一種生產(chǎn)n-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用，特別是指一種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該基因工程菌通過(guò)在枯草芽孢桿菌中表達(dá)編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙?；富?，形成完整的從葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代謝通路；敲除或失活枯草芽孢桿菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因nagP構(gòu)建而成，它解決了現(xiàn)有技術(shù)中所生產(chǎn)的N-乙酰氨基葡萄糖安全性差、產(chǎn)量低、成本高的問(wèn)題。具有所構(gòu)建的基因工程菌能積累更高濃度的N-乙酰氨基葡萄糖，工業(yè)化利用價(jià)值較高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方 法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用，特別是指一種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的 枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] N-乙酰氨基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，通常以beta-1，4-糖苷鍵聚合成幾丁質(zhì)。 幾丁質(zhì)是自然界中數(shù)量?jī)H次于纖維素的第二大類碳水化合物，廣泛存在于菌類、藻類，蝦、 蟹、昆蟲(chóng)的外殼和高等植物的細(xì)胞壁等，因此，N-乙酰氨基葡萄糖在自然界的存量巨大。
[0003] N-乙酰氨基葡萄糖與D-葡萄糖醛酸形成重復(fù)的二糖單位而構(gòu)成透明質(zhì)酸，透明 質(zhì)酸是關(guān)節(jié)間起潤(rùn)滑作用的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)于骨關(guān)節(jié)具有重要的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)已證明N-乙 酰氨基葡萄糖可作為治療和預(yù)防中老年人關(guān)節(jié)疾病的有效藥物，并且實(shí)驗(yàn)證明即使大劑量 的N-乙酰氨基葡萄糖對(duì)人體也無(wú)任何毒副作用，是一種安全可靠的保健品和藥物。N-乙酰 氨基葡萄糖也可以通過(guò)酶水解或酸水解產(chǎn)生氨基葡萄糖，后者也是一種已得到廣泛應(yīng)用的 中老年人關(guān)節(jié)保健品，市場(chǎng)巨大。
[0004] N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)目前主要是利用氨基葡萄糖和乙酸酐經(jīng)化學(xué)縮合反應(yīng) 而成，原料氨基葡萄糖主要通過(guò)酸水解幾丁質(zhì)而獲得，這個(gè)過(guò)程伴隨著大量含酸廢水的排 放，而且由于蝦蟹殼幾丁質(zhì)的原料供應(yīng)受季節(jié)和產(chǎn)地因素的限制，導(dǎo)致最終N-乙酰氨基葡 萄糖生產(chǎn)成本過(guò)高。因此，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的工 作。
[0005] 專利 W02004003175(同族專利包括 US7332304 和 CN101365785 等）中公開(kāi)了一 系列代謝工程大腸桿菌的構(gòu)建方法，發(fā)酵后N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量最高達(dá)到110g/L，專利 CN102268399和CN102286420公開(kāi)了兩種構(gòu)建大腸桿菌工程菌的方法，并通過(guò)發(fā)酵N-乙酰 氨基葡萄糖產(chǎn)量達(dá)到70g/L。上述專利都是通過(guò)遺傳改造大腸桿菌得到能高產(chǎn)N-乙酰氨基 葡萄糖的基因工程菌，但是大腸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，這使得其發(fā)酵產(chǎn)品在保 健品和食品中的應(yīng)用受到限制，因此采用安全無(wú)毒的微生物生產(chǎn)氨基葡萄糖或N-乙酰氨 基葡萄糖成為工業(yè)生產(chǎn)的需要。
[0006] 專利 CN103045527A，CN102978149A 和 CN103060252A 中公開(kāi)了一系列產(chǎn) N-乙酰 氨基葡萄糖的枯草桿菌工程菌構(gòu)建方法，通過(guò)遺傳改造構(gòu)建了幾株產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖 的枯草芽孢桿菌，發(fā)酵后產(chǎn)量分別達(dá)到115mg/L，415mg/L和1.23g/L，初步解決了發(fā)酵法生 產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖安全性的問(wèn)題，但以上發(fā)酵產(chǎn)量最高只達(dá)到1. 23g/L，產(chǎn)量過(guò)低導(dǎo)致 生產(chǎn)成本增高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構(gòu) 建方法和應(yīng)用，利用所構(gòu)建的高產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程枯草芽孢桿菌，通過(guò)生物 發(fā)酵工程，達(dá)到生產(chǎn)可以在保健品領(lǐng)域應(yīng)用的高安全性N-乙酰氨基葡萄糖的目的。
[0008] 本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：
[0009] -種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，其保藏編號(hào)為 CCTCC Μ 2014342。
[0010] 上述菌種 申請(qǐng)人:已于2014年7月16日提交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位簡(jiǎn)稱為CCTCC。
[0011] 生產(chǎn)Ν-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，是通過(guò)將編碼6-磷酸氨基 葡萄糖合成酶、6-磷酸氨基葡萄糖乙?；敢肟莶菅挎邨U菌宿主菌高效表達(dá)，并敲除或 失活枯草芽孢桿菌中Ν-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶基因 nagB和gamA、6-磷酸-Ν-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因 nagA、氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 gamP和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 nagP構(gòu)建而成。
[0012] 所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖乙?；富蛞肟莶?芽孢桿菌超表達(dá)，可將這兩個(gè)基因分別克隆到表達(dá)載體上后，以質(zhì)粒的方式在枯草芽孢桿 菌中串聯(lián)表達(dá)，本發(fā)明中表達(dá)載體選擇ΡΗΤΟ 1載體。
[0013] 所述nagB、nagA、nagP、gamA和gamP基因的敲除，是通過(guò)同源重組系統(tǒng)完成。五 個(gè)基因中nagA和nagB在枯草桿菌染色體上連鎖排列，可一次性敲除，gamA和gamP連鎖排 列，可一次性敲除。因此，上述5個(gè)基因的敲除可以通過(guò)三次實(shí)驗(yàn)操作完成，也可以通過(guò)五 次實(shí)驗(yàn)分別完成。枯草芽孢桿菌的基因敲除工作可通過(guò)PMAD載體和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)完成。
[0014] 生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌在N-乙酰氨基葡萄糖中的應(yīng)用，將生產(chǎn) N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌CCTCC Μ 2014342接種至以葡萄糖為碳源的無(wú)菌培養(yǎng) 基，在37°C條件下通氣發(fā)酵70小時(shí)。
[0015] 本發(fā)明的具體技術(shù)構(gòu)思還有：
[0016] 所述的構(gòu)建方法包括如下工藝步驟：
[0017] A、分別敲除枯草芽抱桿菌中的nagAB基因族、gamAP基因族和nagP基因，獲得基 因工程菌宿主；
[0018] B、構(gòu)建GNA1和glmS雙表達(dá)載體；
[0019] C、將雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)入1)所得宿主菌，得到最終生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽 孢桿菌。
[0020] 所述的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌或其它具有相同功能 酶的微生物。
[0021] 所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺合成6-磷酸氨基葡 萄糖的反應(yīng)，該酶受反應(yīng)產(chǎn)物6-磷酸氨基葡萄糖的反饋抑制，因此該反應(yīng)為N-乙酰氨基葡 萄糖合成途徑中的限速步驟，高表達(dá)6-磷酸氨基葡萄糖合成酶有助于增加中間產(chǎn)物6-磷 酸氨基葡萄糖的供應(yīng)量，從而會(huì)增加終產(chǎn)物N-乙酰氨基葡萄糖的濃度。所述酶可來(lái)源于枯 草芽孢桿菌，基因的獲得可根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組序列GenBank No. NC_000964 中g(shù)lmS基因序列全基因合成，或利用枯草芽孢桿菌168菌株的基因組DNA為模板通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得。
[0022] 所述的6-磷酸氨基葡萄糖乙?；富騺?lái)源于釀酒酵母或其它具有相同功能酶 的微生物。
[0023] 所述6-磷酸氨基葡萄糖乙?；复呋?-磷酸氨基葡萄糖和乙酰CoA合成6-磷 酸-N-乙酰氨基葡萄糖，該酶在枯草芽孢桿菌中不存在，通過(guò)基因工程引入并高表達(dá)，從 而實(shí)現(xiàn)合成N-乙酰氨基葡萄糖的目的。該酶來(lái)源于釀酒酵母，基因的獲得可根據(jù)GenBank No. NM_001179949序列，經(jīng)全基因合成得到，或利用釀酒酵母S288c菌株基因組DNA為模板 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得。
[0024] 所述的敲除或失活枯草芽孢桿菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸 氨基葡萄糖脫氨酶基因 nagB和gamA同時(shí)進(jìn)行。
[0025] 本發(fā)明所具備的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和取得的顯著技術(shù)進(jìn)步在于：
[0026] 本發(fā)明通過(guò)在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行基因工程操作，構(gòu)建了一條新的從葡萄糖到 N-乙酰氨基葡萄糖的代謝通路，增強(qiáng)了 N-乙酰氨基葡萄糖合成途徑中的限速酶基因表達(dá)， 同時(shí)，敲除導(dǎo)致N-乙酰氨基葡萄糖消耗和回流的基因，阻止N-乙酰氨基葡萄糖的回流和消 耗，相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明構(gòu)建的工程菌株能積累更高濃度的N-乙酰氨基葡萄糖（經(jīng)檢測(cè)， 發(fā)酵終產(chǎn)物中N-乙酰氨基葡萄糖濃度可達(dá)38. 3g/L)，具有較高的工業(yè)化利用價(jià)值。
[0027] 本發(fā)明中所采用的微生物已于2014年7月16日提交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保 藏，保藏單位簡(jiǎn)稱為CCTCC。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1是本發(fā)明中生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的相關(guān)代謝途徑。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做進(jìn)一步描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā) 明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說(shuō)明書做出的等效技術(shù)手段替換，均 不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030] 本實(shí)施例中使用的質(zhì)粒抽提、基因組抽提、PCR試劑等采用商業(yè)產(chǎn)品，具體操作按 照說(shuō)明書進(jìn)行。其他未注明的實(shí)驗(yàn)操作按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》（〔美〕J.莎姆布 魯克黃培堂譯）操作方法進(jìn)行。
[0031 ] 枯草芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)操作及pMAD基因敲除原理和方法見(jiàn)文獻(xiàn)（Maryvonne Arnaud et al, New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, gram-positive bacteria, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Nov. 2004,p.6887 - 6891)〇
[0032] 枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)Meddeb Mouelhi F et al, High transformation efficiency of Bacillus subtilis with integrative DNA using glycine betaine as osmoprotectant, Anal Biochem. 2012 May 15 ;424 (2):127-9.
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 一、敲除枯草芽孢桿菌168菌株中nagAB基因簇
[0035] 1、根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組（Genbank No. NC_000964)序列，設(shè)計(jì)引物： h游引物 F-nagAB-up-BamHI: CTGGATCCGACTGCAAGATTTCGGCCTGGG (SEQ ID NO. 1 所示）和下 游引物 R-nagAB:CATMGTCAGCATGTTCCTTTCACATAGATGATCCGCCTTTCTGG(SEQ ID N0. 2 所示）。 以枯草芽孢桿菌168菌株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到nagAB基因簇上游1000bp片 段。
[0036] 2、根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組（Genbank No. NC_000964)序列，設(shè)計(jì)引物： 上游引物 F-nagAB: CCAGAAAGGCGGATCATCTATGTGAAAGGAACATGCTGACTTATG (SEQ ID N0. 3 所 示）和下游引物 R-nagAB-down-NcoI: GCTCCATGGTAACGTATATACCAATGAAGAG (SEQ ID NO. 4 所示）。以枯草芽孢桿菌168菌株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到nagAB基因簇下游 lOOObp 片段。
[0037] 3、將上述兩種PCR產(chǎn)物純化后各取5ul作為模板，以引物F-nagAB-up-BamHI (SEQ IDN0·l所示）和R-nagAB-down-NcoI(SEQIDN0·4所示）做overlapPCR擴(kuò)增，獲得nagAB 基因簇中上下游各l〇〇〇bp，且中間缺失了 nagAB編碼區(qū)的DNA片段。
[0038] 4、純化上述片段，利用常規(guī)分子克隆技術(shù)將其插入載體pMAD，得到敲除載體 pMAD- Δ nagAB ；
[0039] 5、將pMAD-AnagAB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌168菌株，涂布含有50ug/mL的 X-gal (5-溴_4_氯_3_卩彡丨哚-β -D-半乳糖苷）和紅霉素平板，30度過(guò)夜培養(yǎng)；
[0040] 6、挑取顯藍(lán)色轉(zhuǎn)化子，30度過(guò)夜培養(yǎng)，按5%接種量轉(zhuǎn)接至5mL紅霉素抗性的LB 培養(yǎng)基，30度孵育2小時(shí)，升溫至42度繼續(xù)孵育6小時(shí)，稀釋（1(Γ2-1(Γ5)涂布含有X-gal和 紅霉素的平板，42度過(guò)夜培養(yǎng)；
[0041] 7、挑取藍(lán)色單菌落于30度和無(wú)抗性LB培養(yǎng)基中孵育6小時(shí)，升溫至42度繼續(xù)孵 育3小時(shí)，稀釋（1(Γ 2-1(Γ5)涂布含有X-gal的無(wú)抗性LB平板，42度過(guò)夜培養(yǎng)；
[0042] 8、挑取顯白斑的單菌落分別在紅霉素和無(wú)抗LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，選擇無(wú)紅霉 素抗性的單菌落做菌落PCR驗(yàn)證，引物選擇F-nagAB-up-BamHI (SEQ ID NO. 1所示）和 R-nagAB-down_NcoI(SEQ ID NO. 4所示），能擴(kuò)增出大小為2kb的菌落即為敲除了 nagAB基 因簇的陽(yáng)性菌落Bsl68/AnagAB。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 二、繼續(xù)敲除枯草芽孢桿菌中的gamAP基因簇
[0045] 1、根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組（Genbank No. NC_000964)序列，設(shè)計(jì)引物： 上游引物 F-gamAP-up-BamHI: CTGGATCCACTGCTCCCCACAGCACTTTTCC (SEQ ID N0. 5 所示）和 下游引物 R-gamAP:CGCAGCAGGGGGGACTITITTACATGTGACACCCCCTCAAAGAG(SEQ ID N0. 6 所 示）。以枯草芽孢桿菌168菌株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到gamAP基因簇上游 lOOObp 片段。
[0046] 2、根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組（Genbank No. NC_000964)序列，設(shè)計(jì)引物： 上游引物 F-gamAP: CTCTTTGAGGGGGTGTCACATGTAMAAAGTCCCCCCTGCTGCG (SEQ ID N0. 7 所示） 和下游引物 R-gamAP-down-NcoI: GCTCCATGGATACCACTCGTTTGGGACAGCC (SEQ ID Ν0· 8 所示）。 以枯草芽孢桿菌168菌株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到gamAP基因簇下游lOOObp片 段。
[0047] 3、將上述兩種PCR產(chǎn)物純化后各取5ul作為模板，以引物F-gamAP-up-BamHI (SEQ ID Ν0· 5所示）和R-gamAP-down-NcoI (SEQ ID Ν0· 8所示）擴(kuò)增，獲得gamAP基因簇中上下 游各1000bp，且中間缺失了 gamAP編碼區(qū)的DNA片段。
[0048] 4、純化上述片段，利用常規(guī)分子克隆技術(shù)將其插入載體pMAD，得到敲除載體 pMAD-Δ gamAP ；
[0049] 5、將pMAD- Λ gamAP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)實(shí)施例1中的枯草芽孢桿菌Bsl68/ Λ nagAB菌株， 采用與上述同樣的步驟篩選陽(yáng)性菌落，引物選擇F-gamAP-up-BamHI (SEQ ID NO. 5所示）和 R-gamAP-down_NcoI(SEQ ID NO. 8所示），能擴(kuò)增出大小為2kb的菌落即為敲除了 gamAP基 因的陽(yáng)性菌落 Bsl68/A nagAB /Δ gamAP。
[0050] 實(shí)施例3
[0051] 三、繼續(xù)敲除枯草芽孢桿菌中的nagP基因
[0052] 1、根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組（Genbank No. NC_000964)序列，設(shè)計(jì)引物： 上游引物 F-nagP-up-BamHI: CTGGATCCCAAGACCTCCTCGTACAGAATAATG (SEQ ID N0. 9 所示） 和下游引物 R_nagP:GGTTGCCCTCTCCGCTTTTTTACATACCCATCCCCCTCATACCC(SEQ ID NO. 10 所 示）。以枯草芽孢桿菌168菌株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到nagP基因上游1000bp 片段。
[0053] 2、根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組（Genbank No. NC_000964)序列，設(shè)計(jì)引物： 上游引物 F-nagP: GGGTATGAGGGGGATGGGTATGTAAMAAGCGGAGAGGGCAACC (SEQ ID NO. 11 所示） 和下游引物 R-nagP-down-NcoI: GCTCCATGGTTCCGGCGATTCTGAAGTCTAAG (SEQ ID N0. 12 所 示）。以枯草芽孢桿菌168菌株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到nagP基因下游1000bp 片段。
[0054] 3、將上述兩種PCR產(chǎn)物純化后各取5ul作為模板，以引物F-nagP-up-BamHI (SEQ ID Ν0· 9所示）和R-nagP-down-NcoI (SEQ ID Ν0· 12所示）擴(kuò)增，獲得nagP基因中上下游 各1000bp，且中間缺失了 nagP編碼區(qū)的DNA片段。
[0055] 4、純化上述片段，利用常規(guī)分子克隆技術(shù)將其插入載體pMAD，得到敲除載體 pMAD-Δ nagP ；
[0056] 5、將pMAD- Δ nagP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)實(shí)施例2中的枯草芽孢桿菌Bs 168/ Δ nagAB/ Λ gamAP菌株，采用與上述同樣的步驟篩選陽(yáng)性菌落，引物選擇F-nagP-up-BamHI (SEQ ID NO. 9所示）和R-nagP-down-NcoI (SEQ ID NO. 12所示），能擴(kuò)增出大小為2kb的菌落即為 敲除了 nagP 基因的陽(yáng)性菌落 Bsl68/AnagAB/AgamAP/AnagP。
[0057] 實(shí)施例4
[0058] 四、GNA1和glmS基因雙表達(dá)載體的構(gòu)建
[0059] 1、根據(jù)釀酒酵母GNA1基因序列GenBank No. NM_001179949全合成GNA1基因，兩 端加 BamHI和Xbal位點(diǎn)（如下劃線所示），具體序列如下所示（SEQ ID N0. 13)。
[0060] ggatccatgagcttacccgatggattttatataaggcgaatggaagagggggatttggaacaggtcact gagacgctaaaggttttgaccaccgtgggcactattacccccgaatccttcagcaaactcataaaatactggaatga agccacagtatggaatgataacgaagataaaaaaataatgcaatataaccccatggtgattgtggacaagcgcaccg agacggttgccgctacggggaatatcatcatcgaaagaaagatcattcatgaactggggctatgtggccacatcgag gacattgcagtaaactccaagtatcagggccaaggtttgggcaagctcttgattgatcaattggtaactatcggctt tgactacggttgttataagattattttagattgcgatgagaaaaatgtcaaattctatgaaaaatgtgggtttagca acgcaggcgtggaaatgcaaattagaaaatagtctaga
[0061] 2、利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)將GNA1基因連接至pHTOl載體（MoBiTec公司，德國(guó)） 的BamHI和Xbal位點(diǎn)上，得到載體pHTOl-GNAl。
[0062] 3、根據(jù)枯草芽抱桿菌168菌株基因組（Genbank No. NC_000964)序列中g(shù)lmS序 列設(shè)計(jì)引物，正向引物 F-glmS-Xbal ：CGCTCTAGAGGAGGAAGAAAAATATGTGTG(SEQ ID NO. 14 所 示）和反向引物 R-glmS-AatII ：GTAGACGTCTTACTCCACAGTAACACTCTTCGC(SEQ ID NO. 15 所 示），該引物中的兩端增加了 Xbal和Aatll位點(diǎn)；
[0063] 4、以枯草芽孢桿菌168菌株的總DNA為模板，以上述引物（SEQ ID NO. 14-15 所示）PCR擴(kuò)增得到glmS基因及其上游核糖體結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段，通過(guò)常規(guī)克隆技術(shù) 將片段插入上述構(gòu)建好的載體PHT01-GNA1的Xbal和Aatll位點(diǎn)之間，得到雙表達(dá)載體 pHTOl-GNAl-glmS。
[0064] 實(shí)施例5
[0065] 五、最終工程菌的構(gòu)建
[0066] 將上述構(gòu)建的雙表達(dá)載體pHTOl-GNAl-glmS電轉(zhuǎn)化改造過(guò)的枯草芽孢桿菌宿主 菌Bsl68/ Λ nagAB/ Λ gamAP/ Λ nagP，涂布氯霉素（10mg/L) LB平板，37度培養(yǎng)過(guò)夜，獲得基 因工程菌株1^168/八1^8413/八8811^/八1^8?/^1'01-6敵1-811113，即為能合成1^-乙酰氨基 葡萄糖的枯草芽孢桿菌，命名為BsNAGOl。
[0067] 實(shí)施例6
[0068] 六、工程菌株發(fā)酵
[0069] 1、種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：
[0070] 種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基（成分為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L);固 體或液體培養(yǎng)時(shí)，補(bǔ)加氯霉素至終濃度l〇mg/L。
[0071] 發(fā)酵培養(yǎng)基由如下組份組成：蛋白胨l-10g/L，酵母粉l-5g/L，磷酸氫二鉀l-5g/ L，磷酸二氫鉀l_8g/L，硫酸銨l-5g/L，葡萄糖5-20g/L，余量為水。補(bǔ)料培養(yǎng)基為質(zhì)量百分 比為40-60%的葡萄糖溶液。
[0072] 2、發(fā)酵過(guò)程：
[0073] 先過(guò)夜培養(yǎng)種子培養(yǎng)基，按2-5%的接種量將枯草芽孢桿菌CCTCC M2014342轉(zhuǎn)接 至發(fā)酵培養(yǎng)基，33-37°C好氣培養(yǎng)，通過(guò)通氣量、罐壓和攪拌保持溶氧維持在20%以上，用氨 水控制pH = 6. 8-7. 0并補(bǔ)充氮源，初始葡萄糖耗完后開(kāi)始按照3-6g/L · h速率補(bǔ)加碳源， 發(fā)酵液0D600達(dá)到15后添加0. 01-0. 05mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)誘 導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束，取樣利用高效液相色譜（HPLC)檢測(cè)。
[0074] 具體檢測(cè)條件為：
[0075] 檢測(cè)柱：Bi〇-Rad ΑΜΙΝΕΧ ΗΡΧ 87Η Organic Analysis Column (300X 7. 8 mm);
[0076] 柱溫：6〇? ;
[0077] 流動(dòng)相：6mM 硫酸，流速：0. 6ml/min ;
[0078] 檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。
[0079] 經(jīng)檢測(cè)，72-84小時(shí)發(fā)酵后，發(fā)酵液中N-乙酰氨基葡萄糖濃度可達(dá)38. 3g/L以上。
【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，其特征在于其 保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2014342。
2. 生產(chǎn)Ν-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于是通過(guò)將編碼 6_磷酸氨基葡萄糖合成酶、6-磷酸氨基葡萄糖乙?；敢肟莶菅挎邨U菌宿主菌高效表 達(dá)，并敲除或失活枯草芽孢桿菌中Ν-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基葡萄 糖脫氨酶基因 nagB和gamA、6-磷酸-Ν-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因 nagA、氨基葡萄糖轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白基因 gamP和N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 nagP構(gòu)建而成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征 在于所述的構(gòu)建方法包括如下工藝步驟： A、 分別敲除枯草芽孢桿菌中的nagAB基因簇、gamAP基因簇和nagP基因，獲得基因工 程菌宿主； B、 構(gòu)建GNA1和glmS雙表達(dá)載體； C、 將雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)入A所得宿主菌，得到最終生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿 菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征 在于所述的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌或其它具有相同功能酶的 微生物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征 在于所述的6-磷酸氨基葡萄糖乙?；富騺?lái)源于釀酒酵母或其它具有相同功能酶的微 生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征 在于所述的敲除或失活枯草芽孢桿菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基 葡萄糖脫氨酶基因 nagB和gamA同時(shí)進(jìn)行。
7. 生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌在N-乙酰氨基葡萄糖中的應(yīng)用，其特征在 于將生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌CCTCC Μ 2014342接種至以葡萄糖為碳源的 無(wú)菌培養(yǎng)基，在37°C條件下通氣發(fā)酵70小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N15/75GK104195094SQ201410376584
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】張帆 申請(qǐng)人:張帆