一種新型龍眼檢測試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了龍眼的兩種新的核苷酸序列，還公開了檢測前述序列的試劑在制備龍眼檢測試劑中的用途，以及龍眼的檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明檢測試劑盒和檢測方法可以準確、有效的檢測龍眼，特異性強，耗時短，應(yīng)用前景良好。
【專利說明】一種新型龍眼檢測試劑盒和檢測方法
[0001]本申請是申請日:2013年5月17日、申請?zhí)?201310184812.1、發(fā)明名稱:龍眼的檢測試劑盒和檢測方法的專利申請的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及龍眼的檢測試劑盒和檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0003]龍眼(Dimocarpus longan Lour.),俗稱“桂圓”,屬于無患子科龍眼屬，是傳統(tǒng)的藥食兼用植物，主要分布在熱帶、南亞熱帶地區(qū)。中國作為龍眼的發(fā)源地，已經(jīng)有近千年的栽培歷史，歷史上南“桂圓”北“人參”之稱。中國是世界上龍眼基因資源最豐富、栽培品種最多的國家。
[0004]瘋?cè)斯纸旋埨?，有毒，其形態(tài)特征與龍眼極為近似，容易混淆，導(dǎo)致消費者中毒，存在極大的安全隱患，急需提供一種方法來解決該問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決龍眼與龍荔易混淆的問題，本發(fā)明提供了 4種龍眼特異的核苷酸序列及其用途，還提供龍眼的檢測試劑盒和檢測方法。
[0006]本發(fā)明4種核苷酸序列如SEQ ID N0.1~4所示。
[0007]本發(fā)明檢測SEQ ID N0.1~4任意一項所示核苷酸序列的試劑在制備龍眼檢測試劑中的用途。
[0008]所述檢測SEQ ID N0.1~4任意一項所述核苷酸序列的試劑包括擴增SEQ IDN0.1~4任意一項所不核苷酸序列的試劑。
[0009]所述擴增SEQ ID N0.1~4任意一項所述核苷酸序列的試劑包括SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.7 ~8、SEQ ID N0.11 ~12、SEQ ID N0.13 ~14、SEQ ID N0.15 ~16、SEQID N0.17~18或SEQ ID N0.19~20所示的核苷酸序列。
[0010]本發(fā)明檢測龍眼的試劑盒，包括任選的用于檢測SEQ ID N0.1~4任意一項所述核苷酸序列的試劑。
[0011 ] 所述試劑包括擴增SEQ ID N0.1~4任意一項所示核苷酸序列的試劑。
[0012]所述擴增試劑包括SEQ ID N0.5 ~6、SEQ ID N0.7 ~8、SEQ ID N0.11 ~12、SEQID N0.13 ~14、SEQ ID N0.15 ~16、SEQ ID N0.17 ~18 或 SEQ ID N0.19 ~20 所示的核苷酸序列。
[0013]本發(fā)明龍眼的檢測方法，包括如下步驟:
[0014]a，提取樣本DNA:提取待檢樣本中的DNA ；
[0015]b，檢測:用前述的試劑盒檢測待檢樣本，即可。
[0016]本發(fā)明SEQ ID N0.1~4所示核苷酸序列為龍眼特異性序列，通過檢測這些序列可以有效鑒定待檢樣本是否為龍眼，準確區(qū)別龍眼和龍荔，保證食品安全，操作簡便，具有良好的應(yīng)用前景。
[0017]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要求書記載的內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1用改良的RAPD技術(shù)擴增桂圓的DNA。14、Q12和Q19分別為不同的RAPD引物，M:為DL2000的DNA分子大小標記，大小為bp，下同;
[0019]圖2 RAro產(chǎn)物切膠回收純化后電泳檢測，2號:從GY的14的第4條帶來的；4號:從GY的Q19第2、3、4條帶來的；5號:從GY的Q12的倒數(shù)第2條帶；
[0020]圖3 PCR擴增鑒定克隆2-1陽性。設(shè)計合成位于載體上序列的T7/SP6引物直接擴增藍白篩選的白色細菌菌落?？寺?-1，2-2，2-3，2-4，2-6分別是PCR陽性；其中克隆2-1 (紅色)為強陽性，提取克隆2-1質(zhì)粒DNA，進行DNA序列分析，獲得新的DNA序列(SCAR)；
[0021]圖4 PCR擴增鑒定4-7/4-8陽性克隆。設(shè)計合成位于載體上序列的T7/SP6引物直接擴增藍白篩選的白色細菌菌落?？寺?-1，4-2，4-3，4-7，4-8分別是PCR陽性；其中4-7，4-8 (紅色)，提取質(zhì)粒DNA，進行DNA序列分析，各獲得新的DNA序列(SCAR)；
[0022]圖5用EcoRI酶切鑒定5號RAPD產(chǎn)物的陽性克隆。克隆5_2和5_2均為陽性克隆，含有一個約500bp的插入片段。取克隆5-2 (紅色)，提取質(zhì)粒DNA，進行DNA序列分析，獲得新的DNA序列(SCAR)；
[0023]圖6引物對LY2-1在不同桂圓樣本中的特異性擴增與檢測。樣本1、2、3、4、5、6、
8、9和14為采自位于長江上游四川合江的不同的青果；樣本LZ、⑶、GX、HN、FJ分別為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，均獲得特異性DNA擴增片段；DD為紫花地丁 ；JGT為溝景天；GHC為采自四川古藺的趕黃草；JYH為金銀花；TM為采自四川涼山的天麻。M:為天根公司的DL600的DNA分子大小標記，大小為bp ；
[0024]圖7引物對LY4-7在不同桂圓樣本中的特異性PCR擴增與檢測。樣本1、2、3、4、
5、6、8、9和14為采自位于長江上游四川合江的不同的青果；樣本LZ、⑶、GX、HN、FJ分別為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，均獲得特異性DNA擴增片段；DD為紫花地丁 ；JGT為溝景天；GHC為采自四川古藺的趕黃草；JYH為金銀花；TM為采自四川涼山的天麻。M:為天根公司的DL600的DNA分子大小標記，大小為bp ；
[0025]圖8引物對LY4-8在不同桂圓樣本中的特異性PCR擴增與檢測。樣本1、2、3、4、
5、6、8、9和14為采自位于長江上游四川合江的不同的青果；樣本LZ、⑶、GX、HN、FJ分別為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，均獲得特異性DNA擴增片段；DD為紫花地丁 ；JGT為溝景天；GHC為采自四川古藺的趕黃草；JYH為金銀花；TM為采自四川涼山的天麻。M:為天根公司的DL600的DNA分子大小標記，大小為bp。箭頭所指位置為特異性DNA條帶；
[0026]圖9引物對LY5-2在不同桂圓樣本中的特異性PCR擴增與檢測。樣本1、2、3、4、
5、6、8、9和14為采自位于長江上游四川合江的不同的青果；樣本LZ、⑶、GX、HN、FJ分別為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，均獲得特異性DNA擴增片段；DD為紫花地丁 ；JGT為溝景天；GHC為采自四川古藺的趕黃草；JYH為金銀花；TM為采自四川涼山的天麻。M:為天根公司的DL600的DNA分子大小標記，大小為bp。箭頭所指位置為特異性DNA條帶；
[0027]圖10引物對LY2-l_full在不同桂圓樣本中的特異性PCR全長擴增。樣本1、2、
3、4、5、6、8、9和14為采自位于長江上游四川合江的不同的青果；樣本LZ、⑶、GX、HN、FJ分別為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，均獲得特異性DNA擴增片段；DD為紫花地丁 JGT為溝景天；GHC為采自四川古藺的趕黃草JYH為金銀花；TM為采自四川涼山的天麻。M:為天根公司的DL600的DNA分子大小標記，大小為bp ；
[0028]圖11引物對LY4-7_full在不同桂圓樣本中的特異性PCR全長擴增。樣本1、2、
3、4、5、6、8、9和14為采自位于長江上游四川合江的不同的青果；樣本LZ、⑶、GX、HN、FJ分別為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，均獲得特異性DNA擴增片段；DD為紫花地丁 JGT為溝景天；GHC為采自四川古藺的趕黃草JYH為金銀花；TM為采自四川涼山的天麻。M:為天根公司的DL600的DNA分子大小標記，大小為bp ；
[0029]圖12引物對LY4-8_full在不同桂圓樣本中的特異性PCR全長擴增。樣本1、2、3、4、5、6、8、9和14為采自位于長江上游四川合江的不同的青果；樣本LZ、⑶、GX、HN、FJ分另Ij為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，其中GD GX HN均獲得強的特異性DNA擴增片段；DD為紫花地丁 JGT為溝景天；GHC為采自四川古藺的趕黃草JYH為金銀花；TM為采自四川涼山的天麻。M:為天根公司的DL600的DNA分子大小標記，大小為bp。箭頭所指位置為特異性DNA條帶；
[0030]圖13引物對LY5-2_full在不同桂圓樣本中的特異性PCR全長擴增。樣本1、2、3、4、5、6、8、9和14為采自位于長江上游四川合江的不同的青果；樣本LZ、⑶、GX、HN、FJ分別為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，均獲得特異性DNA擴增片段；DD為紫花地丁 JGT為溝景天；GHC為采自四川古藺的趕黃草JYH為金銀花；TM為采自四川涼山的天麻。M:為天根公司的DL2000的DNA分子大小標記，大小為bp。箭頭所指位置為特異性DNA條帶；
[0031]圖14 4個引物對LY2-l，LY4-7，LY4-8，LY5-2在桂圓和龍荔樣本中的擴增與檢測。樣本LZ、GD、GX、HN、FJ分別為采自四川瀘州、廣東、廣西、海南和福建來源的桂圓品種，樣本LL采自廣西來源的龍荔野生種。

【具體實施方式】
[0032]實施例1 RAPD法特異擴增得到龍眼特異SCAR標記
[0033]RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)-即隨機擴增多態(tài)性 DNA,主要用于動植物基因組信息未知的情況下的檢測。RAro技術(shù)依賴于PCR，選用10個堿基的單鏈隨機引物，對生物個體、居群或物種基因組的DNA進行PCR擴增，檢測其遺傳位點的差異。序列特異性擴增區(qū)(Sequence-characterized Amplified Reg1n, SCAR)標記(SCAR 標記)是在RAro技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。SCAR標記一般表現(xiàn)為擴增片段的有無，為一種顯性標記；但有時也表現(xiàn)為長度的多態(tài)性，為共顯性的標記。作為作物農(nóng)藝性狀的SCAR標記，在分子標記輔助育種、品種鑒定方面將發(fā)揮巨大作用。
[0034]一、實驗方法
[0035](一)桂圓DNA的提取
[0036]1、收集四川瀘州、廣東、廣西、海南、福建各地盛產(chǎn)桂圓的葉子，置于4°C冰箱備用；
[0037]2、取各區(qū)域桂圓葉子3-4片(約2g)，加入液氮或者硅石(silica，Si02)研磨成粉末狀，將粉末立即裝入預(yù)冷的5ml離心管中，裝入的量約占離心管的1/3。
[0038]3、加入2ml 65°C預(yù)熱的CTAB提取緩沖液和4 μ I β -巰基乙醇，充分混勻，于65°C水浴保溫30min，不時振蕩以免成團。
[0039]4、每管加入一倍體積的氯仿:異戊醇(24:1)，充分振蕩使其成乳白色，室溫下4000rpm離心1min,取上清于一新的5ml離心管中。
[0040]5、重復(fù)步驟(3)，使提取的基因組DNA更加純凈。
[0041]6、把最后抽提獲得的上清轉(zhuǎn)移至新的5ml離心管中，緩慢加入一倍體積的預(yù)冷的異丙醇于離心管中，緩慢轉(zhuǎn)到離心管混勻，使DNA成團，放-20°C冰箱預(yù)冷30min，離心機4000rpm離心6min,棄上清。
[0042]7、沉淀用70%的乙醇洗幾次，去掉色素，再用無水乙醇洗一次后室溫下干燥。溶于ddH20后放于4°C可短期存放，放于-20°C長期保存。
[0043](二)PCR 擴增一改良 RAPD
[0044]1、各取廣西桂圓DNAlOy I,用無菌ddH20稀釋至1ng/ μ I,用標記筆標示清楚桂圓產(chǎn)地、濃度以及稀釋時間，置于4°C冰箱中備用，余保存于_20°C ；
[0045]2、引物的設(shè)計合成
[0046]

【權(quán)利要求】
1.SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.4所示的2種核苷酸序列。
2.檢測SEQID N0.1或SEQ ID N0.4所示核苷酸序列的試劑在制備龍眼檢測試劑中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于:所述檢測SEQID N0.1或SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的試劑包括擴增SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.4所示核苷酸序列的試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于:所述擴增的試劑包括SEQID N0.5~6、SEQ ID N0.11 ~12、SEQ ID N0.13 ~14 或 SEQ ID N0.15 ~16 所示的核苷酸序列。
5.一種檢測龍眼的試劑盒，其特征在于:包括檢測SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.4所述核苷酸序列的相關(guān)試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑包括擴增SEQID N0.1或SEQID N0.4所示核苷酸序列的試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述擴增的試劑包括SEQID N0.5~6、SEQ ID N0.11 ~12、SEQ ID N0.13 ~14 或 SEQ ID N0.15 ~16 所示的核苷酸序列。
8.一種龍眼的檢測方法，其特征在于:包括如下步驟: a，提取樣本DNA:提取待檢樣本中的DNA ； b，檢測:用權(quán)利要求5~7任意一項所述的試劑盒檢測待檢樣本，即可。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164429SQ201410384047
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月17日
【發(fā)明者】傅俊江, 楊璐全 申請人:傅俊江