn)該發(fā)明所用方法保存的DNA的有效性。擴(kuò)增產(chǎn)物使用濃度為1.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效率。
[0039]冷凍樣品和本發(fā)明所述方法保存樣品PCR擴(kuò)增后凝膠電泳圖如圖2所示，圖2顯示兩種保存樣品方法提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果，電泳上樣量均為5ul，其中1-10為常規(guī)冷凍保存方法提取的DNA，泳道11-20為本發(fā)明所述方法保存的DNA，泳道1、11為同一個(gè)采樣點(diǎn)樣品，以此類推。結(jié)果顯示，使用本發(fā)明所述方法采集保存的DNA，用于PCR擴(kuò)增時(shí)，可獲得更為高效的擴(kuò)增結(jié)果。分析原因?yàn)槭褂镁彌_液震蕩懸浮細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞與土壤(或沉積物)中的雜質(zhì)如多糖、蛋白等盡可能分離，獲得雜質(zhì)較少的微生物細(xì)胞懸濁液，在提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，可有效降低雜質(zhì)的影響。
[0040]對(duì)比圖1及圖2的結(jié)果，說明本發(fā)明所采用的細(xì)胞收集和化學(xué)試劑保存方法，可用于分子生物學(xué)樣品的野外采集。本發(fā)明所采用的細(xì)胞收集和常溫化學(xué)試劑保存方法，能有效解決該種環(huán)境中的樣品采集與保存問題。
[0041]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種土壤或沉積物樣品的微生物采集方法，其特征在于，包含以下步驟: 1)在除菌處理過的堿性高滲透壓緩沖液中加入土壤或沉積物樣品，攪拌均勻后靜置，收集上層液體； 2)在上層液體中加入同樣的土壤或沉積物樣品，攪拌均勻后靜置，收集上層液體； 3)重復(fù)步驟2； 4)將所得上層液體密封后常溫保存。
2.如權(quán)利要求1中所述的微生物采集方法，其特征在于，所述的步驟I)中堿性高滲透壓緩沖液為PH為8.0-10.0的高滲緩沖液。
3.如權(quán)利要求2中所述的微生物采集方法，其特征在于，所述高滲緩沖液為蔗糖緩沖液。
4.如權(quán)利要求1中所述微生物采集方法，其特征在于，所述除菌處理為用孔徑為0.2um的水系微孔濾膜處理。
5.如權(quán)利要求3中所述微生物采集方法，其特征在于，所述蔗糖緩沖液成分為:10-50mmol/L EDTA, 100_500m mol/L NaCl, 0.5-2M 蔗糖，20_100m mol/L Tris-HCl0
6.如權(quán)利要求1所述微生物采集方法，其特征在于，步驟3)所述重復(fù)為至少重復(fù)3次。
7.如權(quán)利要求1所述微生物采集方法，其特征在于，步驟I)與步驟2)液體體積與樣品重量以ml/g計(jì)為(20-50):1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/24GK104232738SQ201410374991
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】張勇, 鄧詩財(cái), 郝純, 梅海 申請(qǐng)人:盎億泰地質(zhì)微生物技術(shù)（北京）有限公司