乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建及應(yīng)用，具體是通過基因工程的方法將粗糙脈孢霉(Neurospora?crassa)來源的木糖還原酶基因，樹干畢赤酵母(Scheffersomyces?stipitis)的木糖醇脫氫酶突變基因，以及下游的一系列基因在耐熱酵母馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces?marxianus)中高效表達(dá)或敲除，使該菌株通過木糖代謝路徑在較高溫度(>42℃)下，能夠高效地利用和發(fā)酵木糖，大量快速生產(chǎn)乙醇。所述酵母菌株可以在42℃的條件下，快速高效利用高濃度木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,產(chǎn)量和發(fā)酵速率都超過已報(bào)道的耐熱菌株。
【專利說明】乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。尤其涉及通過工程菌株改造來提高高溫下利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地，本發(fā)明構(gòu)建了能夠在高溫條件下利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇且乙醇生產(chǎn)速率和產(chǎn)量大幅度提高的耐熱工程酵母菌株。

【背景技術(shù)】
[0002]木糖是半纖維素生物質(zhì)水解的主要產(chǎn)物，是世界上第二富集的發(fā)酵原料(Zhanget al.，2011)。作為木質(zhì)半纖維素水解產(chǎn)物中含量最多的五碳糖，木糖無疑是從可再生生物質(zhì)中生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的關(guān)鍵(Sasaki et al.，2010)。
[0003]乙醇是醇類的一種，是酒的主要成份，所以也俗稱酒精。乙醇的用途很廣，可以用作溶劑，作為有機(jī)合成的原料，用于各種化合物的結(jié)晶，還可以作為洗滌劑和萃取劑，食用酒精可以勾兌白酒。乙醇在化工行業(yè)也有很重要的用途。生物乙醇最重要的用途是在能源領(lǐng)域。乙醇可以調(diào)入汽油，作為車用燃料，乙醇汽油也被稱為(E型汽油)，它可以改善油品的性能和質(zhì)量，降低一氧化碳、碳?xì)浠衔锏戎饕廴疚锱欧拧?br> [0004]采用耐熱酵母馬克思克魯維酵母(K.marxianus)在高溫下發(fā)酵有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):
1.高溫下發(fā)酵可以降低發(fā)酵中的冷卻費(fèi)用；2.纖維素酶等的最適催化溫度較高，高溫會(huì)提高以淀粉、纖維素等生物質(zhì)為原料的同步糖化發(fā)酵(SSF)效率，促進(jìn)糖化，減少在酶上的費(fèi)用(Fonseca et al., 2008 ；Zhang et al., 2013) ；3.能在耐熱范圍內(nèi)生存的微生物較少，因此，高溫會(huì)降低污染的風(fēng)險(xiǎn)(Kumar et al., 2009 ；Zhang et al.，2013)。除此之外，馬克思克魯維酵母是一種GRAS (general regarding as safe)酵母,廣泛的在乳制品、葡萄酒發(fā)酵制造中存在，對(duì)環(huán)境、動(dòng)物及人類是安全的微生物。它能夠在較高的溫度下生長，最高達(dá)52°C，具有很高的生長速率(0.86 - 0.99h-1，40°C ) (Banat and Marchant, 1995)。馬克思克魯維酵母有很高的代謝多樣性，能利用多種工業(yè)上的底物糖類生長發(fā)酵。能利用多種廉價(jià)底物、耐熱、高生長率等特點(diǎn)，使其被認(rèn)為是替代釀酒酵母用來進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵和外源蛋白表達(dá)的候選者。由于馬克思克魯維酵母有很多比釀酒酵母優(yōu)秀的品質(zhì)，馬克思克魯維酵母被越來越多的用于生物能源的生產(chǎn)(Fonseca et al.，2008)。所以利用馬克思克魯維酵母發(fā)展成乙醇生產(chǎn)菌株具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 已經(jīng)有一些關(guān)于利用耐熱酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的研究，其中，Rodrussamee等利用馬克思克魯維酵母可以在40 °C利用木糖生產(chǎn)2.2g/的乙醇(Rodrussamee etal.，2011)。Zhang等利用樹干畢赤酵母的木糖還原酶突變體替換馬克思克魯維酵母的木糖還原酶，可以利用40g/L的木糖在42°C生產(chǎn)4.51g/L的乙醇(Zhang et al.，2013)。Wang等構(gòu)建木糖異構(gòu)酶途徑代替馬克思克魯維酵母本身的XYL1-XYL2系統(tǒng)，可以利用50g/L的木糖在 42°C 生產(chǎn) 11.52g/L 的乙醇(Wang et al.，2013)。Kumar 等利用 Kluyveromycessp.1IPE453 發(fā)酵木糖在 50°C產(chǎn)生 1.75g/L 乙醇(Kumar et al., 2009)。Goshima 等利用基因工程改造的馬克思克魯維酵母DMB3-7可以在42°C發(fā)酵木糖產(chǎn)生4.9g/L乙醇，在45°C產(chǎn)生3.3g/L乙醇(Goshima et al.，2013)。而Dmytruk等利用木糖異構(gòu)酶途徑改造的另一種酵母Hansenula polymorpha可以在48°C發(fā)酵木糖產(chǎn)生1.31g/L乙醇(Dmytruk etal., 2008)。Ismail等構(gòu)建了一株比較耐熱的利用基因工程菌Saccharomyces cerevisiaesun049T可以在38°C發(fā)酵木糖產(chǎn)生15.2g/L乙醇(Ismail et al.，2013)。以上的這些研究還沒有充分發(fā)揮耐熱酵母在高溫下發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的潛力，他們利用木糖發(fā)酵的速率、產(chǎn)量以及利用木糖的能力都還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠(表1)。我們的此發(fā)明申請(qǐng)中的NcXYLl-PsXYL2的ARS突變基因組合結(jié)合增加的木酮糖激酶基因(KmXYL3)的表達(dá)大幅度提高了耐熱酵母在高溫下發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇，結(jié)合產(chǎn)生木酮糖之后的下游代謝工程改造進(jìn)一步提高了木糖發(fā)酵的能力，產(chǎn)量和發(fā)酵速率都遠(yuǎn)超已有的菌株，證明本發(fā)明構(gòu)建的方法和構(gòu)建的菌株在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化乙醇工業(yè)上有很巨大的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明通過在耐熱酵母中高效表達(dá)粗糙脈孢霉的木糖還原酶基因，樹干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶突變基因，以及下游的KmXYL3，KmADH2, KmPDCl，KmTALl，KmTKLl，KmRPEI,KmRKIl, KmGLNl基因的過表達(dá)和KmGPDl基因的敲除，構(gòu)建了在較高溫度(>42°C )下能夠利用和發(fā)酵木糖的高效生產(chǎn)乙醇的耐熱酵母馬克思克魯維酵母菌株；本發(fā)明對(duì)馬克思克魯維酵母中的木糖還原酶基因(XYLl)和木糖醇脫氫酶基因(XYL2)進(jìn)行雙敲除，構(gòu)建工程菌株，再將粗糙脈孢霉的木糖還原酶基因，樹干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶突變基因，以及下游的一系列基因在上述基因敲除的耐熱酵母中表達(dá)或敲除，構(gòu)建了對(duì)利用木糖生產(chǎn)乙醇的能力大幅度改良，能夠在較高溫度下利用木糖大量生產(chǎn)乙醇的耐熱工程酵母菌株。構(gòu)建過程見圖1。
[0007]具體的，本發(fā)明涉及以下各項(xiàng):
[0008]1.一種乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于所述工程菌株通過在雙敲除木糖還原酶基因KmXYLl和木糖醇脫氫酶基因KmXYL2的馬克思克魯維酵母(K.marxianus)中重組入粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的木糖還原酶基因NcXYLl和樹干畢赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2_ARS，以及馬克思克魯維酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3而獲得，其中所述樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS為在野生型樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶基因的基礎(chǔ)上具有D207A/I208R/F209S突變。
[0009]2.根據(jù)I所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于所述菌株含有兩個(gè)拷貝的所述樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS。
[0010]3.根據(jù)2所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的乙醇脫氫酶基因KmADH2和馬克思克魯維酵母的丙酮酸脫羧酶基因KmPDCl。
[0011]4.根據(jù)3所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的轉(zhuǎn)醛酶基因KmTALl和馬克思克魯維酵母的轉(zhuǎn)酮酶基因KmTKLl。
[0012]5.根據(jù)4所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶基因KmRPEl。
[0013]6.根據(jù)5所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入包括馬克思克魯維酵母的核糖-5-磷酸酮醇異構(gòu)酶基因KmRKIl。
[0014]7.根據(jù)6所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中敲除馬克思克魯維酵母的甘油-3磷酸脫氫酶基因KmGPDl。
[0015]8.根據(jù)7所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的谷氨酰胺合成酶基因KmGLNl。
[0016]9.一種乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株YZJ088，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9387。
[0017]10.1-9任一項(xiàng)所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株用于發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的用途。
[0018]本發(fā)明獲得的最優(yōu)選的木糖發(fā)酵產(chǎn)生木糖醇的應(yīng)用菌株為馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus YZJ088。此菌株可直接利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,此菌株可以在高溫條件下利用高木糖濃度高產(chǎn)乙醇。該菌株已于2014年06月26日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.9387 (YZJ088菌株)。
[0019]本發(fā)明中采用一種新的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶組合結(jié)合木酮糖激酶基因(KmXYL3)的過表達(dá)使得K.marxianus工程菌在42°C利用木糖發(fā)酵的能力大幅度提高；進(jìn)一步對(duì)下游基因進(jìn)行工程改造后所得到的菌株YZJ088在高溫條件下，可以很好的利用木糖生產(chǎn)乙醇，有著比野生型耐熱菌株更強(qiáng)的利用木糖生產(chǎn)乙醇的能力。而釀酒酵母等在這個(gè)溫度下，已經(jīng)不能正常生長和發(fā)酵。
[0020]本發(fā)明中將粗糙脈孢霉的XYLl和樹干畢赤酵母的XYL2的ARS突變體進(jìn)行組合結(jié)合木酮糖激酶基因(KmXYL 3)的過表達(dá)，這種組合使得構(gòu)建的工程菌在42°C利用100g/l木糖，乙醇產(chǎn)量達(dá)25.48g/L，生產(chǎn)速率為1.42g/L/h。本發(fā)明的YZJ088菌株，在42°C條件下，能在18h利用100g/L木糖生產(chǎn)35.94g/L乙醇，生產(chǎn)速率高達(dá)2.00g/L/h,產(chǎn)率為0.38g/g。與目前現(xiàn)有的耐熱酵母利用木糖生產(chǎn)乙醇的最好水平相比，本發(fā)明的YZJ088菌株不僅在較高溫度(>42°C )條件下有利用木糖生產(chǎn)乙醇的能力，而且比現(xiàn)有的耐熱酵母生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量(11.52g/L, (Wang et al., 2013))高，速率(0.llg/L/h, (Zhang et al., 2013))快(表 I)。
[0021]表1:已發(fā)表的不同菌株和本專利中的菌株在利用木糖和生產(chǎn)乙醇效率的比較
[0022]

【權(quán)利要求】
1.一種乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于所述工程菌株通過在雙敲除木糖還原酶基因KmXYLl和木糖醇脫氫酶基因KmXYL2的馬克思克魯維酵母(K.marxianus)中重組入粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)的木糖還原酶基因NcXYLl和樹干畢赤酵母(Scheffersomyces stipitis)的木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2_ARS，以及馬克思克魯維酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3而獲得，其中所述樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS為在野生型樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶基因的基礎(chǔ)上具有D207A/I208R/F209S突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于所述菌株含有兩個(gè)拷貝的所述樹干畢赤酵母木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的乙醇脫氫酶基因KmADH2和馬克思克魯維酵母的丙酮酸脫羧酶基因KmPDCl0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的轉(zhuǎn)醛酶基因KmTALl和馬克思克魯維酵母的轉(zhuǎn)酮酶基因KmTKLl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶基因KmRPEl。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的核糖-5-磷酸酮醇異構(gòu)酶基因KmRKIl。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中敲除馬克思克魯維酵母的甘油-3磷酸脫氫酶基因KmGPDl。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于在所述菌株中進(jìn)一步轉(zhuǎn)入馬克思克魯維酵母的谷氨酰胺合成酶基因KmGLNl。
9.一種乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株YZJ088，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9387。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的乙醇高溫高產(chǎn)工程菌株用于發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的用途。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104164375SQ201410380023
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月4日
【發(fā)明者】洪泂, 張佳, 張標(biāo) 申請(qǐng)人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)