一種冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明冬蟲夏草發(fā)酵培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，包括準(zhǔn)備半連續(xù)發(fā)酵罐、培養(yǎng)基準(zhǔn)備、發(fā)酵檢測、濃縮菌絲體，分離發(fā)酵液和孢子、繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)步驟，通過過濾時選擇膜過濾器，甚至選擇選擇性膜過濾，減少進(jìn)入濾液的菌絲體，既能提高菌絲體的收率，降低濾液的COD，降低污水處理量，又不破壞細(xì)胞本身，保證胞內(nèi)有效成分的全部回收；選擇性膜過濾系統(tǒng)對于菌絲和孢子的分離效果好，分離出來的冬蟲夏草孢子數(shù)量較大，并且環(huán)境變換溫和，所以縮短了種子液的適應(yīng)時間，直接進(jìn)入倍增發(fā)酵過程，從而發(fā)酵周期也隨之縮短16個小時左右；提高了生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)電耗，獲得較好的效益。
【專利說明】一種冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明冬蟲夏草發(fā)酵培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù) 培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草是國家二類保護(hù)植物，主要分布于西藏、青海、四川、云南和甘肅等省 (區(qū)）的高山草甸中，具有滋腎補(bǔ)肺、養(yǎng)心益肝、增強(qiáng)抗病能力的功效。但，由于冬蟲夏草成 長的特殊性，變得十分的稀有和珍貴，而國內(nèi)外對冬蟲夏草的需求量成倍增長，價格猛增， 促使了人們過度采挖，嚴(yán)重的破壞了冬蟲夏草自然資源，為了滿足市場的需求，緩解冬蟲夏 草自然資源的破壞，人工培養(yǎng)冬蟲夏草的思路得到了開拓。當(dāng)前，已經(jīng)形成了對冬蟲夏進(jìn)行 人工培養(yǎng)的諸多方法，并且，深層發(fā)酵生產(chǎn)的冬蟲夏草菌絲與天然的冬蟲夏草具有相似的 成份和類同的藥理作用，因此，目前普遍采用的是液體深層發(fā)酵工藝來培養(yǎng)冬蟲夏草。
[0003] 但是，在冬蟲夏草菌深層發(fā)酵工藝中，均是采用孢子與發(fā)酵液分離之后，再將孢子 作為種子液來進(jìn)行下一次發(fā)酵生產(chǎn)，這樣使得孢子種子液需要再度適應(yīng)環(huán)境，可在進(jìn)行孢 子與發(fā)酵液分離，通常是采用板框過濾的方式，來分離發(fā)酵液和冬蟲夏草菌絲體，這樣使得 進(jìn)入濾液的菌絲體較多，菌絲體的收率較低，污水的處理量較大，細(xì)胞體容易被損壞，丟失 掉細(xì)胞內(nèi)的部分有效成分。
[0004] 并且，冬蟲夏草菌絲的生長條件較為嚴(yán)格、生長速度慢，使得發(fā)酵培養(yǎng)周期長，造 成發(fā)酵能耗大，發(fā)酵成本高，進(jìn)而使得生產(chǎn)效率低，培養(yǎng)成本大。
[0005] 為此，有研究者從上述技術(shù)問題對冬蟲夏草菌絲體的分離提取方法以及冬蟲夏草 菌絲粉的生產(chǎn)方法做出了研究，如專利號為CN201210344464. 5的《一種基于膜技術(shù)提取蟲 草被孢菌絲體的方法》的發(fā)明專利公開了將蟲草被孢發(fā)酵液通過微濾膜處理分離得到蟲草 被孢菌絲體，改變了傳統(tǒng)蟲草被孢分離所用離心方式；專利號為CN200810095732. 8的《用 膜過濾生產(chǎn)冬蟲夏草菌絲粉的方法》公開了把發(fā)酵法生產(chǎn)的最終菌液用轉(zhuǎn)鼓真空過濾，得 到的濾液采用膜過濾法進(jìn)行過濾，過濾后的固體物經(jīng)微波干燥、粉碎得冬蟲夏草菌絲粉，過 濾后的濾液經(jīng)濃縮、噴霧干燥后得冬蟲夏草營養(yǎng)粉，此方法可有效回收約10?25%的冬蟲 夏草菌絲，它減少了很大浪費(fèi)，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，有很好的經(jīng)濟(jì)和社會效 益；即以上現(xiàn)有技術(shù)沒有從冬蟲夏草培養(yǎng)過程的營養(yǎng)保護(hù)作出研究，即使采用膜過濾的方 式來替代傳統(tǒng)的離心方式，避免蟲草細(xì)胞體的破損，排除部分營養(yǎng)流入發(fā)酵液中，但其效果 均較為不理想；并且對于冬蟲夏草的培養(yǎng)周期沒有作出研究，使得冬蟲夏草的培養(yǎng)成本較 大，利潤較低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種冬蟲夏草發(fā)酵液回收 孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其具有：能夠有效分離冬蟲夏草發(fā)酵液與孢子，使得孢子數(shù)量較大， 孢子作為種子液進(jìn)行再次培養(yǎng)的環(huán)境條件溫和，縮短孢子種子液對環(huán)境的適應(yīng)時間，進(jìn)而 縮短冬蟲夏草的發(fā)酵培養(yǎng)時間，提高了生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)電耗等特征。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述的發(fā)明目的，本發(fā)明具體是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0009] (1)準(zhǔn)備半連續(xù)發(fā)酵罐：使用凈化蒸汽對空罐、管道、過濾器及閥門在壓力為 0.1?0.15MPa，溫度121?124°C，持續(xù)滅菌30?50min;并將空罐、管道、過濾器以及閥 門連接起來；
[0010] (2)培養(yǎng)基準(zhǔn)備：將培養(yǎng)基裝入步驟1)的空罐之中，裝入量為空罐體積容量的 50-55%，并在壓力為0· 12?0· 15MPa，溫度121?126°C條件下滅菌35-45min;隨后，更換 無菌風(fēng)維持壓力，啟動冷水循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行降溫到20?30°C后，接種發(fā)酵培養(yǎng)；
[0011] (3)發(fā)酵檢測：當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到100_120h后，對發(fā)酵罐取樣，進(jìn)行發(fā)酵液檢測，當(dāng)分 生孢子>90%的脫落母體孢子梗，孢子梗數(shù)量增加不明顯時，菌絲培養(yǎng)結(jié)束；
[0012](4)濃縮菌絲體，分離發(fā)酵液和孢子：將步驟3)中的含有菌絲體及孢子的培養(yǎng)液， 經(jīng)過過濾器進(jìn)行過濾處理，獲得冬蟲夏草的孢子和部分發(fā)酵液；
[0013](5)繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟4)獲得的冬蟲夏草孢子和純凈的發(fā)酵液以及原料液再 返回半連續(xù)發(fā)酵罐中，作為發(fā)酵罐的種子，繼續(xù)進(jìn)行冬蟲夏草的半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0014] 較佳的，所述的步驟1)滅菌的壓力為0· 12?0· 13MPa，溫度122?123°C，持續(xù)時 間為40min。
[0015] 較佳的，所述的步驟2)滅菌的壓力為0·13?0·14MPa，溫度為123?124°C，持續(xù) 時間為40min。
[0016] 優(yōu)選地，所述的步驟2)中采用冷水循環(huán)系統(tǒng)降溫到25°C。
[0017] 優(yōu)選地，所述的步驟2)中培養(yǎng)基的組成為葡萄糖2.0%、蛋白胨4.0%、 KH2P040. 20%、MgS040. 10%、玉米漿 0. 15%、糖蜜 0. 25%、其余為水。
[0018] 較佳的，所述的步驟3)中發(fā)酵檢測是當(dāng)發(fā)酵到105?115h后，對發(fā)酵罐內(nèi)的液體 取樣檢測。
[0019] 優(yōu)選地，所述的步驟3)中發(fā)酵檢測是當(dāng)發(fā)酵到IlOh后，對發(fā)酵罐內(nèi)的液體取樣檢 測。
[0020] 較佳的，所述步驟4)中經(jīng)過過濾器進(jìn)行過濾處理的過濾為膜過濾。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟4)中經(jīng)過過濾器進(jìn)行過濾處理的過濾為選擇性膜過濾。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果體現(xiàn)在：
[0023] ①通過對培養(yǎng)設(shè)備的恰當(dāng)處理，排除了培養(yǎng)種子受到外界菌種的污染影響，確保 了菌種的成活率，降低培養(yǎng)成本。
[0024] ②通過對發(fā)酵進(jìn)行的程度進(jìn)行恰當(dāng)?shù)母櫃z測，確保孢子脫離母體達(dá)到最大限 度，提高發(fā)酵液中孢子含量的最大化率，增大了孢子回收率以及確保后續(xù)培養(yǎng)的種子供應(yīng)， 提高了菌絲體的收率。
[0025] ③通過培養(yǎng)理化條件的恰當(dāng)處理，使整個培養(yǎng)過程的理化環(huán)境條件，均適宜冬蟲 夏草菌絲的生長，進(jìn)一步的提高菌絲體的回收率，降低培養(yǎng)成本。
[0026] ④選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基來對冬蟲夏草孢子進(jìn)行培養(yǎng)，補(bǔ)充了冬蟲夏草的營養(yǎng)成分， 提高了人工培養(yǎng)冬蟲夏草的市場價值。
[0027] ⑤通過過濾時選擇膜過濾器，甚至選擇選擇性膜過濾，減少進(jìn)入濾液的菌絲體，既 能提高菌絲體的收率，降低濾液的COD，降低污水處理量，又不破壞細(xì)胞本身，保證胞內(nèi)有效 成分的全部回收，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和環(huán)境效益。
[0028] ⑥選擇性膜過濾系統(tǒng)對于菌絲和孢子的分離效果好，分離出來的冬蟲夏草孢子數(shù) 量較大，并且環(huán)境變換溫和，所以縮短了種子液的適應(yīng)時間，直接進(jìn)入倍增發(fā)酵過程，從而 發(fā)酵周期也隨之縮短16個小時左右；提高了生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)電耗，獲得較好的效益。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體的實(shí)施方式來對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的限定，但要求保護(hù)的 范圍不僅局限于所作的描述。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 選擇發(fā)酵系統(tǒng)為5m3作為冬蟲夏草半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)系統(tǒng)，使用凈化蒸汽對空罐、管 道、過濾器及閥門在壓力為0.IMPa，溫度121°C，持續(xù)滅菌50min;并將空罐、管道、過濾器 以及閥門連接起來；將由葡萄糖2. 0 %、蛋白胨4. 0 %、KH2P040. 20 %、MgS040. 10 %、玉米 漿0. 15%、糖蜜0. 25%、其余為水組成的培養(yǎng)基裝入空罐之中，裝入量為空罐體積容量的 50%，并在壓力為0· 12MPa，溫度121°C條件下滅菌45min;隨后，更換無菌風(fēng)維持壓力，啟動 冷水循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行降溫到20°C后，接種發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到IOOh后，對發(fā)酵罐取樣，進(jìn) 行發(fā)酵液檢測，當(dāng)分生孢子達(dá)到90%的脫落母體孢子梗，孢子梗數(shù)量增加不明顯時，菌絲培 養(yǎng)結(jié)束；將含有菌絲體及孢子的培養(yǎng)液，經(jīng)過過濾器進(jìn)行過濾處理，獲得冬蟲夏草的孢子和 部分發(fā)酵液；再將冬蟲夏草孢子和純凈的發(fā)酵液以及原料液再返回半連續(xù)發(fā)酵罐中，作為 發(fā)酵罐的種子，繼續(xù)進(jìn)行冬蟲夏草的半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 選擇發(fā)酵系統(tǒng)為5m3作為冬蟲夏草半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)系統(tǒng)，使用凈化蒸汽對空罐、管 道、過濾器及閥門在壓力為0. 15MPa，溫度124°C，持續(xù)滅菌30min;并將空罐、管道、過濾器 以及閥門連接起來；將由葡萄糖2. 0 %、蛋白胨4. 0 %、KH2P040. 20 %、MgS040. 10 %、玉米 漿0. 15%、糖蜜0. 25%、其余為水組成的培養(yǎng)基裝入空罐之中，裝入量為空罐體積容量的 55 %，并在壓力為0· 15MPa，溫度126 °C條件下滅菌35min;隨后，更換無菌風(fēng)維持壓力，啟動 冷水循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行降溫到30°C后，接種發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到120h后，對發(fā)酵罐取樣，進(jìn) 行發(fā)酵液檢測，當(dāng)分生孢子達(dá)到99. 9%的脫落母體孢子梗，孢子梗數(shù)量增加不明顯時，菌絲 培養(yǎng)結(jié)束；將含有菌絲體及孢子的培養(yǎng)液，經(jīng)過過濾器進(jìn)行選擇性透過膜過濾處理，獲得冬 蟲夏草的孢子和部分發(fā)酵液；再將冬蟲夏草孢子和純凈的發(fā)酵液以及原料液再返回半連續(xù) 發(fā)酵罐中，作為發(fā)酵罐的種子，繼續(xù)進(jìn)行冬蟲夏草的半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0034] 實(shí)施例3
[0035] 選擇發(fā)酵系統(tǒng)為5m3作為冬蟲夏草半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)系統(tǒng)，使用凈化蒸汽對空罐、 管道、過濾器及閥門在壓力為0. 13MPa，溫度123°C，持續(xù)滅菌40min;并將空罐、管道、過濾 器以及閥門連接起來；將由葡萄糖2. 0%、蛋白胨4. 0%、KH2P040. 20%、MgS040. 10%、玉米 漿0. 15%、糖蜜0. 25%、其余為水組成的培養(yǎng)基裝入空罐之中，裝入量為空罐體積容量的 53%，并在壓力為0· 12MPa，溫度123°C條件下滅菌40min;隨后，更換無菌風(fēng)維持壓力，啟動 冷水循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行降溫到25°C后，接種發(fā)酵培養(yǎng)；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到IlOh后，對發(fā)酵罐取樣，進(jìn) 行發(fā)酵液檢測，當(dāng)分生孢子達(dá)到95%的脫落母體孢子梗，孢子梗數(shù)量增加不明顯時，菌絲培 養(yǎng)結(jié)束；將含有菌絲體及孢子的培養(yǎng)液，經(jīng)過過濾器進(jìn)行反滲透膜過濾處理，獲得冬蟲夏草 的孢子和部分發(fā)酵液；再將冬蟲夏草孢子和純凈的發(fā)酵液以及原料液再返回半連續(xù)發(fā)酵罐 中，作為發(fā)酵罐的種子，繼續(xù)進(jìn)行冬蟲夏草的半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0036] 實(shí)施例4-9
[0037] 在實(shí)施例1-3的基礎(chǔ)上，實(shí)施例4-9的【具體實(shí)施方式】數(shù)值變化如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 準(zhǔn)備半連續(xù)發(fā)酵罐：使用凈化蒸汽對空罐、管道、過濾器及閥門在壓力為0. 1? 0. 15MPa，溫度121?124°C，持續(xù)滅菌30?50min ;并將空罐、管道、過濾器以及閥門連接起 來； (2) 培養(yǎng)基準(zhǔn)備：將培養(yǎng)基裝入步驟1)的空罐之中，裝入量為空罐體積容量的 50-55%，并在壓力為0· 12?0· 15MPa，溫度121?126°C條件下滅菌35-45min;隨后，更換 無菌風(fēng)維持壓力，啟動冷水循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行降溫到20?30°C后，接種發(fā)酵培養(yǎng)； (3) 發(fā)酵檢測：當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到100_120h后，對發(fā)酵罐取樣，進(jìn)行發(fā)酵液檢測，當(dāng)分生孢 子> 90%的脫落母體孢子梗，孢子梗數(shù)量增加不明顯時，菌絲培養(yǎng)結(jié)束； (4) 濃縮菌絲體，分離發(fā)酵液和孢子：將步驟3)中的含有菌絲體及孢子的培養(yǎng)液，經(jīng)過 過濾器進(jìn)行過濾處理，獲得冬蟲夏草的孢子和部分發(fā)酵液； (5) 繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟4)獲得的冬蟲夏草孢子和純凈的發(fā)酵液以及原料液再返回 半連續(xù)發(fā)酵罐中，作為發(fā)酵罐的種子，繼續(xù)進(jìn)行冬蟲夏草的半連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于：所述 的步驟1)滅菌的壓力為〇· 12?0· 13MPa，溫度122?123°C，持續(xù)時間為40min。
3. 如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于：所述 的步驟2)滅菌的壓力為0· 13?0· 14MPa，溫度為123?124°C，持續(xù)時間為40min。
4. 如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于：所述 的步驟2)中采用冷水循環(huán)系統(tǒng)降溫到25°C。
5. 如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于：所述 的步驟2)中培養(yǎng)基的組成為葡萄糖2. 0%、蛋白胨4. 0%、ΚΗ2Ρ040. 20%、MgS040. 10%、玉米 漿0. 15%、糖蜜0. 25%、其余為水。
6. 如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于：所述 的步驟3)中發(fā)酵檢測是當(dāng)發(fā)酵到105?115h后，對發(fā)酵罐內(nèi)的液體取樣檢測。
7. 如權(quán)利要求1或6所述的冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于： 所述的步驟3)中發(fā)酵檢測是當(dāng)發(fā)酵到110h后，對發(fā)酵罐內(nèi)的液體取樣檢測。
8. 如權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于：所述 步驟4)中經(jīng)過過濾器進(jìn)行過濾處理的過濾為膜過濾。
9. 如權(quán)利要求1或8所述的冬蟲夏草發(fā)酵液回收孢子半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于： 所述步驟4)中經(jīng)過過濾器進(jìn)行過濾處理的過濾為選擇性膜過濾。
【文檔編號】C12R1/645GK104263651SQ201410382718
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】史蘭東, 藤國霞 申請人:貴州黔坤生物制藥有限公司