用于對特異性細胞進行篩選的微流控芯片及細胞篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于對特異性細胞進行篩選的微流控芯片及細胞篩選方法。其中，芯片包括基底和腔道以及聲波激勵源；腔道包括中間通道、入口和出口；聲波激勵源位于基底上且位于中間通道的兩側，聲波激勵源包括沿中心通道并向出口方向延伸的兩部分，靠近出口的第二部分對應的聲波共振頻率是遠離出口的第一部分對應的聲波共振頻率的整數(shù)倍。通過靶向微泡及非對稱聲場形成的聲流效應，使微泡粘附于特異性特異性細胞表面，由于微流體的層流特性，富集的細胞在流過第一部分后仍然會在一條直線中移動不會擴散，而由于第二部分的聲波共振頻率不同于第一部分，使得粘附靶向微泡的特異性特異性細胞發(fā)生偏移，從而實現(xiàn)在血液中篩選特異性細胞特異性的目的。
【專利說明】用于對特異性細胞進行篩選的微流控芯片及細胞篩選方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞分析【技術領域】，具體涉及一種用于對特異性細胞進行篩選的微流 控芯片及細胞篩選方法。

【背景技術】
[0002] 分子生物學和臨床研究表明，部分診斷為早期的癌癥實際上已有遠處轉移，即腫 瘤微轉移，而常規(guī)影像學、組織學或細胞學方法難以發(fā)現(xiàn)。腫瘤微轉移可通過血行及淋巴 途徑在全身組織和器官中形成微小轉移病灶，而淋巴結轉移發(fā)展最終也要進入血液循環(huán)中 形成循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells, CTCs)，導致原發(fā)腫瘤轉移的全身化傾向。 CTCs的檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉移、監(jiān)測術后復發(fā)、評估療效及預后或選擇合適的個 體化治療。
[0003] 在對肺癌發(fā)生機制不斷深入認識以及分子生物學方法發(fā)展的基礎上，CTCs的 檢測方法也有了較大的進展。免疫磁珠法、反轉錄多聚酶鏈式反應（RT-PCR，Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)及流式細胞分析技術（Flow Cytometry， FCM)是目前常用的檢測惡性腫瘤患者血液和骨髓液中隱匿腫瘤細胞的方法。免疫磁珠法利 用免疫磁珠（一種人工合成的微米級含鐵小微粒）的功能層的特點（功能層既可以結合生 物分子，同時又能被磁力所吸引），使免疫磁珠在磁力作用下發(fā)生力學移動，使復合物與其 它物質分離，從而達到分離特異性抗原的目的；然而，免疫磁珠法的缺點是，磁珠密度過大， 容易導致磁珠的聚集和沉降，而使富集效率降低，磁珠與細胞偶聯(lián)后不易從細胞表面脫附， 還常常夾雜非相關的細胞，從而影響分離的效果。RT-PCR檢測法是通過設計腫瘤細胞標志 性基因或靶RNA的特異性引物，通過對外周血樣本進行RT-PCR來檢測外周血是否含有腫瘤 細胞；但是這種方法同時因受實驗污染、非常規(guī)轉錄等限制，導致存在假陽性率過高的缺點 而限制了其在外周血檢測癌細胞中的應用。FCM法能將處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或 生物顆粒進行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選，且研究發(fā)現(xiàn)FCM法檢測外周血腫瘤細胞 的敏感性為每1000個外周血淋巴細胞中可檢測出一個腫瘤細胞，但由于流式細胞儀設備 昂貴，且缺乏特異性抗原，因此也限制了該技術的推廣。
[0004] 另一方面，隨著微納加工技術的不斷發(fā)展，基于微流控芯片的細胞篩選技術得到 了廣泛的關注和認可。微流控芯片的腔道結構可以任意設計，提高了細胞篩選的靈活性和 可靠性，而腔道的尺寸與細胞大小相匹配，可更有效的分選細胞。目前，基于微流控篩選細 胞的方法主要包括：
[0005] (1)介電電泳方法（DEP, Dielectrophoresis)法。其中，介電電泳指在空間非均 一電場下的細胞，由于其相對于周邊介質的誘導偶極距不同而產(chǎn)生的電遷移，從而受到介 電力的作用。這種方法需要較強的電場，而電場引起的熱效應有可能會對細胞造成損傷。
[0006] (2)水流動力學方法。這種方法通過特殊設計的通道結構可以改變流體的流場，可 以用來進行層流混合、富集和篩選，利用流體引起的拽力，實現(xiàn)CTCs的分離。然而，水流動 力學方法只適用于一定尺寸的細胞，并且容易堵塞腔道。
[0007] (3)光學方法。當光被細胞表面反射吸收以及發(fā)生折射時，它的傳播方向會發(fā)生改 變，動量也隨之改變，根據(jù)動量守恒定律，細胞會獲得光子損失的動量，進而表現(xiàn)為受到光 的作用力，因此，利用光鑷可有效分離CTCs。然而這種方法通常是適用于單個細胞，很難對 大量細胞進行同時篩選，降低了細胞篩選的通量。
[0008] (4)聲學方法。聲波，作為一種機械波，攜帶動能和能量同樣可對細胞進行分選。 然而聲學的方法缺少特異性，而CTCs的粒徑大小與血液中細胞粒徑存在混疊（如圖1所 示），很難對CTCs細胞進行篩選。
[0009] 綜上所述，目前雖有多種方法可實現(xiàn)CTCs的篩選，但每種方法均存在一定的缺點 與不足，直接影響了細胞篩選的效率和細胞的活性，難以達到對癌癥轉移的早期診斷。因 此，還需要開發(fā)一種高效、準確、并行、無損傷的分選方法。


【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明提供一種新的用于對特異性細胞進行篩選的微流控芯片及相關的篩選方 法。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種用于對特異性細胞進行篩選的微流控芯 片，包括基底和附著于所述基底上的腔道，還包括聲波激勵源；所述腔道包括中間通道、位 于所述中間通道一端的用于供靶向微泡和含有特異性細胞的血液注入的入口和位于所述 中間通道另一端的用于供分離出的特異性細胞和血細胞輸出的出口；所述聲波激勵源位于 基底上且位于所述中間通道的兩側，所述聲波激勵源包括沿所述中心通道并向出口方向延 伸的兩部分，其中靠近出口的第二部分對應的聲波共振頻率是遠離出口的第一部分對應的 聲波共振頻率的整數(shù)倍。
[0012] 優(yōu)選地，所述聲波激勵源包括一對叉指換能器，所述叉指換能器位于基底上且位 于所述中間通道的兩側，所述叉指換能器包括第一電極部分、第二電極部分和用于連接所 述第一電極部分和所述第二電極部分的過濾帶（222)，所述第一電極部分對應所述遠離出 口的第一部分，所述第二電極部分對應所述靠近出口的第二部分。進一步地，所述第一電極 部分的指條寬度為所述第二電極部分的指條寬度的整數(shù)倍。
[0013] 優(yōu)選地，所述基底為128度YX雙面拋光的鈮酸鋰晶體；所述腔道由聚二甲基硅氧 烷材質制作；所述入口包括用于供靶向微泡注入的第一入口和用于供血液注入的第二入 口，所述出口包括用于供分離出的特異性細胞輸出的第三出口、第五出口和用于供血細胞 輸出的第四出口，且所述第四出口位于所述第三出口和所述第五出口之間。
[0014] 優(yōu)選地，所述聲波激勵源包括基于體聲波的激勵源。
[0015] 優(yōu)選地，所述特異性細胞包括循環(huán)腫瘤細胞；所述特異性細胞與所述靶向微泡的 特異性不同，且所述靶向微泡在聲波激勵源的作用下粘附于所述特異性細胞。
[0016] 優(yōu)選地，所述腔道采用軟光刻工藝制作。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種用于對特異性細胞進行篩選的方法，包 括：細胞富集步驟，即將含有特異性細胞的血液和已制備的靶向微泡注入如上所述的微流 控芯片，當所述血液和所述靶向微泡移動到與所述第一部分相對應的位置時，對所述微流 控芯片施加信號以在所述腔道內形成駐波聲場，且使得血液中的血細胞以及與靶向微泡充 分接觸的特異性細胞沿所述中心通道并朝向出口方向移動；和細胞分選步驟，即當所述血 液和所述靶向微泡移動到與所述第二部分相對應的位置時，調整所述信號的頻率或相位， 從而使得靶向微泡及與其充分接觸的特異性細胞的移動速度大于血細胞的移動速度。
[0018] 優(yōu)選地，所述特異性細胞為循環(huán)腫瘤細胞；所述靶向微泡的制備包括：步驟A，即 在容器中按一定比例將一定量的二硬脂酰磷脂酰膽堿、聚乙二醇2000修飾二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺溶解在三氯甲烷中且在渦旋混合器上混勻，通入氮氣除去三氯甲烷并使磷脂在 容器壁上形成一層均勻的薄膜，真空干燥若干小時；步驟B，即在含有干燥磷脂薄膜的容器 中加入經(jīng)脫氣處理的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液，所述緩沖溶液含有10%體積的甘油和 10%體積的丙二醇，加熱所述緩沖溶液到相轉變溫度以上，水浴超聲震蕩使磷脂溶液分散 徹底直至透明；步驟C，即將透明的磷脂溶液分裝置西林瓶中，并將西林瓶中的空氣置換為 生物惰性氣體；步驟D，即震蕩西林瓶從而制備出微泡。
[0019] 優(yōu)選地，所述微流控芯片的聲波激勵源為位于基底上且位于所述中間通道的兩側 的一對叉指換能器，所述叉指換能器包括第一電極部分、第二電極部分和用于連接所述第 一電極部分和所述第二電極部分的過濾帶，所述第一電極部分對應的聲波共振頻率為所述 第二電極部分對應的聲波共振頻率的整數(shù)倍。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是：通過注入的靶向微泡以及采用的非對稱聲場形成的聲流效 應，使微泡與血液中的特異性細胞結合，使微泡粘附于特異性細胞表面，由于微流體的層流 特性，富集的細胞在流過第一部分的駐波聲場后，這些細胞仍然會在一條直線中移動，而由 于第二部分的聲波共振頻率不同于第一部分，使得粘附靶向微泡的特異性細胞發(fā)生偏移， 特異性細胞將移動到第二部分的聲波共振頻率的聲場中的節(jié)點位置，而血液中其它血細胞 仍然在層流拽力的作用下依舊在第一部分的聲波共振頻率的聲場中的節(jié)點位置移動，從而 實現(xiàn)在血液中篩選特異性的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，其中相同參考標號表示相同部分。
[0022] 圖1示意性地示出了血液中白細胞、紅細胞與CTCs粒徑大小，其中白細胞與CTCs 粒徑存在混置；
[0023] 圖2示意性地示出了本發(fā)明一種實施方式的微流控芯片的結構示意圖；
[0024] 圖3和圖4示意性地示出了靶向微泡與小鼠淋巴細胞的黏附，其中A為非靶向微 泡，B為Lyp-Ι靶向微泡，圖示中非靶向微泡基本不能與細胞粘附，而大量靶向微泡可與細 胞緊密粘附。

【具體實施方式】
[0025] 隨著微機電系統(tǒng)（MEMS)工藝的不斷進步，微流控芯片（microfluidic device)得 到了迅速發(fā)展，本發(fā)明是在此技術基礎上，提出了一種用于特異性細胞篩選的微流控芯片 及其相關方法。以下通過【具體實施方式】結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。其中，以特 異性細胞為CTCs為例進行說明，當然，本發(fā)明同樣適用于其它類型細胞，只要細胞之間的 聲阻抗有差異，例如將血小板在血細胞中分離。
[0026] [實施例1]
[0027] 如圖2所示，本實施例提供一種用于對特異性細胞進行篩選的微流控芯片，包括 基底21、附著于基底21上的腔道23、以及聲波激勵源。
[0028] -種具體實現(xiàn)中，為獲得較大的機電耦合系數(shù)，基底為128° YX雙面拋光的鈮酸 裡晶體。
[0029] 又一種具體實現(xiàn)中，腔道由聚二甲基硅氧烷（PDMS)材質制作。腔道23包括中間 通道、位于中間通道一端的入口 231、232以及位于中間通道另一端的出口 233、234、235。其 中，入口 231用于供靶向微泡33注入，入口 232用于供含有特異性細胞31及血細胞32 (包 括紅細胞、白細胞和血小板）的血液注入，出口 233、235用于供分離出的特異性細胞及粘附 于其表面的微泡輸出，出口 234用于供血細胞輸出，并且出口 234位于出口 233和出口 235 之間。
[0030] 聲波激勵源位于基底21上且位于中間通道的兩側，聲波激勵源包括沿所述中心 通道并向出口方向延伸的兩部分，其中靠近出口的第二部分對應的聲波共振頻率是遠離出 口的第一部分對應的聲波共振頻率的整數(shù)倍。一種具體實現(xiàn)中，聲波激勵源基于聲表面波， 其具體為一對叉指換能器22。叉指換能器是指在壓電基底上濺射周期性的叉指電極，對叉 指電極施加射頻輸入信號，利用逆壓電效應使得基底產(chǎn)生振動并產(chǎn)生聲表面波。叉指換能 器22位于基底21上且位于中間通道的兩側，叉指換能器22包括第一電極部分221、第二電 極部分223和用于連接第一電極部分221和第二電極部分223的過濾帶222,第一電極部分 221對應前述的遠離出口的第一部分，第二電極部分223對應前述的靠近出口的第二部分， 如圖2所示。一種具體實現(xiàn)中，第一電極部分221的指條寬度為第二電極部分223的指條 寬度的整數(shù)倍。另一種具體實現(xiàn)中，聲波激勵源基于體聲波，即利用壓電陶瓷為激勵源實現(xiàn) 細胞篩選。
[0031] 本實施例的微流控芯片由于聲波激勵源的兩部分的聲波共振頻率不相同，即可得 到非對稱聲場，藉此通過形成的聲流效應可以實現(xiàn)對特異性細胞例如CTCS的分離。
[0032] 采用本實施例的微流控芯片分選細胞具有以下特點：
[0033] (1)微流控芯片不需要鞘流，不會稀釋細胞，以及鞘流引起的剪切應力損傷細胞帶 來的負面效應，本發(fā)明僅依靠聲波富集，富集效率高，速度快。
[0034] (2)分選效率高：由于CTCs表面充分粘附著靶向微泡，CTCs具有較高的聲學敏感 性，只需要較小的聲壓，便可將CTCs從血液中分選，得到較高的分選效率。
[0035] (3)細胞生物活性：分選后CTCs表面粘附這微泡，而微泡可在常壓的破碎，不需要 其他生化手段將微泡與細胞分離，從而保證了細胞的生物活性。
[0036] (4)微流控芯片性能具有良好的一致性。由于MEMS工藝具有標準化流程，利用 MEMS工藝制備的聲表面波微流控芯片能夠保證器件的可靠性和一致性。
[0037] (5)具有普遍適用性。細胞的富集與分選僅僅依靠調節(jié)輸入到叉指換能器的射頻 信號，不需要改變聲表面波微流控芯片的結構，只要靶向微泡的配體與CTCs細胞的抗體能 夠牢固結合，CTCs便可實現(xiàn)分選，具有較好的普遍適用性。
[0038] (6)芯片成本低。芯片制備工藝為標準的MEMS技術，工藝成熟器件的性能一致性 良好，并且成本低廉,可大量生產(chǎn)。
[0039] 這些特點可通過如下實施例2及其示例予以體現(xiàn)。
[0040] [實施例2]
[0041] 本實施例提供一種對特異性細胞進行篩選的方法，其采用實施例1提供的微流控 芯片為實驗平臺，在聲波的作用下將CTCs富集，借助靶向微泡與CTCs的粘附，增強CTCs的 聲阻抗差異，通過調控聲波的幅值與頻率，實現(xiàn)細胞的篩選，并且細胞的生物活性不會受到 影響，為CTCs的篩選提出了一種新的途徑。
[0042] 本實施例的細胞篩選方法的過程包括如下步驟S1?S4 :
[0043] 步驟S1，制備靶向微泡。微泡通常稱為超聲造影劑，是一種含有惰性氣體的包膜微 氣泡，最初主要作用是增強超聲圖像的對比度，提高圖像質量。最近研究表明，可對微泡的 表面進行化學修飾，將帶有特異性配體的微泡與靶細胞結合，使微泡沾附在細胞表面，進一 步實現(xiàn)分子影像以及靶向給藥的目的。本發(fā)明將研究配體與微泡的不同修飾方式，確保微 泡能夠穩(wěn)定的、特異性的結合CTCs，而不會與血液中正常細胞結合。
[0044] -種具體實現(xiàn)中，靶向微泡的制備過程包括：
[0045] A.按一定比例將一定量的二硬脂酰磷脂酰膽堿（distearoyl phosphatidylcholine, DSPC)、聚乙二醇 2000 修飾二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEK-2k) 溶解在三氯甲烷中在渦旋混合器上混勻。在干燥的N2氣流作用下除去三氯甲烷使磷脂在 試管壁上形成一層均勻的薄膜，用石蠟膜封上試管口，并用針戳幾個孔作為氣體出口，將試 管置于真空烘箱中干燥若干小時（例如2小時）以上，除去殘余的溶劑三氯甲烷。
[0046] B.在含有干燥磷脂薄膜的試管中加入一定體積脫氣的三羥甲基氨基甲烷（Tris) 緩沖溶液（例如其pH值為7. 4)，緩沖溶液中含有10%體積比的甘油和10%體積比的丙二 醇。加熱緩沖溶液到所含磷脂的相轉變溫度（例如55-60°C)以上，將試管置于水浴式超聲 振蕩器中震蕩并不停的轉動，使牛奶狀的磷脂徹底分散在緩沖溶液中直至得到透明的磷脂 溶液。
[0047] C.將透明的磷脂溶液轉移到西林瓶中（例如按每瓶1ml轉移到2ml的西林瓶中）， 蓋上橡膠塞，將瓶中的空氣置換成生物惰性氣體（例如六氟化硫或者全氟丙烷），然后用鋁 塑蓋和手握式壓蓋機密封，貼上標簽（例如4°C下）存儲備用。
[0048] D.將西林瓶從冰箱取出待其溫度恢復到室溫，用機械振蕩器制備微泡，靜置若干 時間（例如10分鐘）待其穩(wěn)定后即可使用。
[0049] 步驟S2,制備實施例1述及的微流控芯片。其中，制備一對叉指換能器，每個叉指 換能器有兩個共振頻率，其中一個共振頻率為另一個共振頻率的整數(shù)倍，例如分別為15MHz 和30MHz。將叉指換能器與PDMS腔道通過等離子處理的方法綁定，使其成為聲表面波微流 控芯片，此外還可以研究芯片的加工工藝，探索最佳涂膠厚度、曝光時間、以及鍍膜厚度；還 可以研究金屬膜材料、指條對數(shù)、聲孔徑尺寸對器件插入損耗及器件帶寬的影響。
[0050] 在制備這一對叉指換能器時，每個叉指換能器分為三部分：第一部分的叉指電極 對應的聲表面波共振頻率為例如15MHz，對應的指條寬度為65微米，在系統(tǒng)中主要起到富 集CTCs、血細胞的作用；第二部分為過渡帶，由于第一部分與第二部分的指條寬度不同，需 要過渡帶進行連接，但由于過渡帶的指條斜率較大，插入損耗較大，在系統(tǒng)中不起到篩選的 作用，只起到連接第一部分與第二部分指條的作用；第三部分的叉指電極對應的聲表面波 共振頻率為例如30MHz，對應的指條寬度為32. 5微米，在系統(tǒng)中主要起到分選CTCs的作用。 聲表面波微流控芯片的制備流程，主要包括涂膠、光刻、鍍膜、剝離、等離子處理等工藝，可 參考已有的相關技術實現(xiàn)。以下過程說明中以第一電極部分的聲波共振頻率為15MHz、第二 電極部分的聲波共振頻率為30MHz為例進行說明，但應理解，這些數(shù)值僅僅是為了描述上 方便而給出的距離，其它數(shù)值也是可以的，只要保證第二電極部分的聲波共振頻率為第一 電極部分的整數(shù)倍即可。
[0051] 芯片中的腔道為PDMS腔道，其包括兩個入口，分別進入外周血液與靶向細胞，出 口為三個，分別為CTCs、血細胞和CTCs，腔道的寬度為例如65微米，深度為例如50微米，一 種具體實現(xiàn)中可利用軟光刻的工藝制備PDMS腔道。
[0052] 步驟S3為CTCs富集階段（如圖2示意性示出的縱向的兩條虛線曲線截出的部 分），即將外周血液與靶向微泡分別通過兩個入口注入芯片內，在對叉指換能器施加15MHz 連續(xù)正弦信號，便可在PDMS腔道內形成一個駐波聲場，靶向微泡，血液中CTCs、紅細胞、白 細胞、血小板將聚集在駐波節(jié)點的位置，提高CTCs的濃度。另外，使CTCs與靶向微泡能夠 得到充分的接觸，靶向微泡能夠牢固的粘附在細胞表面，增強CTCs的聲學敏感性。
[0053] 在CTCs富集階段，當外周血液與靶向微泡通過注射泵注入到PDMS腔道內，微泡與 血細胞，CTCs均勻的散落在PDMS腔道內。對一對叉指換能器同時施加15MHz的連續(xù)正弦 信號，在PDMS腔道內構建以平面駐波聲場，細胞與微泡在駐波聲場內，受到的聲輻射力可 分別表達為： 5 - 2A
[0054] = %\4 sin(2kd)(kRr ? 5(Ι + ΛΡ) ⑴ πΡ〇\At kRdl-1 w2)sin(2M)
[0055] th =---^ , ^rf-
[0056] 通過公式（1)與公式（2)可知：細胞受到的聲輻射力方向與細胞的可壓縮比與密 度有關，而微泡受到的聲輻射力方向與微泡的共振頻率和聲波的共振頻率有關。本發(fā)明中， 由于細胞的密度大于液體介質密度，在駐波聲場中，細胞將向節(jié)點移動，并被捕獲在駐波聲 場節(jié)點位置。另一方面，磷脂微泡的共振頻率一般為2-8ΜΗζ，遠小于聲波頻率（15MHz)，微 泡最終也將被節(jié)點俘獲。這表明在本發(fā)明中微泡與細胞所受到的聲輻射力方向相同，并且 微泡與細胞均將被捕獲在駐波節(jié)點的位置，由于腔道內包含四分之一個波長，這樣細胞將 排列在駐波聲場中節(jié)點的位置，即腔道中心的部位。在這一階段，由于靶向微泡與CTCs均 停留在聲場節(jié)點的位置，靶向微泡與CTCs均具有較高的濃度，能夠使得靶向微泡與CTCs細 胞充分接觸，使得CTCs與靶向微泡通過表面配體與抗體的結合，微泡牢固的粘附在CTCs表 面，形成一個整體。
[0057] 步驟S4為CTCs篩選步驟。通過富集階段，CTCs、靶向微泡、紅細胞、白細胞、血小 板均將匯聚為一條直線，由于微流體的層流特性，富集的細胞在流過15MHz的駐波聲場后， 這些細胞仍然會在一條直線中移動。與此同時，對叉指換能器施加30MHz的連續(xù)正弦信號， 通過調節(jié)施加信號的電壓，使得粘附靶向微泡的CTCs發(fā)生偏移，CTCs細胞將移動到30MHz 聲場中的節(jié)點位置；而血液中的紅細胞、白細胞、血小板仍然在層流拽力的作用下依舊在 15MHz聲場中的節(jié)點位置移動，從而實現(xiàn)在血液中篩選CTCs的目的。
[0058] 在CTCs篩選階段（如圖2示意性示出的橫向的兩條虛線直線截出的部分），由于 微流體中流體的雷諾數(shù)很低，流體為層流，層流效應將使聚集的CTCs與血液細胞經(jīng)過第一 階段與過度帶后依舊沿著腔道的中心移動，這時通過對叉指換能器施加30MHz連續(xù)交流信 號，在PDMS腔道內形成一個30MHz的駐波聲場，這樣腔道內將會形成兩個駐波聲場的節(jié)點， 分別位于腔道的壁面位置，如圖2所示。通過公式（1)與公式（2)可知，在相同的情況下， 微泡的聲阻抗差異較大，微泡受到的輻射力遠大于細胞所受到的聲輻射力，所以，微泡的移 動速度遠大于細胞的移動速度。由于CTCs表面粘附了大量的靶向微泡，使得CTCs的聲阻 抗產(chǎn)生了明顯的差異，在相同的情況下，CTCs細胞比血液細胞受到的聲輻射力更大，對聲波 更敏感，更加容易移動到30MHz聲波的節(jié)點位置。這與免疫磁珠的方法有些類似，粘附磁珠 的細胞對磁場敏感，可移動到磁極位置。通過調節(jié)施加在叉指換能器的電壓，根據(jù)CTCs與 血液細胞的聲阻抗差異，可控制CTCs與血液細胞的移動，使得CTCs細胞移動到30MHz的節(jié) 點位置，即腔道的兩個壁面，而血液細胞受到的聲輻射力不足以抵抗層流引起的拽力，而依 舊沿著腔道的中心移動，從而實現(xiàn)篩選CTCs的目的。
[0059] -種示例中采用本實施例的細胞篩選方法進行實驗，該示例的實驗表明：
[0060] (1)靶向微泡制備與特異性腫瘤細胞的粘附。采用深圳先進技術研究院制備的 Lyp-Ι靶向微泡可與MDA-MB-453特異性粘附，而是非靶向微泡則不能夠與腫瘤細胞粘附， 如圖3和圖4所示，其中圖3表明靶向微泡可以與腫瘤細胞的粘附，而圖4表明非靶向微泡 不能與腫瘤細胞粘附。
[0061] (2)細胞的富集。為了研究聲表面波微流控芯片操控大量微納米顆粒的性能，將發(fā) 出紅色熒光的細胞以5 μ Ι/min的速度注入到PDMS腔道中。從實驗可以看出，開始時注射 泵壓力驅動細胞懸浮液，細胞在腔道內快速移動，當對兩個叉指換能器同時施加兩個相同 的射頻信號，細胞開始快速聚集，經(jīng)過約l〇s后，細胞被排列為一條直線，并且細胞熒光強 度隨著聚集細胞數(shù)量的增多而不斷增強。
[0062] (3)聲分選實驗研究。基于微機電系統(tǒng)（MEMS)工藝，制備聲表面波微流控芯片， 利用非對稱聲場形成的聲流效應聚集微泡。不例中，在一維駐波聲場中，細胞被排列為一條 直線，通過改變施加在叉指換能器的頻率，改變駐波聲場中節(jié)點位置，可實現(xiàn)細胞的橫向移 動，從而實現(xiàn)細胞的篩選。這種方法通過調節(jié)駐波場中行波的頻率，改變駐波場中節(jié)點位 置，從而引起微粒（細胞、微泡）任意定點移動，不僅能夠連續(xù)、精確、可控的移動微粒；還 可對微粒的運動軌跡進行編程和多維度的空間操控；更重要的是體外的細胞實驗證實，該 方法不會影響細胞的活性，可以實現(xiàn)篩選CTCs。利用頻率調制方法，微泡的移動分辨率為 2. 2 μ m,微泡移動的最大速度可達465 μ m/s。
[0063] (4)微泡與細胞在駐波聲場中受力。在15MHz駐波聲場中，將微泡和細胞同時注入 到微腔道內，施加駐波聲場，實驗發(fā)現(xiàn)微泡與細胞均朝向駐波聲場的節(jié)點位置移動，即微泡 與細胞所受到的聲輻射力方向一致，并且微泡的移動速度遠大于細胞，這表明微泡對聲波 更加敏感，更容易受到聲波的作用，也就是說可通過在CTCs表面粘附微泡增強CTCs的聲波 敏感性。
[0064] (5)實驗表明利用本實施例的細胞篩選方法進行篩選不會影響細胞的生物活性。 具體地，實驗通過實時量化觀測細胞活性，可以采用鈣黃綠素（Calcein-AM)和碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI)溶液，其可分別對活細胞和死細胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基 酯親脂性很高，可透過細胞膜，通過活細胞內的酯酶作用，脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein (鈣 黃綠素）發(fā)出強綠色熒光，因此Calcein-AM僅對活細胞染色。另一方面，作為核染色染料 的PI不能穿過活細胞的細胞膜。它穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的 DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光，因此PI僅對死細胞染色。利用Calcein AM/PI熒光雙染色 的特點，活細胞包質內酯酶可將Calcein-AM轉化為calcein，進而發(fā)出黃綠色突光。然而， PI可以通過壞死細胞紊亂的細胞膜與DNA結合，產(chǎn)生紅色的熒光。將細胞溶液分成三組：第 一組的細胞為陽性對照組，將細胞繼續(xù)放置在37°C的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；將第二組的細胞為聲 表面波篩選后的細胞；第三組的細胞為陰性對照組，將細胞放置在65°C的烘箱內烘烤1小 時。示例實驗結果顯示，在第一組中，幾乎所有的細胞都發(fā)出綠色的熒光，只有幾個細胞發(fā) 出紅色熒光，在第二組的被聲表面波篩選的細胞中，細胞發(fā)出綠色熒光的亮度與第一組的 細胞沒有明顯的差別，大概有85%的細胞在聲表面波的篩選后依舊保持其活性，這表明聲 表面波篩選不會明顯的影響細胞活性，而在第三組中，98%的細胞已經(jīng)凋亡，幾乎所有的細 胞都發(fā)出紅色熒光。這些結果表明，聲表面波篩選后的細胞活性與陽性對照組差別不大，表 明這種篩選方法不會對細胞的生物活性產(chǎn)生影響。
[0065] 綜上，本實施例的關鍵點如下：
[0066] 首先，是靶向微泡的引入。靶向微泡目前主要作為超聲造影劑被適用于超聲成像 中，靶向微泡也可在表面嵌入藥物實現(xiàn)超聲給藥的目的。然而，本實施例將靶向微泡作為一 種載體，粘附在細胞表面，增強細胞的聲阻抗差異，提高細胞受到的聲輻射力，加快CTCs的 橫向移動速度，提高CTCs分選效率。
[0067] 其次，本實施例提出利用聲表面波芯片作為CTCs分選芯片，聲表面波芯片通常作 為諧振器、濾波器廣泛的應用于電子產(chǎn)品中，主要利用聲表面波的電學信號，然而本實施例 主要利用聲表面作為驅動源，更注重的是聲表面波的驅動能力，是CTCs篩選的基礎。
[0068] 再次，是利用聲波富集CTCs。目前傳統(tǒng)的CTCs富集方法主要依靠流動聚焦原理， 芯片中需要鞘流的注入，引入鞘流不僅會對外周血、CTCs細胞進行稀釋，而且鞘流引起的剪 切應力有可能損傷CTCs的生物活性。本實施例利用駐波效應，將血液中CTCs、血細胞均富 集于駐波節(jié)點位置，不需要鞘流，更大程度上保護了細胞的生物效應。此外，本實施例不需 要先將CTCs與微泡混合，而是利用駐波聲場的勢阱效應，將靶向微泡與CTCs同時俘獲在駐 波節(jié)點位置，通過充分接觸，使CTCs表面充分、穩(wěn)定的粘附靶向細胞，提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性和 篩選的特異性。
[0069] 最后，對于篩選CTCs，本實施例通過調控聲波的頻率、幅值來分選CTCs細胞。通過 粘附靶向微泡，CTCs細胞對聲波更加敏感，更容易受到聲波的作用，CTCs更容易移動到駐 波聲場中節(jié)點位置（腔道兩側），而其他血細胞在較小的聲輻射力作用下不足以抵抗層流 引起的拽力作用，依舊沿原先的路徑移動（腔道中心），從而實現(xiàn)了分選目的。本實施例不 需要改變器件的結構、腔道的尺寸，只需要改變射頻信號的輸入便可實現(xiàn)細胞的分選。
[0070] 可以理解，對于上述實施例的基于的篩選方法，除了可以改變聲波的頻率、幅度， 還可以改變聲波的相位、幅度。而且，聲波分選芯片除了基于聲表面波，還可基于體聲波，即 利用壓電陶瓷為激勵源實現(xiàn)細胞篩選。此外，利用靶向微泡篩選CTCs的方法不僅僅適用于 CTCs，只要細胞之間的聲阻抗有差異，也適用與分選血液細胞，例如將血小板在血細胞中分 離。
[0071] 綜上各實施例可知，本發(fā)明通過構建聲波微流控芯片，并制備靶向微泡，首先將血 液中的CTCs富集，使CTCs與靶向微泡充分接觸，使靶向微泡粘附在CTCs表面，其后，通過 調控聲波的幅值、相位，篩選出血液中CTCs。這種基于祀向微泡的CTCs聲學篩選方法，可提 高篩選效率，而不影響細胞的生物活性，為腫瘤轉移早期提供新的診斷方法。
[0072] 以上內容是結合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā) 明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫 離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換。
【權利要求】
1. 一種用于對特異性細胞進行篩選的微流控芯片，包括基底（21)和附著于所述基底 上的腔道（23)，其特征在于，還包括聲波激勵源；所述腔道包括中間通道、位于所述中間通 道一端的用于供靶向微泡和含有特異性細胞的血液注入的入口（231，232)和位于所述中 間通道另一端的用于供分離出的特異性細胞和血細胞輸出的出口（233, 234, 235);所述聲 波激勵源位于基底上且位于所述中間通道的兩側，所述聲波激勵源包括沿所述中心通道并 向出口方向延伸的兩部分，其中靠近出口的第二部分對應的聲波共振頻率是遠尚出口的第 一部分對應的聲波共振頻率的整數(shù)倍。
2. 如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述聲波激勵源包括一對叉指換能 器（22)，所述叉指換能器位于基底上且位于所述中間通道的兩側，所述叉指換能器包括第 一電極部分（221)、第二電極部分（223)和用于連接所述第一電極部分和所述第二電極部 分的過濾帶（222)，所述第一電極部分對應所述遠離出口的第一部分，所述第二電極部分對 應所述靠近出口的第二部分。
3. 如權利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一電極部分的指條寬度為所 述第二電極部分的指條寬度的整數(shù)倍。
4. 如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底為128度YX雙面拋光的鈮 酸鋰晶體；所述腔道由聚二甲基硅氧烷材質制作；所述入口包括用于供靶向微泡注入的第 一入口（231)和用于供血液注入的第二入口（232)，所述出口包括用于供分離出的特異性 細胞輸出的第三出口（233)、第五出口（235)和用于供血細胞輸出的第四出口（234)，且所 述第四出口位于所述第三出口和所述第五出口之間。
5. 如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述聲波激勵源包括基于體聲波的 激勵源。
6. 如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述特異性細胞包括循環(huán)腫瘤細胞； 所述特異性細胞與所述靶向微泡的特異性不同，且所述靶向微泡在聲波激勵源的作用下粘 附于所述特異性細胞。
7. 如權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述腔道采用軟光刻工藝制作。
8. -種用于對特異性細胞進行篩選的方法，其特征在于，包括： 細胞富集步驟：將含有特異性細胞的血液和已制備的靶向微泡注入如權利要求1所述 的微流控芯片，當所述血液和所述靶向微泡移動到與所述第一部分相對應的位置時，對所 述微流控芯片施加信號以在所述腔道內形成駐波聲場，且使得血液中的血細胞以及與靶向 微泡充分接觸的特異性細胞沿所述中心通道并朝向出口方向移動； 細胞分選步驟：當所述血液和所述靶向微泡移動到與所述第二部分相對應的位置時， 調整所述信號的頻率或相位，從而使得靶向微泡及與其充分接觸的特異性細胞的移動速度 大于血細胞的移動速度。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述特異性細胞為循環(huán)腫瘤細胞；所述靶向 微泡的制備包括： 步驟A :在容器中按一定比例將一定量的二硬脂酰磷脂酰膽堿、聚乙二醇2000修飾二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺溶解在三氯甲烷中且在渦旋混合器上混勻，通入氮氣除去三氯甲烷并 使磷脂在容器壁上形成一層均勻的薄膜，真空干燥若干小時； 步驟B:在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入經(jīng)脫氣處理的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶 液，所述緩沖溶液含有10%體積的甘油和10%體積的丙二醇，加熱所述緩沖溶液到相轉變 溫度以上，水浴超聲震蕩使磷脂溶液分散徹底直至透明； 步驟C:將透明的磷脂溶液分裝置西林瓶中，并將西林瓶中的空氣置換為生物惰性氣 體； 步驟D :震蕩西林瓶從而制備出微泡。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述微流控芯片的聲波激勵源為位 于基底上且位于所述中間通道的兩側的一對叉指換能器，所述叉指換能器包括第一電極部 分、第二電極部分和用于連接所述第一電極部分和所述第二電極部分的過濾帶，所述第一 電極部分對應的聲波共振頻率為所述第二電極部分對應的聲波共振頻率的整數(shù)倍。
【文檔編號】C12M1/00GK104195028SQ201410382668
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優(yōu)先權日:2014年8月5日
【發(fā)明者】鄭海榮, 孟龍, 蔡飛燕, 牛麗麗, 李飛, 肖楊 申請人:深圳先進技術研究院