一種轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，所述方法為：以小鼠肺組織CD69的cDNA為目的基因，以LCK為調(diào)控元件，以IRES-EGFP為載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP；限制性內(nèi)切酶酶切線性化pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP，回收并純化8081bp的片段LCK-CD69-IRES-EGFP；顯微注射小鼠雄原核，得到陽性轉(zhuǎn)基因小鼠；本發(fā)明對研究CD69功能和生理意義更具備特異性。同時(shí)對于炎癥性疾病的研究，外周血淋巴細(xì)胞中CD69的持續(xù)表達(dá)更利于觀察其對炎癥的影響。
【專利說明】一種轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動(dòng)物模型的構(gòu)建，特別涉及一種轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方 法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] ⑶69是一種細(xì)胞表面活化標(biāo)記抗原，于1981年發(fā)現(xiàn)，早期被稱為AM、EA-1、 LEU-23、MLR-3等，是C-型凝集素受體家族的成員，也是NK細(xì)胞信號傳導(dǎo)基因復(fù)合體家族 的一員。CD69在幾乎所有髓系細(xì)胞中表達(dá)。除了在單核細(xì)胞、血小板等細(xì)胞中有持續(xù)結(jié) 構(gòu)性的表達(dá)，它在大多數(shù)細(xì)胞中的表達(dá)只出現(xiàn)在活化后的細(xì)胞。靜止的T或NK細(xì)胞不表 達(dá)⑶69,在接受細(xì)胞刺激信號后1小時(shí)即可有細(xì)胞表面⑶69的表達(dá)，并迅速達(dá)峰持續(xù)至 72 小時(shí)（參見 Nakamura S，Sung SS，Bjorndahl JM，et al. Human T cell activation. IV. T cell activation and proliferation via the early activation antigen EA1. J Exp Med，1989, 169(3) :677-689.)。近年來的研究顯示，CD69的表達(dá)與許多免疫細(xì)胞的 分化成熟均密切相關(guān)：它是記憶Th細(xì)胞的生發(fā)和成熟所必需的，CD69缺陷小鼠的CD4+T 細(xì)胞無法在骨髓中定位及分化（參見Shinoda K，Tokoyoda K，Hanazawa A，et al.Type II membrane protein CD69regulates the formation of resting T-helper memory. Proc Natl Acad Sci 舊六，2012，109(19):7409-7414.);它可調(diào)節(jié)11117細(xì)胞的分化增 殖（參見 Martin P, Gomez M，Lamana A，et al. The leukocyte activation antigen CD69 limits allergic asthma and skin contact hypersensitivity. J Allergy Clin Immunol，2010，126(2):355-365,365，el-3);此外，CD69 還在細(xì)胞的凋亡中起著 重要作用。⑶69高表達(dá)的T細(xì)胞體外易于快速自發(fā)凋亡（參見Pajusto M，Ihalainen N, Pelkonen J，et al. Human in viv〇-activated CD45R0(+)CD4 (+)T cells are susceptible to spontaneous apoptosis that can be inhibited by the chemokine CXCL12and IL-2,-6,-7, and-15.Eur J Immunol，2004, 34 (10) :2771-2780.),體外培養(yǎng)的 嗜酸細(xì)胞加入抗CD69單抗可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并伴有抗凋亡信號bcl-2表達(dá)的下降（參 見 Foerster M，Haefner D, Kroegel C. Bcl-2-mediated regulation of CD69_induced apoptosis of human eosinophils: identification and characterization of a novel receptor-induced mechanism and relationship to CD95_transduced signalling. Scand J 11111111111〇1，2002,56(4):417-428.)，這可能與0)69可作用于細(xì)胞31^激活通路 中的Syk蛋白或細(xì)胞內(nèi)信號通路耦合G蛋白有關(guān)（參見Vance BAjarley PH，Backlund PS, Ward Y, Phelps TL, Gress RE. Human CD69associates with an N-termianal fragment of calreticulin at the cell surface. Arch Biochem Biophys, 2005 ；438 (1):11-20.； Esplugues E，Sancho D, Vega-Ramos J，et al. Enhanced antitumor immunity in mice deficient in CD69.J Exp Med，2003, 197 (9) :1093-1106. )。CD69 這種可廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞活 化、增殖與凋亡的功能使得它在感染性疾病、炎癥性疾病、腫瘤性疾病和自身免疫性疾病 中起到重要作用（參見 Zhao Q，Kuang DM，Wu Y，et al· Activated CD69+T cells foster immune privilege by regulating IDO expression in tumor-associated macrophages. J Immunol, 2012, 188(3):1117-1124. ；Vega-Ramos J,Alari-Pahissa E,Valle JD, et al.CD69 limits early inflammatory diseases associated with immune response to Listeria monocytogenes infection. Immunol Cell Biol, 2010, 88(7):707-715.； Miki-Hosokawa T,Hasegawa A,Iwamura C, et al. CD69 controls the pathogenesis of allergic airway inflammation. J Immunol, 2009, 183 (12) : 8203-8215.)。研制 CD69 轉(zhuǎn)基 因小鼠，對于它在這些疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物篩選的研究有著更廣泛的用途。
[0003] 國外已有兩種CD69轉(zhuǎn)基因小鼠的制備（參見Sancho D, M Gomez, F. Viedma, E. et al.CD69downregulates autoimmune reactivity throughactive transforming growth factor-beta production in collagen-induced arthritis.J Clin Invest, 2003,112 (6):872 - 882. ；Nakayama T, Kasprowicz DJ, Yanashita M, et al. The generation of mature, single-positive thymocytes in vivo is dysregulated by CD69blockade or overexpression· J Immunol, 2002, 168(1) :87-94.),分別用人的 CD2 啟 動(dòng)子增強(qiáng)子或LCK和生長激素構(gòu)建載體，用于觀察CD69對T細(xì)胞發(fā)育的影響。兩種轉(zhuǎn)基因 小鼠發(fā)現(xiàn)⑶69可在胸腺Τ細(xì)胞中表達(dá)，而在外周淋巴器官中無法表達(dá)，且對于⑶69表達(dá)的 檢測繁復(fù)。我們采用CD69-EGFP作為目的基因，EGFP基因表達(dá)的蛋白為綠色熒光蛋白，可 以指示⑶69蛋白表達(dá)量和表達(dá)全身分布。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，應(yīng)用 LCK-⑶69-IRES-EGFP構(gòu)建表達(dá)載體，使得⑶69可持續(xù)表達(dá)于靜息的淋巴細(xì)胞中，且將⑶69 與EGFP的表達(dá)連接，這樣便于簡單直接觀察⑶69的表達(dá)。同時(shí)，單純轉(zhuǎn)⑶69而摒除其他 基因的影響，對研究CD69功能和生理意義更具備特異性。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，所述方法為：
[0007] (1)小鼠淋巴細(xì)胞啟動(dòng)子LCK的克?。ê塑账嵝蛄袨镾EQ ID Ν0. 4所示）；
[0008] (2) PCR擴(kuò)增得到小鼠肺組織CD69的cDNA ;
[0009] (3)以小鼠肺組織CD69的cDNA為目的基因，以LCK為調(diào)控元件，以IRES-EGFP為載 體（核苷酸序列為SEQ ID N0. 2所示），構(gòu)建重組質(zhì)粒pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP ;
[0010] (4)限制性內(nèi)切酶酶切線性化pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP，回收并純化 8081bp 的片段 LCK-CD69-IRES-EGFP ;
[0011] (5)顯微注射小鼠雄原核，得到陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0012] 本發(fā)明所述目的基因是以B6小鼠肺組織的RNA為模板，以O(shè)ligo (dT) 18e為引物， 利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA鏈，然后以cDNA為模板，在上游引物和下游引物的作用下，PCR合 成HA-CD69DNA (核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示），隨后以HA-CD69DNA作為目的基因，與載 體 IRES-EGFP 連接構(gòu)建重組質(zhì)粒 pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP。
[0013] 上游引物：
[0014] 5' -TTGGCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGATTCTGAAAACTGTTC-3'
[0015] 下游引物：5 ' -AAATATCTCGAGTCATCTGGAGGGCTTGCTGC-3 '。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明應(yīng)用 LCK-⑶69-IRES-EGFP構(gòu)建表達(dá)載體，使得⑶69可持續(xù)表達(dá)于靜息的淋巴細(xì)胞中，且將⑶69 與EGFP的表達(dá)連接，這樣便于簡單直接觀察CD69在小鼠全身不同組織和器官的表達(dá)。同 時(shí)，單純轉(zhuǎn)CD69,而摒除其他基因的影響，對研究CD69功能和生理意義更具備特異性。同時(shí) 對于炎癥性疾病的研究，外周血淋巴細(xì)胞中CD69的持續(xù)表達(dá)更利于觀察其對炎癥的影響。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為⑶69-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建框架圖。
[0018] 圖2為pInsulater-Lck-CD69-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。
[0019] 圖3為pLCK-⑶69-IRES-EGFP酶切瓊脂糖凝膠電泳圖；Μ條帶為標(biāo)記條帶，泳道1 為ApaLI酶切后的條帶，分別為5845bp、3168bp、1246bp、97bp大小的條帶。泳道2為NcoI 酶切的電泳條帶，分為653lbp、2424bp、1144bp、657bp大小的條帶。
[0020] 圖4為⑶69-EGFP轉(zhuǎn)基因載體的熒光圖。
[0021] 圖5為仔鼠基因組DNA PCR產(chǎn)物電泳圖，A為引物1PCR的條帶；B為引物2PCR的 條帶。DL泳道為標(biāo)記條帶，P為陽性對照，N為陰性對照，B6為野生型小鼠空白對照。其他 不同數(shù)字代表小鼠的編號。
[0022] 圖6轉(zhuǎn)基因小鼠外周血涂片的熒光圖。
[0023] 圖7為轉(zhuǎn)基因小鼠外周血中EFGP陽性細(xì)胞的⑶69表達(dá)的流式細(xì)胞儀圖。
[0024] 圖8CD69轉(zhuǎn)基因小鼠塵螨致敏后氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤，a為正常小鼠組織，b為 ⑶69轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織。
[0025] 圖9⑶69轉(zhuǎn)基因小鼠塵螨致敏后氣道粘液分泌，a為正常小鼠組織，b為⑶69轉(zhuǎn)基 因小鼠肺組織。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：
[0027] 實(shí)施例1
[0028] Iplnsulater-LCK-CD69-IRES_EGFP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0029] 1)提取小鼠肺組織RNA
[0030] 材料：B6小鼠
[0031] 試劑：RNA提取試劑RNAiso Plus (Takara公司）、0. 1 %體積濃度的焦碳酸二乙酯 (DEPC液）、RNase-free水（DEPC處理過的水）、體積濃度75%的乙醇溶液（用DEPC處理 過的水配制）、氯仿。
[0032] 處死一只B6小鼠（B6是小鼠的品株strain)，摘除小鼠肺組織，稱重后迅速用液 氮冷凍后移至用液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末狀，其間不斷加入液氮保持低溫。研磨好 的樣品每50-100mg組織加入lml RNAiso Plus完全覆蓋組織粉末，室溫下靜置至組織完 全溶化呈透明液體狀，4°C下離心12000gX4min，吸取上清液移至新的離心管，加入氯仿 (RNAiso Plus的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15s。待溶液充分乳化（無分 相現(xiàn)象）后，4°C下離心12000gX15min，液體分為三層：無色的上清液，中間的白色蛋白層 及帶顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液，加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，室 溫下（15-30°C )靜置lOmin后4°C離心12000gX10min。棄去上清，緩慢的沿離心管壁加 入體積濃度75%的乙醇溶液lml (切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，4°C下離心 12000gX5min后棄去乙醇（為了更好的控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇），沉淀 室溫（25°C )下干燥2-5min，加入500ul的RNase-free水溶解沉淀，用移液搶輕輕吹打沉 淀，待沉淀完全溶解后于_80°C保存，獲得小鼠肺組織RNA。
[0033] RNA制備的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的RNA分解和防止所用器具及試劑中的RNA分 解酶的污染。實(shí)驗(yàn)過程戴一次性手套，使用器皿應(yīng)用0.1%濃度的焦碳酸二乙酯（DEPC 液）37°C處理12小時(shí)，然后在120°C高溫滅菌30min除去殘留的DEPC液。
[0034] 2) CD69cDNA 鏈的合成
[0035] 以步驟1)提取的小鼠肺組織RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA鏈的合成，然后 通過PCR技術(shù)進(jìn)行⑶69DNA的擴(kuò)增。
[0036] PCR反應(yīng)體系（27. Ο μ L)如下：
[0037] 模板 2pL ().1 DEPC 液處 Jf.過的水 I ?>μ?_ RNA _抑_ 劑（RNasc Inhibitor) lOU/pL Ιμ? 引物 Oligo(dT)丨8 ΙΟμηιοΙ/L 1 pL 1 ()X逆轉(zhuǎn)泌緩沖液（RT Buffer) 4μ? dNTP (IDmM) 2pL Rcvcrl Aidis, M-Mulv Reverse Transcripls(200pg/^L) IgL
[0038] 10X 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液（RT Buffer) :250mmol/L Tris-HCl(pH8. 3)+375mmol/ LKCl+15mmol/L MgCl2〇
[0039] PCR 反應(yīng)條件：70°C 5min，37°C 5min，42°C 60min，70°C lOmin。反應(yīng)結(jié)束后冰浴 5min〇
[0040] 3) PCR 擴(kuò)增 CD69DNA
[0041] 收集步驟2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物cDNA作為模板DNA，經(jīng)過PubMed搜索設(shè)計(jì)PCR引物，在 上下游引物分別引入Eco RI限制性內(nèi)切酶和Xhol限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，應(yīng)用高保真PCR 法擴(kuò)增小鼠 CD69片斷。具體如下：
[0042] 上游引物：
[0043] 5' -TTGGCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGATTCTGAAAACTGTTC-3'
[0044] 下游引物：5 ' -AAATATCTCGAGTCATCTGGAGGGCTTGCTGC-3 '
[0045] 上游引物含有EcoRl限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)和HA序列（下劃線部分），下游引物 含有Xhol限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
[0046] 反應(yīng)體系：
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法為： (1) 小鼠淋巴細(xì)胞啟動(dòng)子LCK的克??； (2) PCR擴(kuò)增得到小鼠肺組織CD69的cDNA ; (3) 以小鼠肺組織⑶69的cDNA為目的基因，以LCK為調(diào)控元件，以IRES-EGFP為載體， 構(gòu)建重組質(zhì)粒 pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP ; (4) 限制性內(nèi)切酶酶切線性化pInsulater-LCK-CD69-IRES-EGFP，回收并純化8081bp 的片段 LCK-CD69-IRES-EGFP ; (5) 顯微注射小鼠雄原核，得到陽性轉(zhuǎn)基因小鼠。
【文檔編號】C12N15/63GK104195155SQ201410380414
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月5日
【發(fā)明者】汪慧英 申請人:浙江大學(xué)