Sh2b銜接蛋白1（sh2b1）在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種SH2B銜接蛋白1（SH2B1）在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用。本發(fā)明確定了SH2B1基因的表達(dá)與心肌肥厚之間的相互關(guān)系：心肌肥厚發(fā)生時(shí)SH2B1的表達(dá)明顯上調(diào)；SH2B1的干擾和過表達(dá)腺病毒分別抑制和促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大；SH2B1基因缺陷和過表達(dá)分別抑制和顯著上調(diào)Jak2/Stat3信號(hào)通路的激活，抑制和促進(jìn)心肌肥厚、纖維化，保護(hù)和惡化心功能。因此，SH2B1基因可作為藥物靶標(biāo)用于在篩選保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物；SH2B1基因可作為基因治療中的靶基因，用于設(shè)計(jì)和制備保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物，為心肌肥厚的治療提供了新的途徑。
【專利說明】SH2B銜接蛋白1 (SH2B1)在治療心肌肥厚中的功能及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種SH2B銜接蛋白1 (SH2B1)在治 療心肌肥厚中的功能和應(yīng)用，具體是在制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的提高，心力衰竭在心血管事件的發(fā)生率和病死率中所 占的比例越來越高，是心肌肥厚最常見的并發(fā)癥，是一種心臟舒縮功能不全而無法滿足機(jī) 體代謝需要的復(fù)雜的綜合征，它是當(dāng)今人類主要死因之一。目前研究的重點(diǎn)在于心臟的左 室肥厚性重構(gòu)，是當(dāng)前公認(rèn)的心血管疾病死亡率危險(xiǎn)因素。心肌肥厚是心臟對(duì)許多外來刺 激如：高血壓、瓣膜性心臟病、心肌梗死和心肌病等的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是心臟負(fù)荷增加時(shí) 室壁應(yīng)力正常化的一種適應(yīng)性改變。雖然這個(gè)過程是對(duì)心臟增加作功的一種代償，但長期 如此會(huì)導(dǎo)致心力衰竭、心律失常和猝死。心肌肥厚的特征是心肌細(xì)胞體積增大、蛋白質(zhì)合 成增加及肌纖維增多。目前關(guān)于心肌肥厚發(fā)生的分子機(jī)制研究眾多，主要有：1、神經(jīng)鈣蛋 白-NFAT信號(hào)通路。2、P13K/AKT/GSK-3依賴信號(hào)通路。3、MEF2/HPAC對(duì)心肌肥大的轉(zhuǎn)錄調(diào) 控。4、G蛋白復(fù)合受體的肥大信號(hào)通路。5、小G蛋白與肌原纖維信號(hào)通路。6、MPK信號(hào)通 路。7、PKC信號(hào)通路。8、GP130/STAT3信號(hào)通路。9、脂質(zhì)代謝障礙機(jī)制。10、MMP/TNF機(jī)制 等。然而，現(xiàn)有的研究并不能完全詮釋心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制。因此需要尋找新的治療方法， 特別是藥物治療方法來提高心衰病人的生存率和生活質(zhì)量，更好地解釋心肌肥厚的發(fā)生機(jī) 制是通向這一目標(biāo)的關(guān)鍵因素。
[0003] SH2B1是SH2B家族的成員，SH2B是一類含有SH2和PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)接頭蛋白， 在生長發(fā)育、代謝平衡和免疫調(diào)節(jié)等諸多方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。SH2B1基因長約6. 1 kb，它編碼的蛋白質(zhì)包含有SH2和PH結(jié)構(gòu)域。SH2B1是SH2B信號(hào)蛋白家族（SH2-B、APS、 LNK)的新成員，與適配子蛋白APS和LNK組成一個(gè)新的適配子家族。SH2B、APS、LNK現(xiàn)在分 別被命名為SH2B1、SH2B2、SH2B3。SH2B1是酪氨酸激酶受體A (TrkA)與細(xì)胞膜相連的結(jié)合 蛋白，屬保守的接頭蛋白，主要介導(dǎo)含有酪氨酸磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。SH2B1是采用雙酵 母雜交篩選系統(tǒng)分離鑒定得出，存在于大量的組織和細(xì)胞中，包括下丘腦、肝臟、肌肉、脂肪 組織、心臟、膜臟等【1，2】。有研究表明SH2B1是體重調(diào)節(jié)系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白，在調(diào)控脂肪儲(chǔ) 存、糖的使用、能量平衡和體重的眾多信號(hào)分子中它作為一個(gè)關(guān)鍵蛋白起作用。利用多種遺 傳、飲食和激素技術(shù)發(fā)現(xiàn)SH2B1能調(diào)節(jié)代謝信號(hào)分子瘦素（leptin)和胰島素（insulin)活 性、調(diào)節(jié)來自食物的能量利用，調(diào)節(jié)身體體重。
[0004] 轉(zhuǎn)錄因子 STAT (signal transducer and activator of transcription)被稱之 為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，在細(xì)胞因子-受體相互作用的過程中充當(dāng)載體，保持信號(hào)在 細(xì)胞內(nèi)傳遞的內(nèi)在特異性，它在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活上發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，在細(xì)胞的生 長、凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)的STAT家族有STAT1-6共6個(gè)成員，它們?cè)?結(jié)構(gòu)上都有共同的特性，由7個(gè)不同的功能結(jié)構(gòu)域組成。STAT可以通過SH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別磷 酸化的受體，然后STAT也發(fā)生磷酸化，形成二聚體進(jìn)入胞核，它作為有活性的轉(zhuǎn)錄因子，影 響相關(guān)基因的表達(dá)。
[0005] 關(guān)于Jak/Stat信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)有較多的研究報(bào)道，已有研究表明Jak2/Stat3 信號(hào)通路在缺血性腦損傷、心肌梗死、骨骼發(fā)育、能量代謝、癌癥、血管重構(gòu)等病理過程中發(fā) 揮重要的作用。丹參水提物預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷的大鼠心肌細(xì)胞有很好的保護(hù)作用， 可減少其氧化損傷、提高免疫功能，減少心肌細(xì)胞凋亡，該作用是通過激活JAK2/STAT3信 號(hào)通路【3】;激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，顯著保護(hù)缺血再灌注引起的大腦及神經(jīng)元損傷【4， 5】；在體內(nèi)/體外實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路，可減少胃癌腫瘤細(xì)胞生長 【6】;在卵巢癌中，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路可抑制腫瘤干細(xì)胞，降低腫瘤負(fù)荷【7】;丹參酮 IIA通過減少JAK2/STAT3信號(hào)通路分子的磷酸化水平，從而促進(jìn)缺氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的 凋亡，逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)【8】。
[0006] 【參考文獻(xiàn)】： 1、 Li Y， et al. Cloning and characterization of human Lnk, an adaptor protein with pleckstrin homology and Src homology 2 domains that can inhibit T cell activation. J Immunol (2000). 164(10):5199 - 5206 2、 Takaki S，et al. Control of B cell production by the adaptor protein Ink. Definition of a conserved family of signal-modulating proteins. Immunity. 13(5):599 - 609 3、 Ge G， et al. Protective effect of Salvia mi Itiorrhiza aqueous extract on myocardium oxidative injury in ischemic-reperfusion rats. Gene. 2014;546(1):97-103 4、 Liu et al. Diosmin protects against cerebral ischemia/reperfusion injury through activating JAK2/STAT3 signal pathway in mice. X. Neuroscience, 2014， 268:318-27 5、 Haibo Zhu et al. SMND-309，a novel derivative of salvianolic acid B， protects rat brains ischemia and reperfusion injury by targeting the JAK2/STAT3 pathway. European Journal of Pharmacology. 2013 ， 714(1-3):23-31 6λ Judd LM et al. Inhibition of the JAK2/STAT3 Pathway Reduces Gastric Cancer Growth In Vitro and In Vivo. PLoS One. 2014;9(5) :e95993 7、 Abubaker K et al. Inhibition of the JAK2/STAT3 pathway in ovarian cancer results in the loss of cancer stem cell-like characteristics and a reduced tumor burden. BMC Cancer. 2014:10.1186/1471-2407-14-317 8、 Chen M et al· Tanshinone IIA promotes pulmonary artery smooth muscle cell apoptosis in vitro by inhibiting the JAK2/STAT3signaling pathway. Cell Physiol Biochem. 2014:33(4):1130-8。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于確定SH2B1的表達(dá)和心肌 肥厚的相互關(guān)系，提供一種SH2B1作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/ 治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用，提供一個(gè)用于保護(hù)心臟功能和/或預(yù)防、緩解和/或治療心 肌肥厚的靶基因 SH2B1的新用途。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 本發(fā)明首先通過試驗(yàn)確定SH2B1表達(dá)與心肌肥厚之間的關(guān)系： 1、在發(fā)生心肌肥厚的情況下，SH2B1的表達(dá)明顯上調(diào) 本發(fā)明選用正常人和擴(kuò)張型心肌病、肥厚性心肌病患者以及正常小鼠和發(fā)生心肌肥厚 小鼠的心臟，對(duì)心臟提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)（Western blot)，結(jié)合特異 性識(shí)別SH2B1蛋白和心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ΑΝΡ、β -MHC的抗體進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其SH2B1的表 達(dá)。結(jié)果表明，在人和小鼠發(fā)生肥厚的心臟中，心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ΑΝΡ、β-MHC的表達(dá)明 顯上調(diào)，SH2B1的表達(dá)也明顯上調(diào)（圖1、圖2)。
[0009] 2、SH2B1的干擾腺病毒抑制心肌細(xì)胞肥大；SH2B1的過表達(dá)腺病毒促進(jìn)心肌細(xì)胞 肥大 本發(fā)明通過在體外分離、培養(yǎng)了 SD乳鼠心肌細(xì)胞，并構(gòu)建SH2B1干擾（Adsh SH2B1)及 過表達(dá)（Ad SH2B1)腺病毒，通過結(jié)合Ang II刺激模擬心肌細(xì)胞肥大模型，研究SH2B1對(duì)心 肌細(xì)胞肥大的影響。通過在熒光顯微鏡下觀察到Ang II刺激后心肌細(xì)胞明顯大于PBS組， Ang II刺激后SH2B1干擾腺病毒的心肌細(xì)胞肥大程度明顯被抑制，而SH2B1過表達(dá)腺病毒的 心肌細(xì)胞肥大則顯著增加（圖3)。
[0010] 3、SH2B1基因敲除顯著抑制了心肌肥厚、纖維化的程度，保護(hù)心功能；SH2B1基因 過表達(dá)顯著促進(jìn)了心肌肥厚及其纖維化的程度，惡化心功能 本發(fā)明選用野生型小鼠、SH2B1基因敲除小鼠及心臟特異性SH2B1轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn) 基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，并將每種小鼠分成假手術(shù)組和手術(shù)組，每組10只小鼠。手術(shù)組給予主 動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，假手術(shù)組不予主動(dòng)脈弓縮窄，然后通過對(duì)假手術(shù)組和手術(shù)組的各組小鼠 進(jìn)行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測(cè)定，研究SH2B1基因敲除/過表達(dá)對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄 誘導(dǎo)的心肌肥厚的影響。結(jié)果表明敲除SH2B1基因所致的SH2B1缺陷顯著抑制心肌肥厚、 纖維化，保護(hù)心功能；過表達(dá)SH2B1基因顯著惡化心肌肥厚、纖維化以及心功能（圖4-11)。
[0011] 4、SH2B1基因敲除抑制激活Jak2/ Stat3信號(hào)通路；SH2B1基因過表達(dá)促進(jìn)激活 Jak2/ Stat3信號(hào)通路 本發(fā)明用野生型小鼠、SH2B1基因敲除小鼠及心臟特異性SH2B1轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基 因小鼠分別進(jìn)行假手術(shù)和主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，然后在術(shù)后4周對(duì)各組小鼠心臟提取蛋白質(zhì) 進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)（Western blot)，結(jié)果顯示敲除SH2B1基因所致的SH2B1缺 陷顯著抑制Jak2/Stat3信號(hào)通路的激活，SH2B1基因過表達(dá)促進(jìn)Jak2/Stat3信號(hào)通路的 激活（圖12,圖13)。
[0012] 由以上結(jié)果可知發(fā)生心肌肥厚時(shí)，SH2B1表達(dá)上調(diào)，SH2B1基因缺陷抑制Jak2/ Stat3信號(hào)通路的激活，抑制了心肌肥厚及其纖維化，保護(hù)心功能，SH2B1基因過表達(dá)促進(jìn) Jak2/Stat3信號(hào)通路的激活，顯著促進(jìn)了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能。因此，SH2B1基因 可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建SH2B1基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，用于篩選預(yù)防、緩解 和/或治療心肌肥厚疾病的藥物；SH2B1基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù) 防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解 和/或治療心肌肥厚的目的。例如以SH2B1為靶基因，設(shè)計(jì)可干擾SH2B1表達(dá)的雙鏈siRNA， 通過化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使SH2B1基因沉默來治療心肌肥 厚疾?。贿€可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建SH2B1的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)SH2B1原形的作用底物， 從而抑制SH2B1的功能，起到治療目的；此外，還可以以SH2B1為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑 制劑，利用SH2B1基因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性 抑制SH2B1的分子，從而為心肌肥厚疾病的治療提供新的治療性分子。
[0013] 針對(duì)SH2B1的上述功能，提供SH2B1作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)心臟功能和預(yù)防、緩 解和/或治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 針對(duì)SH2B1的上述功能，提供SH2B1的抑制劑在制備保護(hù)心臟功能和預(yù)防、緩解和 /或治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 一種保護(hù)心臟功能的藥物，包含SH2B1的抑制劑。
[0016] 一種預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，包含SH2B1的抑制劑。
[0017] 所述的SH2B1的抑制劑優(yōu)選為SH2B1基因的siRNA、SH2B1基因的RNA干擾載體， SH2B1的抗體及其他能夠抑制SH2B1表達(dá)的抑制劑中的一種。
[0018] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果： (1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 SH2B1基因的新功能，即SH2B1能夠惡化心臟功能和促進(jìn)心肌肥厚的 作用。
[0019] (2)基于SH2B1在惡化心臟功能和促進(jìn)心肌肥厚中的功能，為研制心肌肥厚的藥 物提供靶標(biāo)。
[0020] (3)SH2B1的抑制劑可用于制備保護(hù)心臟功能和預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的 藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是正常人和心肌病患者心臟中ΑΝΡ、β -MHC、SH2B1的蛋白表達(dá)情況；A是正常 人和擴(kuò)張型心肌病患者心臟中ΑΝΡ、β -MHC、SH2B1的表達(dá)，心肌病患者心臟SH2B1的表達(dá)上 調(diào)（* :p < 0. 05 vs正常人組）；B是正常人和肥厚性心肌病患者心臟中ΑΝΡ、β -MHC、SH2B1 的表達(dá)，心肌病患者心臟SH2B1的表達(dá)上調(diào)（* :ρ < 0. 05 vs正常組)。
[0022] 圖2是小鼠在假手術(shù)（Sham)和主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)（AB)后心臟中ANP、β-MHC、 SH2B1的表達(dá)，說明發(fā)生心肌肥厚的心臟SH2B1的表達(dá)上調(diào)；其中4W表示4周，8W表示8周 (* :p < 0· 05 vs野生型小鼠 Sham組）。
[0023] 圖3是SD乳鼠原代心肌細(xì)胞用腺病毒AdshRNA、Adsh SH2Bl、Ad-GFP和Ad SH2B1 感染，經(jīng)Ang II刺激后的免疫熒光圖，結(jié)果表明SH2B1的干擾腺病毒抑制心肌細(xì)胞肥大， SH2B1的過表達(dá)腺病毒促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大（* :p < (λ 05 vs PBS組，# :p < (λ 05 vs Ang II 組)。
[0024] 圖 4 是 SH2B1+/+ 和 SH2B1-/-小鼠 AB 模型 4 周后 HW/BW、LW/BW 及 HW/TL 的統(tǒng)計(jì) 柱狀圖（* :p < 0. 05 vs野生型Sham組，# :p < 0. 05 vs野生型AB組）。
[0025] 圖5是SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型4周后心臟組織HE染色及心肌細(xì)胞橫 截面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖（* :p < 0· 05 vs野生型Sham組，# p < 0· 05 vs野生型AB組)。
[0026] 圖6是SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型4周后心臟組織天狼星紅染色及左室 膠原面積統(tǒng)計(jì)柱狀圖（* :p < 0. 05 vs野生型Sham組，# :p < 0. 05 vs野生型AB組)。
[0027] 圖7是NTG和TG小鼠 AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統(tǒng)計(jì)柱狀圖（* :p < 0· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0028] 圖8是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心臟組織HE染色及心肌細(xì)胞橫截面積統(tǒng)計(jì) 柱狀圖（* :P < 〇· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0029] 圖9是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心臟組織天狼星紅染色及左室膠原面積統(tǒng)計(jì) 柱狀圖（* Φ < 〇· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0030] 圖10是SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型4周后心功能檢測(cè)結(jié)果。A是超聲檢 測(cè)心功能結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖；B是血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)心功能結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，其中，LVEDD為左 室舒張末期內(nèi)徑、LVESD為左室收縮末期內(nèi)徑、FS為短軸縮短率、EF為射血分?jǐn)?shù)、dP/dt max 為左室內(nèi)壓最大上升速率及dP/dt min為左室內(nèi)壓最小上升速率（*:p< 0.05 vs野生型 Sham 組，# :p < 0· 05 vs 野生型 AB 組）。
[0031] 圖11是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心功能檢測(cè)結(jié)果。A是超聲檢測(cè)心功能結(jié) 果統(tǒng)計(jì)柱狀圖；B是血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)心功能結(jié)果統(tǒng)計(jì)柱狀圖，其中，LVEDD為左室舒張末期 內(nèi)徑、LVESD為左室收縮末期內(nèi)徑、FS為短軸縮短率、EF為射血分?jǐn)?shù)、dP/dt max為左室內(nèi) 壓最大上升速率及dP/dt min為左室內(nèi)壓最小上升速率（* :p < 0. 05 vs NTG Sham組，# : p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0032] 圖 12 是 SH2B1+/+ 和 SH2B1-/-小鼠 Sham 及 AB 模型 4 周時(shí) Jak2/ Stat3 信號(hào)通 路Western blot檢測(cè)圖，結(jié)果顯示SH2B1敲除會(huì)降低Jak2和Stat3的磷酸化激活水平； 其中"P-"代表磷酸化的激酶（Jak2和Stat3)，"T-"代表總的(磷酸化的和未磷酸化的）激 酶（Jak2 和 Stat3)，GAPDH 用作內(nèi)參（*:p<(X05 vs 野生型 Sham 組，#:p<(X05 vs 野生 型ΑΒ組）。
[0033] 圖13是NTG和TG小鼠 Sham及ΑΒ模型4周時(shí)Jak2/ Stat3信號(hào)通路Western blot檢測(cè)圖，結(jié)果顯示SH2B1過表達(dá)會(huì)促進(jìn)Jak2和Stat3的磷酸化激活水平；其中"p-" 代表磷酸化的激酶（Jak2和Stat3)，"T-"代表總的(磷酸化的和未磷酸化的）激酶（Jak2和 Stat3)，GAPDH 用作內(nèi)參（* :p < 0· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0035] 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用8-10周齡、體重在23. 5-27. 5g，背景為雄性C57BL/6的心臟特異性Cre 小鼠（野生型小鼠 α-MHC-Cre (命名 SH2B1+/+)，購自 Jackson Laboratory，貨號(hào) 005650)、 SH2B1基因敲除小鼠（SH2B1-/-，購自日本RIKEN公司，貨號(hào)：RIKEN00994)、心臟特異性 SH2B1轉(zhuǎn)基因小鼠（TG，心臟特異性SH2B1轉(zhuǎn)基因小鼠由武漢大學(xué)心血管病研究所李紅良教 授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）及非轉(zhuǎn)基因小鼠（NTG，同窩對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
[0036] 心臟特異性SH2B1轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建： 用引物（上游引物：GTTGTCGACGCCACCATGAATGGTGCCCCTTCCCC ;下游引物： GCCAAGCTTACACAGTCACTCGCTCCG)擴(kuò)增小鼠 SH2B1 全長基因（NCBI，Gene ID :20399， XM_006507481. 1)，把擴(kuò)增的SH2B1全長基因連接于心肌肌球蛋白重鏈（α-MHC)啟動(dòng) 子下游，將構(gòu)建的序列通過顯微注射構(gòu)造成受精胚胎（C57BL/6J背景)，得到心臟特異性 SH2B1轉(zhuǎn)基因老鼠。（上述的轉(zhuǎn)基因小鼠參照下述文獻(xiàn)制備Jiang DS，Bian ZY，Zhang Υ，Zhang SM，Liu Y，Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.) 飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SRF 級(jí)大小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24°C之間，濕度在 40-70%之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0037] 實(shí)施例1 SH2B1在正常人和心肌病患者心臟中的表達(dá) 選用正常人心臟(非心臟原因的死亡捐獻(xiàn)的個(gè)體)、擴(kuò)張型心肌病患者心臟(做心臟移 植手術(shù)病人置換的受體，DCM)和肥厚性心肌病患者心臟(做心臟移植手術(shù)病人置換的受 體，HCM)，對(duì)心臟提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)（Western blot)，結(jié)合特異性 識(shí) SH2B1 (R&D，AF6915)蛋白和心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物 ANP (Millipore，AB2232)、β-MHC (santa cruz，sc53090)的抗體進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其 SH2B1 的表達(dá)，GAPDH (Cell Signaling Technology, 2118)做內(nèi)參。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，與正常人心臟相比，心肌病患者心臟心肌 細(xì)胞肥大標(biāo)志物ΑΝΡ、β -MHC的表達(dá)明顯上調(diào)，SH2B1的表達(dá)也明顯上調(diào)。
[0038] 實(shí)施例2 SH2B1在野生型小鼠 Sham組和ΑΒ手術(shù)4W、8W心臟中的表達(dá) 1.心肌肥厚模型采用主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，模型操作流程： 1. 1術(shù)前準(zhǔn)備 (1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計(jì)算所需麻藥（3%戊巴比妥鈉）量，通過腹 腔注射，并記錄注射時(shí)間點(diǎn)。夾尾、夾趾無明顯反應(yīng)且小鼠狀態(tài)良好為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)(一般 注射后約l〇min無明顯反應(yīng)，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應(yīng)，麻醉后30min左右為最佳 手術(shù)時(shí)間）。
[0039] (2)術(shù)區(qū)準(zhǔn)備：將小鼠左胸部、左側(cè)胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗 布擦拭術(shù)區(qū)去除鼠毛，以不影響手術(shù)視野為宜。
[0040] (3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經(jīng) 聲門準(zhǔn)確插入氣管內(nèi)，隨后右側(cè)臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預(yù)熱)，然后將氣管插管 與呼吸機(jī)連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致，說明氣管插管成功。
[0041] 1.2主動(dòng)脈弓縮窄術(shù) 取右側(cè)臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫(yī)用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊 入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分?jǐn)?shù)為75%酒精對(duì)手術(shù)區(qū)域皮膚消毒。左手持眼科鑷 將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約lcm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水 平打開胸腔，用棉簽稍撥開左肺，游離主動(dòng)脈弓降支，將7-0手術(shù)縫線穿過血管，并在血管 上方平行放置一段26G (25. 0-27. 5g小鼠）或者27G (23. 5-25. 0g)注射器針頭，將血管及 針頭一起結(jié)扎好，再抽出針頭即可達(dá)到相應(yīng)程度的血管縮窄。結(jié)扎完畢后依次縫合，關(guān)閉胸 腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出lcc氣體以恢復(fù)胸腔內(nèi)負(fù)壓，拔出注射器后迅速縫 合皮膚切口。假手術(shù)組（Sham)在游離出主動(dòng)脈降支后只穿線不結(jié)扎，其余步驟同心肌肥厚 (AB)模型組。
[0042] 1.3術(shù)后護(hù)理 主動(dòng)脈弓降支結(jié)扎術(shù)后，待小鼠出現(xiàn)自主呼吸、夾趾出現(xiàn)強(qiáng)烈反應(yīng)，拔出氣管插管，并 將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養(yǎng)籠內(nèi)，于飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。
[0043] 2.取材：打開分析天平，調(diào)零備用。再稱重處死小鼠。眼科彎鑷夾住心耳下方的 血管蒂，剪下心臟，迅速置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內(nèi)液體，蘸干表面液體后，稱重并記 錄，將心臟放入相應(yīng)的凍存管中，迅速置于液氮罐中，于_80°C冰箱保存后用于分子生物學(xué) 檢測(cè)。
[0044] 3. SH2B1在Sham小鼠和AB小鼠心臟中的表達(dá) 分別選野生型Sham小鼠和AB手術(shù)后4周及8周的心臟，對(duì)心臟提取蛋白質(zhì)進(jìn)行 SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)（Western blot)，結(jié)合特異性識(shí)別SH2B1蛋白及心肌細(xì)胞肥大標(biāo) 志物ΑΝΡ、β -MHC的抗體進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其SH2B1的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，心肌細(xì)胞肥 大標(biāo)志物在ΑΒ術(shù)后ΑΝΡ、β -MHC的表達(dá)明顯上調(diào)，SH2B1的表達(dá)在ΑΒ術(shù)后明顯上調(diào)。
[0045] 實(shí)施例3 SH2B1干擾（Adsh SH2B1)及過表達(dá)（Ad SH2B1)腺病毒對(duì)Ang II刺激的 原代心肌細(xì)胞SH2B1表達(dá)的影響 1.原代新生SD大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) (1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，頸部以下75%酒精消毒，用眼科剪和顯微鑷取 下心臟，放入盛有10mL DMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重復(fù)以上過程。
[0046] (2)用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗心臟，并將心臟剪成l-2mm3的碎片。轉(zhuǎn)入到放有轉(zhuǎn)子 的血清瓶中，吸去DMEM/F12,加入胰酶消化液。轉(zhuǎn)速為120r/min，消化15min，靜止數(shù)秒鐘， 棄去上清液。
[0047] (3)加入胰酶消化液，轉(zhuǎn)速為120r/min，消化15min。靜止數(shù)秒鐘，吸取上清液，用 20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，并置于4°C冰箱保存。重復(fù)該步驟，循環(huán)若干次。 取上清時(shí)應(yīng)盡量取盡，當(dāng)組織塊變白并明顯變小時(shí)，終止消化。
[0048] (4)將收集好的心肌細(xì)胞懸液，以1500rpm轉(zhuǎn)速離心8min，棄去上清液。在離心管 中加入適量培養(yǎng)基，輕柔吹打重懸細(xì)胞，集中至1個(gè)50mL離心管中，細(xì)胞懸液用細(xì)胞40 μ m 過濾網(wǎng)過濾。
[0049] (5)將細(xì)胞接種在100mm的培養(yǎng)皿中，差時(shí)貼壁90min，吸取未貼壁的細(xì)胞懸液過 濾。根據(jù)細(xì)胞懸液的總量加入Brdu (終濃度0. ImM)，混勻之后，加入到用0. 1%明膠包被的 器皿中。
[0050] (6)輕搖分散細(xì)胞，勿漩渦搖晃。37°C、5% C02孵育48小時(shí)用PBS清洗1次，更換 培養(yǎng)基。
[0051] 2. SH2B1干擾（Adsh SH2B1)及過表達(dá)（Ad SH2B1)腺病毒對(duì)經(jīng)Ang II誘導(dǎo)的心 肌細(xì)胞肥大模型的影響 AdshRNA (含 shRNA (沉默 RNA)的腺病毒，用作對(duì)照，SABIOSCIENCES 公司）、Adsh SH2B1 (含shRNA- SH2B1 (沉默RNA- SH2B1融合蛋白）的腺病毒，購自SABIOSCIENCES公司，貨號(hào) KR45212G)、AdGFP (含GFP (綠色熒光蛋白）的腺病毒，用作對(duì)照，購自Vector Biolabs公 司，貨號(hào)1060)及Ad SH2B1腺病毒(含GFP-SH2B1綠色熒光蛋白-SH2B1融合蛋白）的腺 病毒，購自Vector Biolabs公司，貨號(hào)ADV-271872) 10 MOIs分別感染培養(yǎng)3天的原代心 肌細(xì)胞，12小時(shí)后用1 μ Μ血管緊張素 II (Ang II )(購自Sigma公司，A9525)或?qū)φ誔BS刺 激48小時(shí)，然后進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果表明Adsh SH2B1腺病毒感染后的心肌細(xì)胞表面 面積較AdshRNA對(duì)照組減少，而經(jīng)Ad SH2B1感染的心肌細(xì)胞表面面積則比對(duì)照組AdGFP明 顯增加（圖3)。說明SH2B1的干擾腺病毒抑制心肌細(xì)胞肥大；SH2B1的過表達(dá)腺病毒促進(jìn)心 肌細(xì)胞肥大。
[0052] 實(shí)施例4小鼠心肌肥厚（AB)模型心肌肥厚及纖維化檢測(cè) 1.心肌肥厚模型采用主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，模型操作流程： 選用8-10周齡、體重在23. 5-27. 5g的野生型小鼠、SH2B1基因敲除小鼠、心臟特異性 SH2B1轉(zhuǎn)基因小鼠及非轉(zhuǎn)基因小鼠各分成假手術(shù)組和心肌肥厚模型組，每組10只小鼠。造 模方法同實(shí)施例2。
[0053] 2.取材 (1)前期工作：預(yù)先準(zhǔn)備裝有20mL的體積分?jǐn)?shù)10%甲醛的尿杯，并貼好標(biāo)簽(小鼠編號(hào)、 組別、手術(shù)類型及取材日期)。將倒?jié)M質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% KC1溶液的培養(yǎng)皿置于取材處。打開分 析天平，調(diào)零備用。再稱重處死小鼠。
[0054] (2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% KC1 溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內(nèi)液體，蘸干表面液體后， 稱重并記錄，將心臟放入相應(yīng)的尿杯中，固定48h后用于病理學(xué)檢測(cè)。
[0055] (3)相關(guān)測(cè)量及計(jì)算：取出小鼠肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開小鼠后 肢脛骨處皮膚，測(cè)量并記錄脛骨長度。計(jì)算心重與體重的比值（HW/BW)，肺重與體重的比值 (LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值（HW/TL)。
[0056] 3.病理學(xué)檢測(cè) 3. 1制備石錯(cuò)標(biāo)本切片 主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一 切片一攤片一晾干或烘烤后備用。
[0057] 3.2蘇木精-伊紅（HE)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -雙蒸水lmin -蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70%酒精充分混合均勻）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氫鈉0. 35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶于100mL蒸饋水）lmin -水洗 lmin -伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024) 3_5min -蒸饋水洗去浮色一70%酒精I(xiàn)s - 95%酒 精I(xiàn)s - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風(fēng)櫥內(nèi)吹干， 顯微鏡拍照。
[0058] HE染色圖片統(tǒng)計(jì)：每張圖片選擇3個(gè)以上邊界清楚，核大致位于中央的細(xì)胞，用 Image-Pro Plus 6. 0軟件圈細(xì)胞面積。
[0059] 3. 3天狼星紅（PSR)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精lmin - 95%酒 精lmin - 70%酒精lmin -流水沖洗lOmin -雙蒸水lmin -質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 2%磷鑰酸 2min - 0. 1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min -去除殘液一0. 01N鹽 酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲 苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0060] PSR染色圖片統(tǒng)計(jì)（Image-Pro Plus 6. 0軟件):膠原比例=膠原面積/(總面積-空 白面積）X 1〇〇%。
[0061] 心肌組織由心肌細(xì)胞和間質(zhì)組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細(xì)胞失去增 殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細(xì)胞反應(yīng)，只能是單個(gè)細(xì)胞的體積增大而不能 在數(shù)量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過程中，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大，肌節(jié) 數(shù)量增多，細(xì)胞排列紊亂，心臟間質(zhì)改變包括心肌成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，膠原纖維密度 增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調(diào)等。
[0062] SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型后的表型結(jié)果見圖4-6。Sham (假手術(shù)）組 中SH2B1+/+小鼠和SH2B1-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； SH2B1+/+ 小鼠 AB 術(shù)后 4 周的 HW/BW、LW/BW、HW/TL 高于其 Sham 組；AB 術(shù)后 4 周，SH2B1-/-小 鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均較SH2B1+/+小鼠降低（圖4)。HE染色切片可觀察到：Sham組 心臟無明顯差異，AB組較Sham組的心臟均增大，SH2B1-/-小鼠的心臟明顯小于SH2B1+/+ 組小鼠；Sham組心肌肌原纖維細(xì)胞排列整齊、致密，形態(tài)完整，胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰；AB組 肌絲排列紊亂、松散，心肌細(xì)胞體積明顯增大，形態(tài)不規(guī)整，胞核深染、增大、畸形，核仁模 糊，SH2B1-/-組則無 SH2B1+/+組細(xì)胞肥大明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5)。PSR染色后，發(fā) 現(xiàn)AB組心室心肌間質(zhì)膠原含量較Sham組增加，動(dòng)脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增 粗，排列紊亂成網(wǎng)絡(luò)狀；SH2B1-/-小鼠 AB術(shù)后膠原含量及血管周圍膠原含量則比SH2B1+/+ 小鼠 AB術(shù)后增加較少（圖6)。以上結(jié)果說明經(jīng)AB模型后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚， SH2B1-/-小鼠的心肌肥厚程度小于SH2B1+/+小鼠。
[0063] 圖7-9是NTG和SH2B1-TG小鼠 AB模型后的表型結(jié)果。同樣TG小鼠 AB術(shù)后4周 的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術(shù)后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增 大的程度明顯大于NTG小鼠（圖7)。心臟表型，AB組較Sham組的心臟均增大，且AB術(shù)后TG 小鼠心臟增大的程度遠(yuǎn)大于NTG小鼠。HE染色切片可觀察到：TG小鼠 AB術(shù)后心肌細(xì)胞橫 截面積大于Sham組，顯著大于NTG小鼠 AB組（圖8)。PSR染色可見，TG小鼠 AB術(shù)后心肌 間質(zhì)膠原含量及血管周圍膠原含量均大于NTG小鼠 AB組（圖9)。以上結(jié)果說明經(jīng)AB模型 后，小鼠發(fā)生明顯的心肌肥厚，SH2B1-TG小鼠的心肌肥厚程度大于NTG小鼠。
[0064] 實(shí)施例5心肌肥厚（AB)模型小鼠心功能檢測(cè) 1超聲檢測(cè)心功能 1. 1前期準(zhǔn)備 (1)麻醉機(jī)準(zhǔn)備：先連接氧氣瓶和麻醉機(jī)上的進(jìn)氣接口，再擰開麻醉機(jī)上加藥口密封 蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調(diào)整流量控制閥的旋 鈕，出氣壓力維持在〇· 2-0. 3mPa。
[0065] (2)待測(cè)小鼠準(zhǔn)備：待檢測(cè)小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區(qū)剃毛，將處理好的 小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi)，以1. 5-2. 0%異氟烷維持小鼠穩(wěn)定的麻醉狀態(tài)。
[0066] 1.2心功能檢測(cè) 小鼠取左側(cè)臥位或仰臥位，并在剃毛區(qū)均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司）。采用高 頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標(biāo)準(zhǔn)左心室乳頭肌短軸切面，測(cè)量、左室舒張末期內(nèi)徑 (LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD)及短軸縮短率（FS)。
[0067] 2心臟導(dǎo)管超聲（PV)檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué) 2. 1前期準(zhǔn)備 (1)麻醉機(jī)準(zhǔn)備：同超聲檢測(cè)心功能部分。
[0068] (2)待測(cè)小鼠準(zhǔn)備：待檢測(cè)小鼠用異氟烷迅速麻醉后，頸部手術(shù)區(qū)剃毛，并用濕紗 布擦拭去毛。將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導(dǎo)管套頭內(nèi)，以1. 5-2. 0%異氟烷以維持麻醉 深度，避免麻醉過深或過淺。
[0069] 2. 2 PV 檢測(cè) 碘酒及75%酒精消毒后，剪開小鼠頸部皮膚，依次分離肌肉和軟組織，并游離出右頸總 動(dòng)脈，于血管下穿過雙線并結(jié)扎遠(yuǎn)心端，同時(shí)活結(jié)結(jié)扎近心端。用血管剪在遠(yuǎn)心端剪一切口 (1/3-1/2管徑)，于體視顯微鏡下將Millarl. 4F超微導(dǎo)管迅速插入右頸總動(dòng)脈，同時(shí)穿一 縫線將導(dǎo)管和血管結(jié)扎。打開近心端活結(jié)，將導(dǎo)管沿右頸總動(dòng)脈-升主動(dòng)脈插入左心室內(nèi)， 連接Powerlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)。觀察記錄儀上波形情況，調(diào)節(jié)導(dǎo)管的位置使波形圖 清晰且穩(wěn)定。監(jiān)測(cè)射血分?jǐn)?shù)（EF)、左室內(nèi)壓最大上升速率（dP/dt max)及左室內(nèi)壓最小上 升速率（dP/dt min)等指標(biāo)。
[0070] 圖10是SH2B1+/+和SH2B1-/-小鼠 AB模型后心功能檢測(cè)結(jié)果圖。與SH2B1+/+ Sham組相比，SH2B1+/+小鼠 AB術(shù)后4周表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚，主要表現(xiàn)為心肌肥 厚的指標(biāo)LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指標(biāo)FS則下降。AB術(shù)后4周， SH2B1-/-小鼠心肌肥厚的指標(biāo)增大的程度及反映心功能的指標(biāo)下降的程度小于SH2B1+/+ 小鼠（圖10A)。通過血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，觀察到AB術(shù)后4周SH2B1+/+小鼠 EF、dP/dt max和dP/dt min均比其Sham組降低，AB術(shù)后SH2B1-/-小鼠比SH2B1+/+小鼠 AB組的EF、 dP/dt max和dP/dt min降低較少（圖10B)。這些結(jié)果均與SH2B1-/-小鼠心肌肥厚程度較 小的結(jié)果一致。
[0071] 圖11是NTG和SH2B1-TG小鼠 AB模型后的超聲和PV檢測(cè)結(jié)果。與NTG Sham組 相比，NTG小鼠 AB術(shù)后4周表現(xiàn)出心功能減弱和心肌肥厚。主要表現(xiàn)為心肌肥厚的指標(biāo) LVEDD、LVESD增大，而反映心功能的指標(biāo)EF、FS則下降。AB術(shù)后4周，與NTG小鼠相比，TG 小鼠心肌肥厚的指標(biāo)增大的程度及反映心功能的指標(biāo)下降的程度則大于NTG組（圖11A)。 通過血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，觀察到AB術(shù)后4周NTG小鼠 EF、dP/dt max和dP/dt min均 比其Sham組降低，TG小鼠 AB術(shù)后EF、dP/dt max和dP/dt min降低的程度則大于NTG組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖11B)。
[0072] 實(shí)施例6 SH2B1基因敲除抑制Jak2/Stat3信號(hào)通路的激活；SH2B1基因過表達(dá) 促進(jìn)Jak2/Stat3信號(hào)通路的激活 用野生型小鼠、SH2B1基因敲除小鼠及心臟特異性SH2B1轉(zhuǎn)基因小鼠和非轉(zhuǎn)基因小 鼠分別進(jìn)行假手術(shù)和主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)，在術(shù)后4周對(duì)各組小鼠心臟提取蛋白質(zhì)進(jìn)行 SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)（Western blot)，檢測(cè)Jak2/Stat3信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況， GAPDH (Cell Signaling Technology，2118)作為內(nèi)參。結(jié)果顯示 AB 手術(shù)后 Jak2/Stat3 信 號(hào)通路被激活，敲除 SH2B1 基因后 p-Jak2 (Cell Signaling Technology, 3776)、p_Stat3 (Cell Signaling Technology,9145)的蛋白表達(dá)水平要低于其對(duì)照野生型小鼠組，總的蛋 白 T_Jak2 (Cell Signaling Technology，3230)、T_Stat3 (Bioworld，BS1336)在 Sham 及 AB的各組小鼠間均無明顯差異（圖12) ;SH2B1基因過表達(dá)后p-Jak2、p-Stat3的蛋白表達(dá) 水平要高于其對(duì)照NTG小鼠，總的蛋白T-Smad2、T-Smad3在Sham及AB的各組小鼠間均無 明顯差異（圖13)。
[0073] 由以上結(jié)果可知發(fā)生心肌肥厚時(shí)，SH2B1表達(dá)會(huì)上調(diào)，SH2B1基因缺陷顯著抑制了 心肌肥厚、纖維化，保護(hù)心功能，SH2B1基因過表達(dá)顯著促進(jìn)了心肌肥厚、纖維化，惡化心功 能。因此SH2B1基因具有惡化心功能和促進(jìn)心肌肥厚及纖維化的作用，特別是SH2B1基因 能夠惡化主動(dòng)脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關(guān)疾病發(fā)生的作用。
[0074] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. SH2B1作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)心臟功能的藥物中的應(yīng)用。 2. SH2B1作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用。 3. SH2B1的抑制劑在制備保護(hù)心臟功能的藥物中的應(yīng)用。
4. 一種保護(hù)心臟功能的藥物，其特征在于：包含SH2B1的抑制劑。 5. SH2B1的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物中的應(yīng)用。
6. -種預(yù)防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，其特征在于：包含SH2B1的抑制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的SH2B1的抑制劑為SH2B1基 因的siRNA、SH2Bl基因的RNA干擾載體或SH2B1的抗體及其他能夠抑制SH2B1表達(dá)的抑制 劑中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4或6所述的藥物，其特征在于：所述的SH2B1的抑制劑為SH2B1基 因的siRNA、SH2Bl基因的RNA干擾載體或SH2B1的抗體及其他能夠抑制SH2B1表達(dá)的抑制 劑中的一種。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104141012SQ201410376652
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】李紅良, 蔣丁勝, 蔣曦, 張曉東 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)