ZmHINT基因在促進(jìn)植物免疫反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種ZmHINT基因在促進(jìn)植物免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。如下任一物質(zhì)在提高植物免疫能力和/或增強(qiáng)植物抗病性中的應(yīng)用：(1)SEQ?ID?No.4所示的蛋白；(2)SEQ?ID?No.4所示蛋白的編碼基因；(3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。本發(fā)明證明ZmHINT基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)擬南芥的抗病能力，說(shuō)明ZmHINT基因在植物免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】ZmH I NT基因在促進(jìn)植物免疫反應(yīng)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種ZmHINT基因在促進(jìn)植物免疫反應(yīng)中的應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 組氨酸三聚體蛋白超家族是一個(gè)具有核苷酸轉(zhuǎn)移酶和水解酶活性的家族，其中， 組氨酸三聚體核苷結(jié)合蛋白（Histidine triad nucleotide binding protein，HINT)是組 氨酸三聚體蛋白超家族成員中分布最為廣泛的一種蛋白，該蛋白在低等植物和高等動(dòng)物中 均具有很高的結(jié)構(gòu)和功能相似性。晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，HINT是其他四種組氨酸三聚體 蛋白超家族成員的祖先，結(jié)構(gòu)和功能的保守性，預(yù)示了 HINT發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。目 前，有研究報(bào)道了關(guān)于哺乳動(dòng)物HINT在細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。相對(duì) 動(dòng)物HINT的研究，植物HINT的功能研究較少，尤其是對(duì)玉米HINT在植物免疫反應(yīng)中的功 能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種ZmHINT基因在促進(jìn)植物免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明提供如下任一物質(zhì)在提高植物免疫能力和/或增強(qiáng)植物抗病性中的應(yīng)用：
[0005] (l)SEQ ID No. 4 所示的蛋白；
[0006] (2) SEQ ID No. 4所示蛋白的編碼基因；
[0007] (3)含有（2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述編碼基因如SEQ ID No. 3中自5'末端起第9位至第398位核苷 酸所示。
[0009] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述免疫為針對(duì)禾谷鐮刀菌引起的疾病的免疫；
[0010] 所述抗病為抗禾谷鐮刀菌引起的疾病。
[0011] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述植物為擬南芥；
[0012] 所述禾谷鐮刀菌為禾谷鐮刀菌PH-1。
[0013] 一種制備免疫能力提高和/或抗病性增強(qiáng)的植物的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍，包括如下步驟：將SEQ ID No. 4所示蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物； 與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的免疫能力提高和/或抗病性增強(qiáng)。
[0014] 上述方法中，所述編碼基因是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的，所述重組表達(dá)載體是將 所述編碼基因插入出發(fā)載體PCAMBIA-1304的多克隆位點(diǎn)得到的。
[0015] 上述任一所述的方法中，所述編碼基因如SEQ ID No. 3中自5'末端起第9位至第 398位核苷酸所示；
[0016] 所述重組表達(dá)載體是將SEQ ID No. 3所示的DNA分子插入出發(fā)載體pCAMBIA-1304 的Ncol和Spel酶切位點(diǎn)間得到的。
[0017] 上述任一所述的方法中，所述免疫為針對(duì)禾谷鐮刀菌引起的疾病的免疫；
[0018] 所述抗病為抗禾谷鐮刀菌引起的疾病。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述植物為擬南芥；
[0020] 所述禾谷鐮刀菌為禾谷鐮刀菌PH-1。
[0021] 本發(fā)明證明ZmHINT基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)擬南芥的免疫能力，說(shuō)明 ZmHINT基因在增強(qiáng)植物抗病能力方面具有重要作用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為重組農(nóng)桿菌和對(duì)照農(nóng)桿菌的PCR鑒定。
[0023] 圖2為不同濃度的潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)ZmHINT基因 T1代擬南芥的篩選。
[0024] 圖3為轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥以及轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代擬南芥 的潮霉素抗性篩選。
[0025] 圖4為轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥、轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代擬南芥以 及野生型擬南芥的PCR鑒定。
[0026] 圖5為人工接種禾谷鐮刀菌菌株P(guān)H-1后擬南芥花序部位的表型分析。
[0027] 圖6為人工接種禾谷鐮刀菌菌株P(guān)H-1后擬南芥葉片的表型分析。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0029] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] GC Buffer購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為9154。
[0031] B73 玉米自交系（Zea mays ssp. mays L.)在文獻(xiàn) "Patrick S. Schnable, et al. The B73 Maize Genome:Complexity, Diversity, and Dynamics. Science 326, 1112-1115 (2009) "中公開(kāi)過(guò)，公眾可從河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0032] 擬南芥（Arabidopsis thaliana)哥倫比亞型（Columbia-0)在文獻(xiàn)"Xiao Luo, Xi Bai, Xiaoli Sun, Dan Zhu, Baohui Liu, Wei Ji,Hua Cai, Lei Cao, Jing ffu, Mengran Hu, Xin Liu, Lili Tang and Yanming Zhu. Expression of wild soybean WRKY20 in Arabidopsis enhances drought tolerance and regulates ABA signaling. Journal of Experimental Botany. 2013. "中公開(kāi)過(guò)，公眾可從河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0033] MS鹽購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為M5524-50L。
[0034] MS鹽溶液：該溶液由溶劑和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)為MS鹽，蔗糖和Silwet L-77,溶劑 為蒸餾水。MS鹽在MS鹽溶液中的濃度為2. 15g/L，Silwet L-77在MS鹽溶液中的濃度為 200 μ 1/L，蔗糖在MS鹽溶液中的濃度為5 %" ％ "代表質(zhì)量體積百分含量"g/100ml "，調(diào)pH =5. 8。
[0035] YEP液體培養(yǎng)基按照如下方法制備：
[0036] 牛肉膏5. 0 g/L，蛋白胨5. 0 g/L，酵母提取物1. 0 g/L，鹿糖5. 0 g/L， MgS04 · 7H200. 5 g/L，余量為去離子水，調(diào)pH = 7. 0后滅菌保存。
[0037] CMC產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基的配制：羧甲基纖維素7. 5 g/L，ΝΗ4Ν030· 5g/L，ΚΗ2Ρ030 · 5g/L， MgS04. 7Η20 0. 25 g/L，酵母提取物0. 5 g/L，余量為去離子水，調(diào)pH = 7. 0后滅菌保存。
[0038] 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens) GV3101 在文獻(xiàn) "Wei Tang, Ron Sederoff, Ross Whetten.Regeneration of transgenic loblolly pine (Pinus taeda L. ) from zygotic embryos transformed with Agrobacterium tumefaciens. Planta (2001) 213:981-989. "中公開(kāi)過(guò)，公眾可從河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0039] 禾谷鎌刀菌（Fusarium graminearum)PH-1 在文獻(xiàn) "RUBELLA S. GOSWAMI AND H.CORBY KISTLER. Heading for disaster:Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology (2004) 5 (6) : 515 - 525. "中公開(kāi)過(guò)，公眾可從河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獲 得。
[0040] pMD 18-T Simple載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為6011。
[0041] 載體 pCAMBIA_l3〇4 在文獻(xiàn) "Ruchi Pandey, Avinash Mishra, G. K. Garg. Plant promoter driven heterologous expression of HMW glutenin gene(s)subunit in E.coli. Mol Biol R印（2008) 35:153 - 162."中公開(kāi)過(guò)，公眾可從河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0042] 實(shí)施例1、ZmHINT基因過(guò)表達(dá)載體及重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建
[0043] -、引物設(shè)計(jì)與合成
[0044] 根據(jù)ZmHINT基因編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成如下引物：
[0045] F7 :5,-ACCCATGGATGTCGTCGGAGAAGGAGGC-3, ； (SEQ ID No. 1)
[0046] R7 :5'-CGGCACTAGTTTAGCCTGGGGGCCAGTTCA-3'。(SEQ ID No. 2)
[0047] 其中 5' -CCATGG-3' 為 Ncol 酶切位點(diǎn)，5' -ACTAGT-3' 為 Spel 酶切位點(diǎn)。
[0048] 二、提取B73玉米自交系的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以B73玉米自交系的cDNA為 模板，以F7和R7為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如SEQ ID No. 3所示。
[0049] PCR反應(yīng)體系：
[0050] 校板 cDNA (100ng/W.) 1μ 1 GC Buffer (0. 2ηηο1/μΙ) 12? 5 μ i dNTF (lOminoI/μΙ) 2μ 1 R7 (lOpmol/μΙ)_1 P 1.
[0051] F7 (1〇?)?ηοΙ/μΙ ) 1μ 1 LA Taq DXA 聚ftift (SU/μΙ) 0· 5 μ 1 _(卿)_7￡j_ 總體積 25 μ I
[0052] PCR反應(yīng)條件：
[0053] 95 °C 5η?η 95 °C 50 s ^ 62 °C 50s P 35 個(gè)循環(huán) 72V 90s J 72 °C 1 Drain
[0054] 三、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD 18-T Simple載體得到重組質(zhì)粒，將其命名為 pMD-ZmHINT-2,將 pMD-ZmHINT-2 送測(cè)序，結(jié)果正確。
[0055] 四、Ncol和Spel雙酶切pMD-ZmHINT-2,得到基因片段；Ncol和Spel雙酶切 pCAMBIA-1304,得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名 為 pCAMBIA1304-ZmHINT-2,將 pCAMBIA1304-ZmHINT-2 質(zhì)粒送測(cè)序，結(jié)果正確。
[0056] ZmHINT基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3中自5'末端起第9位至第398位核苷 酸所示。
[0057] ZmHINT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 4示。
[0058] 五、重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建
[0059] 將 pCAMBIAl3〇4-ZmHINT_2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens) GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。同時(shí)將空載體pCAMBIA-1304轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens) GV3101，得到對(duì)照農(nóng)桿菌。
[0060] 具體步驟如下：
[0061] (一）重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-ZmHINT-2和空載體pCAMBIA-1304轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌
[0062] 各取1 μ g構(gòu)建好的pCAMBIA1304-ZmHINT-2重組質(zhì)粒和pCAMBIA-1304空載體的 質(zhì)粒，采用先液氮冷凍，再熱擊的方法轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌GV3101中。然后將轉(zhuǎn)化后的根癌 農(nóng)桿菌GV3101涂布于含抗生素100 μ g/ml Kan的YEP平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48小時(shí)。然后各 挑選5個(gè)單克隆，接種于含相應(yīng)抗生素的YEP (100 μ g/ml Kan，125 μ g/ml利福平）液體培 養(yǎng)基中，28°C，200rpm/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到單克隆菌液，用做PCR鑒定。
[0063] (二）PCR 鑒定
[0064] l、pCAMBIA1304-ZmHINT-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101后單克隆菌液PCR鑒 定體系：
[0065] 中-克_阱液 2μ I GC Buffer (0. 2ι?]?ηοΙ/μ1 ) 12. 5 μ 1 dXTP (10πιιηο1/μ1 ) 2 μ I R6 (1 Οριηο I/μ? ) 1 μ I Η6 (lOpmoi/μ!) 1 μ I LA Ta+q DM 聚 fVFi (5υ/μ.Ι ) 0. 5 μ ? _ddH,0_6pJ__ 總體積 25 μ 1
[0066] PCR反應(yīng)條件：
[0067] 95°C 5min 9550s η 62°C 50s卜35個(gè)循環(huán) 72? 90s J 72? lOnin
[0068] 2、pCAMBIA-1304質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101后單克隆菌液PCR鑒定體系：
[0069] 率克隆丨ii液 2ul GC Buffer (0. 2mmol/Hl) 12.5 μ 1 dXTP (j〇mmo】/M] ) 2μ 1 R8 (JOpmol/μΙ) 1 μ 1 F8 (lOpmot/μΙ) 1μ 1 LA Taq DXA 聚合_ (5υ/μ1) Ο, 5 μ I ddH；() 6 μ 1 總體積 25 μ !
[0070] PCR反應(yīng)條件：
[0071] 5 L 5min 95 °C 50 s ? 55°C 40s _ 35 個(gè)伽環(huán) ITC 30 s ^ 72°C l Oin i π
[0072] F6 ：5'-ATGTCGTCGGAGAAGGAGGC-3' ； (SEQ ID No. 5)
[0073] R6 ：5'-TTAGCCTGGGGGCCAGTTCA-3, ； (SEQ ID No. 6)
[0074] F8:5,-AACAGAACTCGCCGTAA-3，；（SEQ ID No. 7)
[0075] R8:5'-GTCAAGAGTCCCCCGTGTT-3'。（SEQ ID No. 8)
[0076] 同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)任何質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌GV3101進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照。
[0077] 3、將步驟1和步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所 /_J、1 〇
[0078] 圖1A為重組農(nóng)桿菌（轉(zhuǎn)pCAMBIA1304-ZmHINT-2質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌GV3101)的 PCR鑒定，圖1B為對(duì)照農(nóng)桿菌（轉(zhuǎn)pCAMBIA-1304質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌GV3101)的PCR鑒定。
[0079] 圖1A中，Μ為DNA marker, 1-3為三個(gè)重組農(nóng)桿菌克隆。
[0080] 圖1B中，Μ為DNA marker, 1-4為四個(gè)對(duì)照農(nóng)桿菌克隆，5為未轉(zhuǎn)任何質(zhì)粒的根癌 農(nóng)桿菌GV3101。
[0081] 圖1A表明，重組農(nóng)桿菌中含有目的基因（ZmHINT基因），其長(zhǎng)度約400bp，表明重 組農(nóng)桿菌構(gòu)建成功。
[0082] 圖1B表明，對(duì)照農(nóng)桿菌中含有空載體pCAMBIA-1304中長(zhǎng)度為514bp的目的條帶， 該目的序列如SEQ ID No. 9所示，表明對(duì)照農(nóng)桿菌構(gòu)建成功。
[0083] 實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備
[0084] 一、待轉(zhuǎn)化擬南芥的制備
[0085] ( 一）將擬南芥（Arabidopsis thaliana)哥倫比亞型（Columbia-0)(以下簡(jiǎn)稱(chēng) 野生型擬南芥）的種子置于1. 5ml離心管中，6. 25% NaC10(6. 25ml NaCIO原液，0. 01ml的 Triton X-100,用 ddH20 定容到 100ml)消毒 15 分鐘。
[0086] (二）ddH20清洗種子6次，待種子沉下后，棄上層ddH20。
[0087] (三）將種子播種于1/2MS培養(yǎng)基平板上，避光4°C春化72h。
[0088] (四）將平板置于光照培養(yǎng)箱中（21 °C，每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)），生長(zhǎng)8-10 天，得到萌發(fā)的擬南芥幼苗。
[0089] (五）將擬南芥幼苗移入營(yíng)養(yǎng)土中（草炭土 ：蛭石=1 :1，體積比），在溫室（21°C， 每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)）條件下生長(zhǎng)，盛花期時(shí)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
[0090] 二、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥
[0091] (一）將步驟一得到的擬南芥在轉(zhuǎn)化前一天澆足水。
[0092] (二）分別將實(shí)施例1制備的重組農(nóng)桿菌和對(duì)照農(nóng)桿菌接種于YEP液體培養(yǎng)液 (Kan50y g/ml，利福平50μ g/ml)中，28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（同時(shí)接種幾個(gè)不同的克隆）。
[0093] (三）將培養(yǎng)過(guò)夜的不同克隆的重組農(nóng)桿菌菌液混合在一起，共500ml，記作重組 菌混合液。同時(shí)將培養(yǎng)過(guò)夜的不同克隆的對(duì)照農(nóng)桿菌菌液混合在一起，共500ml，記作對(duì)照 菌混合液。分別取重組菌混合液或?qū)φ站旌弦?ml加入含有500ml YEP液體培養(yǎng)基（Kan 50 μ g/ml)的 1L 三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng) 6-12 小時(shí)（0D6QQ = 0· 8-1. 0)。
[0094] (四）4000rpm/min，室溫離心10分鐘，收集菌體。
[0095] (五）用200mlMS鹽溶液懸浮菌體，分別得到重組農(nóng)桿菌和對(duì)照農(nóng)桿菌的懸液。 [0096](六）將擬南芥花序分別浸泡在重組農(nóng)桿菌和對(duì)照農(nóng)桿菌的懸液里1分鐘左右，用 保鮮袋套上保濕一天。
[0097](七）第二天將擬南芥從保鮮袋中取出來(lái)，黑暗放置一天后放回光照培養(yǎng)架上，培 育植株（21°C，每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)）到結(jié)實(shí)，直到分別收獲重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南 芥得到的轉(zhuǎn)ZmHINT基因擬南芥和對(duì)照農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥得到的轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304擬 南芥的T0代種子，收獲時(shí)要分單株收獲。
[0098] 三、轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株的篩選
[0099] (一）將干燥2周后的轉(zhuǎn)ZmHINT基因和轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304擬南芥的T0代種 子分別播種于含 40mg/L、35mg/L、30mg/L、25mg/L、20mg/L、15mg/L 潮霉素（Hygromycin)的 MS培養(yǎng)基上。
[0100] (二）將種子4°c春化7此小時(shí)后置于21°C，每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)，光強(qiáng) 150 μ Μ · nT2s_1，8-10天后觀(guān)察轉(zhuǎn)ZmHINT基因和轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的擬南芥T1代幼 苗的子葉和根的發(fā)育狀況。
[0101] (三）經(jīng)初步篩選鑒定：陽(yáng)性轉(zhuǎn)ZmHINT基因或者轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T1代 擬南芥幼苗能夠在含有30mg/L潮霉素的MS選擇培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而陰性未轉(zhuǎn)ZmHINT基 因或者未轉(zhuǎn)化空載體pCAMBIA-1304的T1代擬南芥幼苗在含有30mg/L潮霉素的MS選擇培 養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，變成為白化苗。
[0102] 陽(yáng)性轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T1代擬南芥幼苗的潮霉素抗性篩選結(jié)果如圖2所示。
[0103] 圖 2 中，a :40mg/L Hygromycin MS 培養(yǎng)基；b :35mg/L Hygromycin MS 培養(yǎng)基；
[0104] c :30mg/L Hygromycin MS 培養(yǎng)基；d :25mg/L Hygromycin MS 培養(yǎng)基；
[0105] e :20mg/L Hygromycin MS 培養(yǎng)基；f : 15mg/L Hygromycin MS 培養(yǎng)基。
[0106] 圖2表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T1代擬南芥幼苗能夠在含有30mg/L潮霉素的MS選 擇培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。
[0107] (四）8-10d后，分別將陽(yáng)性轉(zhuǎn)ZmHINT基因和轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T1代擬 南芥幼苗移栽到基質(zhì)土中生長(zhǎng)，當(dāng)植株長(zhǎng)至10葉時(shí)，取葉片提取基因組RNA并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，得到轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T1代擬南芥的cDNA和轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T1代擬南芥 的 cDNA。
[0108] 以轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T1代擬南芥的cDNA為模板，以R6和F6為引物進(jìn)行PCR鑒 定，以轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T1代擬南芥的cDNA為模板，以R8和F8為引物進(jìn)行PCR 鑒定，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)如實(shí)施例1的步驟五。
[0109] 將鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)ZmHINT基因和轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的擬南芥T1代幼苗成 熟后分單株收取T1代種子。由T1代的種子播種后，獲得T2代幼苗，將其進(jìn)行30mg/L的潮 霉素抗性篩選，結(jié)果如圖3所示。
[0110] 圖3A中，黑色箭頭標(biāo)注的為轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥幼苗。
[0111] 圖3B中，黑色箭頭標(biāo)注的為轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代擬南芥幼苗。
[0112] 圖3表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥幼苗和轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代 擬南芥幼苗能夠在含有30mg/L潮霉素的MS選擇培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。
[0113] 把潮霉素抗性篩選的轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥幼苗、轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304 的T2代擬南芥幼苗和野生型擬南芥幼苗移植至基質(zhì)土中，當(dāng)生長(zhǎng)至10片葉時(shí)，單株提取葉 片的基因組RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥的cDNA和轉(zhuǎn)空載體 pCAMBIA-1304的T2代擬南芥的cDNA和野生型擬南芥的cDNA。
[0114] 分別以轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥的cDNA和野生型擬南芥的cDNA為模板，以 R6和F6為引物進(jìn)行PCR鑒定，分別以轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代擬南芥的cDNA和野 生型擬南芥的cDNA為模板，以R8和F8為引物進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)如實(shí)施例1的 步驟五，結(jié)果如圖4所示。
[0115] 圖4A為轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥和野生型擬南芥的PCR鑒定。
[0116] 圖4B為轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代擬南芥和野生型擬南芥的PCR鑒定。
[0117] 圖4A中，Μ為DNA marker，1-4為轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥，5為野生型擬南 芥。
[0118] 圖4B中，Μ為DNA marker，1-4為轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代擬南芥，5為野 生型擬南芥。
[0119] 圖4A表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥檢測(cè)到約400bp的目標(biāo)條帶，而野生型 擬南芥沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶。
[0120] 圖4B表明，轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代擬南芥檢測(cè)到514bp的目的條帶，而 野生型擬南芥沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶。
[0121] 圖4表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T2代擬南芥和轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T2代擬南 芥構(gòu)建成功。
[0122] 按照上述方法直到獲得轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T3代擬南芥植株以及轉(zhuǎn)空載體 pCAMBIA-1304的T3代擬南芥植株。此外，每代PCR鑒定為陽(yáng)性的植株成熟后分單株收獲種 子。
[0123] 實(shí)施例3、轉(zhuǎn)ZmHINT基因擬南芥、轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304擬南芥及野生型擬南芥 花序部位發(fā)病程度分析
[0124] 將轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T3代擬南芥、轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T3代擬南芥和野生 型擬南芥的種子用體積百分含量6%的次氯酸鈉溶液（6ml NaCIO原液，0.01ml的Triton X-100,用ddH20定容到100ml)消毒lOmin，再用無(wú)菌水清洗6次后均勻的播撒與1/2MS培 養(yǎng)基中。4°C避光處理2天后，將播有擬南芥的培養(yǎng)基移至溫室中（16h光照、8小時(shí)黑暗， 21°C )。待擬南芥幼苗長(zhǎng)到3至4片葉時(shí)將擬南芥移至培養(yǎng)土中繼續(xù)生長(zhǎng)。待到各擬南芥 開(kāi)花且有2到3個(gè)角果出現(xiàn)時(shí)即可進(jìn)行禾谷鐮刀菌接種。
[0125] 將保存的禾谷鐮刀菌PH-1的菌絲塊接種到配置好的CMC產(chǎn)孢液體培養(yǎng)基中， 25°C、180rpm震蕩培養(yǎng)5天（Hou Z M et al.2002)。將培養(yǎng)產(chǎn)生的孢子用紗布過(guò)濾后， 3000rpm離心5min收集分生孢子，用體積百分含量0. 05%的Tween 20的無(wú)菌水溶液在血 球計(jì)數(shù)板下將分生孢子的濃度調(diào)整為1X 1〇5個(gè)/ml，得到禾谷鐮刀菌孢子懸浮液，用于接種 實(shí)驗(yàn)。
[0126] 選取開(kāi)花初期且生長(zhǎng)健壯、均勻的擬南芥植株，采用噴霧法噴灑禾谷鐮刀菌孢子 懸浮液進(jìn)行接種。接種后用塑料薄膜覆蓋保濕，25°C黑暗培養(yǎng)兩天，然后移至21°C，相對(duì)濕 度80%，16h光照，8h黑暗的溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0127] 對(duì)噴灑禾谷鐮刀菌孢子懸浮液7天后的各擬南芥進(jìn)行表型鑒定，結(jié)果如圖5所示。
[0128] 圖5A代表轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T3代擬南芥花序組織發(fā)病程度。
[0129] 圖5B代表轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T3代擬南芥花序組織發(fā)病程度。
[0130] 圖5C代表野生型擬南芥的花序組織發(fā)病程度。
[0131] 圖5A表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的擬南芥在整個(gè)禾谷鐮刀菌侵染過(guò)程中表型變化不明 顯，花序部位生長(zhǎng)正常，能正常的開(kāi)花結(jié)果。
[0132] 圖5B表明，轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的擬南芥的花瓣、萼片和花梗等整個(gè)花組織開(kāi) 始出現(xiàn)壞死斑塊，隨著時(shí)間推移，壞死斑塊逐漸擴(kuò)展，最后引起整個(gè)花組織的壞死甚至是新 生角果的壞死。
[0133] 圖5C表明，野生型擬南芥的花瓣、萼片和花梗等整個(gè)花組織開(kāi)始出現(xiàn)壞死斑塊， 隨著時(shí)間推移，壞死斑塊逐漸擴(kuò)展，最后引起整個(gè)花組織的壞死甚至是新生角果的壞死。
[0134] 圖5表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T3代擬南芥花序部位遭受禾谷鐮刀菌浸染后發(fā)病的 程度低于轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T3代擬南芥及野生型擬南芥；轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304 的T3代擬南芥與野生型擬南芥發(fā)病相同，說(shuō)明空載體pCAMBIA-1304在擬南芥抵抗禾谷鐮 刀菌的過(guò)程中起到的抗性作用不顯著。
[0135] 實(shí)施例4、轉(zhuǎn)ZmHINT基因擬南芥、轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304擬南芥及野生型擬南芥 葉片發(fā)病程度分析
[0136] 選取實(shí)施例3中的噴灑禾谷鐮刀菌孢子懸浮液10天后的T3代轉(zhuǎn)ZmHINT基因擬 南芥和轉(zhuǎn)空載體PCAMBIA-1304擬南芥及野生型的擬南芥葉片，觀(guān)察壞斑的發(fā)病程度，如圖 6所示。
[0137] 圖6A代表轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T3代擬南芥的葉片發(fā)病程度。
[0138] 圖6B代表轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T3代擬南芥的葉片發(fā)病程度。
[0139] 圖6C代表野生型擬南芥的葉片發(fā)病程度。
[0140] 圖6A表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的擬南芥在整個(gè)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)葉片出現(xiàn)壞死斑塊癥 狀。
[0141] 圖6B表明，轉(zhuǎn)pCAMBIA-1304空載體的擬南芥葉片出現(xiàn)壞死斑塊，壞死斑塊呈現(xiàn)灰 白色或者黃褐色，隨著侵染時(shí)間的推移，病斑不斷擴(kuò)展，最后導(dǎo)致這個(gè)葉片的壞死。
[0142] 圖6C表明，野生型擬南芥葉片出現(xiàn)壞死斑塊，壞死斑塊呈現(xiàn)灰白色或者黃褐色， 隨著侵染時(shí)間的推移，病斑不斷擴(kuò)展，最后導(dǎo)致這個(gè)葉片的壞死。
[0143] 圖6表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的T3代擬南芥葉片抗禾谷鐮刀菌PH-1浸染的能力遠(yuǎn)高 于轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的T3代擬南芥及野生型擬南芥。
[0144] 綜上，圖5和圖6表明，轉(zhuǎn)ZmHINT基因的擬南芥的花序部位、葉片的綜合發(fā)病 程度顯著低于轉(zhuǎn)空載體pCAMBIA-1304的擬南芥和野生型擬南芥的花序部位、葉片的綜 合發(fā)病程度，說(shuō)明了 ZmHINT基因在促進(jìn)植物抵抗生物脅迫病原菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum) PH-1過(guò)程中發(fā)揮了積極的作用，從而增強(qiáng)了植物的抗病能力，有利于提高植 物的免疫能力。
【權(quán)利要求】
1. 如下任一物質(zhì)在提高植物免疫能力和/或增強(qiáng)植物抗病性中的應(yīng)用： (1) SEQIDNo·4所示的蛋白； (2) SEQ ID No. 4所示蛋白的編碼基因； (3) 含有（2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述編碼基因如SEQ ID No. 3中自5'末 端起第9位至第398位核苷酸所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述免疫為針對(duì)禾谷鐮刀菌引起的 疾病的免疫； 所述抗病為抗禾谷鐮刀菌引起的疾病。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為擬南芥。
5. -種制備免疫能力提高和/或抗病性增強(qiáng)的植物的方法，包括如下步驟：將SEQ ID No. 4所示蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植 物的免疫能力提高和/或抗病性增強(qiáng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述編碼基因是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入 的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PCAMBIA-1304的多克隆位點(diǎn)得到 的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述編碼基因如SEQ ID No. 3中自 5'末端起第9位至第398位核苷酸所示； 所述重組表達(dá)載體是將SEQ ID No. 3所示的DNA分子插入出發(fā)載體pCAMBIA-1304的 Ncol和Spel酶切位點(diǎn)間得到的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述免疫為針對(duì)禾谷鐮刀菌引起 的疾病的免疫； 所述抗病為抗禾谷鐮刀菌引起的疾病。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述植物為擬南芥。
【文檔編號(hào)】C12N9/10GK104152424SQ201410383846
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】吳劉記, 陳彥惠, 祖小峰, 唐海濤, 王順喜 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)