一種工程細胞系及其構(gòu)建方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種工程細胞系，該細胞系為粉紋夜蛾Tn5細胞系，且該Tn5細胞系攜帶受桿狀病毒感染時能表達的報告基因。當重組桿狀病毒感染上述Tn5細胞時，一旦重組桿狀病毒在Tn5細胞中復(fù)制，就會啟動報告基因的表達，產(chǎn)生報告蛋白。通過監(jiān)測報告蛋白，可以更為直觀的觀察到重組桿狀病毒對細胞的感染情況。
【專利說明】一種工程細胞系及其構(gòu)建方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種昆蟲工程細胞系及其建立方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（Baculovirus Expression Vector System,以下簡稱 BEVS)是利用攜帶有外源目的基因的重組桿狀病毒作載體，在昆蟲體內(nèi)或其培養(yǎng)細胞內(nèi)進 行表達的一個重組蛋白表達系統(tǒng)。
[0003] 與其它表達系統(tǒng)相比較，該系統(tǒng)能獲得重組蛋白高水平的表達，最高可使重組蛋 白的表達量達到細胞總蛋白的50%。獲得的重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，并能在BEVS 內(nèi)完成完整的翻譯后加工，包括糖基化、磷酸化、?；?、信號肽切除及肽段的切割和分解 等，修飾的位點與天然蛋白在細胞內(nèi)的情況完全一致。另外，該系統(tǒng)能同時表達多個基因， 既可采用不同的重組病毒同時感染細胞的形式，也可采用在同一轉(zhuǎn)移載體上同時克隆兩個 外源基因的形式。除此之外，該系統(tǒng)還能對重組蛋白進行定位，如將核蛋白轉(zhuǎn)送到細胞核 上，膜蛋白定位在膜上，分泌蛋白則可分泌到細胞外等。
[0004] 為了在BEVS中最大程度地表達重組蛋白質(zhì)，確定重組桿狀病毒與細胞的合適比 例（即感染復(fù)數(shù)）是非常重要的。為使重組桿狀病毒在合適的感染復(fù)數(shù)下感染細胞，必須 測定病毒滴度。
[0005] 近年來，越來越多的病毒滴度檢測方法相繼出現(xiàn)，如，桿狀病毒囊膜蛋白（簡稱 gp64)抗體檢測法、多聚酶鏈式反應(yīng)（以下簡稱PCR)法及重組桿狀病毒攜帶綠色熒光蛋白 基因（以下簡稱gfp)或β-半乳糖苷酶基因 Z (簡稱LacZ基因）等，但各自都有一些缺 陷。如，gp64抗體檢測法和PCR法只能定量總病毒數(shù)，不能定量活病毒數(shù)。而采用重組桿 狀病毒攜帶gfp或LacZ基因的方法需要在構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體時使用雙啟動子，使重組桿狀病毒 同時表達目的蛋白和報告蛋白。
[0006] 目前，重組桿狀病毒較為常見的是采用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒 (Autographa californica nucleopolyhedrovirus，以下簡稱 AcMNPV)。在檢測重組桿狀病 毒滴度過程中，AcMNPV對草地貪夜蛾（簡稱Sf9)細胞系不是十分敏感，因此不能得到較為 真實的桿狀病毒滴度。因此，使用Sf9細胞系檢測重組桿狀病毒滴度，數(shù)據(jù)并不準確。
[0007] 同時，由于重組桿狀病毒產(chǎn)生的比例很低（通常只有0. 1%-1%)，傳統(tǒng)的空斑篩 選技術(shù)篩選重組桿狀病毒費時費力，即使技術(shù)熟練的研究者也需1一2個月才能完成，且得 到的病毒粒純度不高。鑒于此，亟待一些新技術(shù)能更簡化重組桿狀病毒的篩選。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種能更準確測定病毒滴度、簡化重組桿狀病毒空斑篩 選，得到更高純度的病毒粒的攜帶報告基因的粉紋夜蛾（Trichoplusiani，以下簡稱Tn5) 細胞系及其構(gòu)建方法和用途。
[0009] 本發(fā)明提出一種工程細胞系，所述該細胞系為Τη5細胞系，且該Τη5細胞系攜帶報 告基因。
[0010] 優(yōu)選地，所述報告基因為gfp，該gfp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 本發(fā)明還提出一種構(gòu)建上述工程細胞系的方法，其包括以下步驟：
[0012] S10,獲取外源DNA片段。其中，所述外源DNA片段指順次連接的下列基因及啟動 子：位于上游的桿狀病毒603基因、啟動報告基因表達的晚期啟動子、受桿狀病毒感染時能 表達的報告基因、標記基因、啟動標記基因表達的極早期啟動子、位于下游的桿狀病毒1629 基因。
[0013] S20,將上述外源DNA片段膠回收后與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒連接，再導(dǎo)入感受態(tài)細胞中，經(jīng)酶 切鑒定，得到含所述外源DNA片段的重組質(zhì)粒。
[0014] S30,提取適量經(jīng)步驟S20得到的重組質(zhì)粒的DNA加入到適量轉(zhuǎn)染試劑中，靜置培 養(yǎng)一段時間，形成重組質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)復(fù)合體。
[0015] S40,將上述重組質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)復(fù)合體加入到Tn5細胞中，混勻后靜置培養(yǎng)。
[0016] S50,利用標記基因特性對經(jīng)步驟S40得到的Τη5細胞系進行篩選，對篩選后的細 胞進行桿狀病毒感染，根據(jù)報告基因的表達情況，選取表達度最高的細胞進行亞克隆，獲取 穩(wěn)定的、攜帶報告基因的Τη5細胞系。
[0017] 優(yōu)選地，步驟S10中所述的啟動報告基因表達的晚期啟動子為桿狀病毒的晚期強 啟動子（以下實施例中采用桿狀病毒的ΡΗ啟動子，簡稱ΡΗρ)，所述報告基因為gfp，所述標 記基因為潮霉素 B抗性基因（以下簡稱hygB)，所述啟動標記基因表達的極早期啟動子為 桿狀病毒極早期基因啟動子-1 (以下簡稱IElp)。其中，所述桿狀病毒603基因和所述ΡΗρ 連接后構(gòu)成的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述hygB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，所述IElp核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述桿狀病毒1629基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0. 5所示，所獲得的外源DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示。
[0018] 當然，其它實施方式中，啟動報告基因表達的晚期啟動子也可以為桿狀病毒的pio 啟動子等。
[0019] 優(yōu)選地，步驟S20中所述的感受態(tài)細胞為ToplO細胞；所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒為 pBlueScriptIISK(+)，所述pBlueScriptIISK(+)的核苷酸序列如SEQIDN0·6所不；步 驟S20中所述的含所述外源DNA片段的重組質(zhì)粒為BlueBac-GFP/HYG，所述BlueBac-GFP/ HYG的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0020] 優(yōu)選地，步驟S30中使用的轉(zhuǎn)染劑為Gene Juice。
[0021] 本發(fā)明還提出了一種上述工程細胞系的用途，該工程細胞系應(yīng)用于重組桿狀病毒 領(lǐng)域。
[0022] 優(yōu)選地，該工程細胞系應(yīng)用于重組桿狀病毒滴度檢測。
[0023] 優(yōu)選地，該工程細胞系應(yīng)用于空斑篩選單粒重組桿狀病毒。
[0024] 優(yōu)選地，該工程細胞系應(yīng)用于指導(dǎo)和規(guī)?；a(chǎn)重組桿狀病毒攜帶的外源基因的 表達產(chǎn)物。
[0025] 當重組桿狀病毒感染上述Tn5細胞時，一旦重組桿狀病毒在Tn5細胞中復(fù)制，就會 啟動報告基因的表達，產(chǎn)生報告蛋白。通過監(jiān)測報告蛋白，可以更為直觀的觀察到重組桿狀 病毒對細胞的感染情況，因而可以廣泛應(yīng)用于重組桿狀病毒領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為重組質(zhì)粒BlueBac-GFP/HYG的示意圖。
[0027] 圖2為病毒滴度實驗中，在終點稀釋濃度梯度下，桿狀病毒感染含gfp的Tn5系細 胞（以下簡稱Τη5ΕΤ&Ρ細胞）4天時，在熒光顯微鏡下的GFP陽性結(jié)果。
[0028] 圖3為空斑篩選單粒病毒實驗中，桿狀病毒感染Τη5ΕΤ&Ρ細胞48小時時，在熒光 顯微鏡下的病毒空斑結(jié)果。
[0029] 圖4為桿狀病毒感染Τη5ΕΤ&Ρ細胞3天時，在熒光顯微鏡下GFP效果。

【具體實施方式】
[0030] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0031] 本發(fā)明提供了一種工程細胞系，該細胞系為Τη5細胞系，且該Τη5細胞系攜帶受桿 狀病毒感染時能表達的報告基因。
[0032] 作為優(yōu)選實施方式，上述報告基因為gfp，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0. 2所示。在 其他實施方式中，也可以是青色、黃色、橙色和深紅色熒光蛋白基因；當然，也可根據(jù)實驗需 要，選擇其它種類的報告基因。
[0033] 當重組桿狀病毒感染上述Tn5細胞時，一旦重組桿狀病毒在Tn5細胞中復(fù)制，即 在Τη5細胞中啟動報告基因的表達，產(chǎn)生報告蛋白。通過監(jiān)測報告蛋白，可以更為直觀的觀 察到重組桿狀病毒對細胞的感染情況，對于重組桿狀病毒的空斑篩選具有直觀和簡化的效 果，得到的病毒粒的純度更高。且，重組桿狀病毒對本發(fā)明構(gòu)建的Τη5細胞系更為敏感，與 Sf9細胞系相比，本發(fā)明得到的重組桿狀病毒的滴度更高，得到的病毒滴度數(shù)據(jù)更為準確。
[0034] 本發(fā)明還提出一種構(gòu)建上述工程細胞系的方法，其包括如下步驟：
[0035] S10,獲取外源DNA片段。所述外源DNA片段指順次連接的下列基因及啟動子：位于 上游的桿狀病毒603基因，啟動報告基因表達的晚期啟動子、受桿狀病毒感染時能表達的 報告基因、標記基因、啟動標記基因表達的極早期啟動子、位于下游的桿狀病毒1629基因。
[0036] 優(yōu)選地，本實施例中，步驟S10中所述的啟動報告基因表達的晚期啟動子為桿狀 病毒的晚期強啟動子PHp，所述報告基因為gfp，所述標記基因為hygB，所述啟動標記基因 表達的極早期啟動子為IElp。其中，所述桿狀病毒603基因和所述PHp連接后構(gòu)成的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述hygB的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述IElp核苷 酸序列如SEQ ID N0. 4所示，所述桿狀病毒1629基因的核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示， 所獲得的外源DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0037] 需要注意的是，在其它實施方式中，步驟S10中所述的啟動報告基因表達的晚期 啟動子也可以為桿狀病毒的晚期強啟動子P10等。
[0038] S20,將上述外源DNA片段膠回收后與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒連接，再導(dǎo)入感受態(tài)細胞中，經(jīng)酶 切鑒定，得到含外源DNA片段的重組質(zhì)粒。
[0039] 優(yōu)選地，感受態(tài)細胞為ToplO ;所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒為pBlueScript II SK(+)，該 pBlueScript II SK(+)的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；所獲得的含外源DNA片段的重 組質(zhì)粒為BlueBac-GFP/HYG，所述BlueBac-GFP/HYG的核苷酸序列如SEQ ID N0. 8所示。
[0040] S30,取適量轉(zhuǎn)染試劑，加入到適量培養(yǎng)基中，混勻靜置，再加入適量經(jīng)步驟S20得 到的重組質(zhì)粒的DNA，靜置培養(yǎng)一段時間，形成重組質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)復(fù)合體。
[0041] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染試劑為Gene Juice。
[0042] S40,將上述重組質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)復(fù)合體加入到Tn5細胞中，混勻后靜置培養(yǎng)。
[0043] 優(yōu)選地，Τη5細胞選擇處于對數(shù)生長期的細胞。
[0044] S50,利用標記基因特性對經(jīng)步驟S40得到的Τη5細胞系進行篩選，對篩選后的細 胞進行桿狀病毒感染，根據(jù)報告基因的表達情況，選取表達度最高的細胞進行亞克隆，獲取 穩(wěn)定的，攜帶報告基因且能在被桿狀病毒感染時表達的Τη5細胞系。
[0045] 通過本方法構(gòu)建的攜帶報告基因的Τη5細胞系，能維持和表達報告基因，并能穩(wěn) 定傳代。
[0046] 進一步地，本實施例中，步驟S10包括順次進行的以下幾步：
[0047] S11，獲取外源DNA片段。
[0048] 以本發(fā)明實施例1為例，603、ΡΗρ、ΙΕ1ρ、1629片段來源于苜蓿銀紋蛾核型多角 體病毒（以下簡稱AcMNPV) ;gfp基因片段來源于pEGFP-Nl質(zhì)粒；hygB基因片段來源于 pIREShyg3質(zhì)粒。其中，603和PHp連接后的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，gfp基因的 核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，hygB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，IElp的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，1629的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0049] S12,引物對設(shè)計。（如下表）其中，引物購自武漢天一輝遠生物科技有限公司。
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種工程細胞系，其特征在于，該細胞系為粉紋夜蛾細胞系，且該粉紋夜蛾細胞系攜 帶受桿狀病毒感染時能表達的報告基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的工程細胞系，其特征在于，所述報告基因為綠色熒光蛋白基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. -種構(gòu)建如權(quán)利要求2所述的工程細胞系的方法，其包括以下步驟： S10,獲取外源DNA片段，所述外源DNA片段指順次連接的下列基因及啟動子：位于上游 的桿狀病毒603基因、啟動報告基因表達的晚期啟動子、受桿狀病毒感染時能表達的報告 基因、標記基因、啟動標記基因表達的極早期啟動子、位于下游的桿狀病毒1629基因； S20,將上述外源DNA片段膠回收后與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒連接，再導(dǎo)入感受態(tài)細胞中，經(jīng)酶切鑒 定，得到含所述外源DNA片段的重組質(zhì)粒； S30,提取經(jīng)步驟S20得到的重組質(zhì)粒的DNA加入到轉(zhuǎn)染試劑中，靜置培養(yǎng)一段時間，形 成重組質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)復(fù)合體； S40,將上述重組質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)復(fù)合體加入到粉紋夜蛾細胞中，混勻后靜置培養(yǎng)； S50,利用標記基因特性對經(jīng)步驟S40得到的粉紋夜蛾細胞系進行篩選，對篩選后的細 胞進行桿狀病毒感染，根據(jù)報告基因的表達情況，選取表達度最高的細胞進行亞克隆，獲取 穩(wěn)定的、攜帶報告基因的粉紋夜蛾細胞系。
4. 如權(quán)利要求3所述的工程細胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S10中所述的啟動 報告基因表達的晚期啟動子為桿狀病毒的晚期強啟動子，所述報告基因為綠色熒光蛋白基 因，所述標記基因為潮霉素 B抗性基因，所述啟動標記基因表達的極早期啟動子為桿狀病 毒極早期啟動子-1 ;其中，所述桿狀病毒603基因和所述桿狀病毒的晚期強啟動子連接后 構(gòu)成的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述潮霉素 B抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，所述桿狀病毒極早期啟動子-1核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述桿狀病毒 1629基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，所獲得的外源DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7 所示。
5. 如權(quán)利要求4所述的工程細胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S20中所述的感受態(tài) 細胞為 ToplO 細胞；所述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒為 pBlueScript II SK(+)，所述 pBlueScript II SK(+) 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；步驟S20中所述的含所述外源DNA片段的重組質(zhì)粒為 BlueBac-GFP/HYG，所述 BlueBac-GFP/HYG 的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 8 所示。
6. 如權(quán)利要求3所述的工程細胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S30中使用的轉(zhuǎn)染劑 為 Gene Juice。
7. -種如權(quán)利要求1或2所述的工程細胞系的用途，其特征在于，該工程細胞系應(yīng)用于 重組桿狀病毒領(lǐng)域。
8. 如權(quán)利要求7所述的工程細胞系的用途，其特征在于，該工程細胞系應(yīng)用于重組桿 狀病毒滴度檢測。
9. 如權(quán)利要求7所述的工程細胞系的用途，其特征在于，該工程細胞系應(yīng)用于空斑篩 選單粒重組桿狀病毒。
10. 如權(quán)利要求7所述的工程細胞系的用途，其特征在于，該工程細胞系應(yīng)用于指導(dǎo)和 規(guī)?；a(chǎn)重組桿狀病毒攜帶的外源基因的表達產(chǎn)物。
【文檔編號】C12N15/85GK104195111SQ201410378780
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月1日
【發(fā)明者】譚業(yè)平, 李曉峰, 孫彥濤, 袁麗, 湯軍芝 申請人:武漢金益肽生物有限公司