Susd2蛋白作為標記物的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了SUSD2蛋白作為標記物的用途，具體為SUSD2蛋白作為標記物在鑒定、篩選或分選胰腺內分泌前體細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞中的應用；以及編碼所述SUSD2蛋白的前體蛋白的mRNA作為標記物在鑒定膜腺內分泌iu體細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞中的應用。本發(fā)明通過分析人多能干細胞定向誘導分化來源的胰腺內胚層細胞的基因表達，發(fā)現SUSD2基因在胰腺內分泌前體細胞及新生的胰腺內分泌細胞中富集表達，而且其編碼的蛋白為細胞膜上的受體蛋白，以該蛋白作為標記物可以用于鑒定、篩選或分選胰腺內分泌前體細胞及新生的胰腺內分泌細胞，對研究各發(fā)育階段的胰腺相關細胞具有重<要意義。
【專利說明】SUSD2蛋白作為標記物的用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及SUSD2蛋白作為標記物的用途。

【背景技術】
[0002] 人多能干細胞來源的胰腺beta細胞能夠為糖尿病特別是I型糖尿病的細胞替代 治療提供充足的供體胰島細胞來源。此外，人多能干細胞向胰腺beta細胞的定向誘導分化 也能夠為研究人胰腺發(fā)育過程提供一個體外研究模型。通過模擬體內發(fā)育過程，人多能干 細胞向胰腺beta細胞定向誘導分化主要包括以下幾個分步階段：胚內內胚層、腸管、前腸 后部、胰腺內胚層和胰腺內分泌細胞。其中，胰腺內胚層階段的細胞為混雜細胞，通常包括 胰腺前體細胞、胰腺內分泌前體細胞以及新生的胰腺內分泌細胞等。目前主要通過胰腺發(fā) 育相關基因的表達來指征細胞命運。胰腺前體細胞主要由相關基因如I 3DXU HNF1B、S0X9、 NKX6. 1、HNF6等基因的表達來指征。胰腺內分泌前體細胞最主要的一個標記基因是NGN3， 但由于其瞬時表達特征，通常會結合其下游基因如NKX2. 2、NEUR0D1等基因的表達以及 CHR0M0GRANIN A、INSULIN、GLUCAGON等內分泌相關基因的不表達來指征胰腺內分泌前體細 胞命運。雖然這些標記基因的表達雖然可以用來指征特定細胞的命運，但是由于其都為轉 錄因子或分泌蛋白等，通常定位于胞漿或細胞核內，因而無法利用這些蛋白的表達來分離 純化特定的細胞類群特別是人胰腺內分泌前體細胞和新生的胰腺內分泌細胞，從而對其分 子特征進行更為詳細的研究。
[0003] 目前，人多能干細胞能夠通過定向誘導分化得到胰腺前體細胞，但是這類細胞在 體外向功能成熟的胰腺beta細胞的分化效率低。雖然，將人多能干細胞來源的胰腺前體細 胞移植到免疫缺陷小鼠體內后，能夠得到功能成熟的胰島細胞，但是由于胰腺前體細胞具 有一定的增殖能力，其致瘤性限制了其向臨床運用的推廣。相較于胰腺前體細胞，功能成熟 的胰腺beta細胞是更為理想的供體細胞來源。但如何在體外將胰腺前體細胞誘導分化成 為功能成熟的胰腺beta細胞大大限制了糖尿病細胞替代治療方案的實現，而在胰腺前體 細胞向胰腺beta細胞分化的過程中，正確的胰腺內分泌前體細胞的高效誘導分化的實現 是最為首要的一步。通過對小鼠等模式動物的研究，大大促進了對胰腺beta細胞發(fā)育過程 的了解，這些研究對指導體外胰腺beta細胞的定向分化起了決定性的作用。盡管如此，針 對胰腺內分泌前體細胞命運特化、不同內分泌細胞之間的命運選擇的研究仍然較少，此外， 人與小鼠等模式動物之間也存在一定的物種差異性，因此，如果能夠找到相關分子標記來 直接分離特定發(fā)育階段的胰腺相關細胞進行研究的話，能夠大大加快體外功能成熟的胰腺 beta細胞的獲得。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種分選或輔助分選待測細胞群體中的胰腺內分泌前 體細胞或新生的內分泌細胞的方法。
[0005] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測細胞群體中的細胞是否表達SUSD2 基因，若某些細胞表達SUSD2基因，則某些細胞為或候選為胰腺內分泌前體細胞或新生的 內分泌細胞；若某些細胞不表達SUSD2基因，則某些細胞不為或候選不為胰腺內分泌前體 細胞或新生的內分泌細胞；；
[0006] 所述SUSD2基因的核苷酸序列為序列表中序列2。
[0007] 上述方法中，所述檢測待測細胞群體中的細胞是否表達SUSD2基因是通過檢測待 測細胞群體中的細胞是否含有SUSD2基因表達的蛋白，所述檢測待測細胞群體中的細胞是 否含有SUSD2基因表達的蛋白的方法為如下1)或2)或3) :
[0008] 1)免疫熒光抗體法檢測，采用抗體為抗SUSD2單抗；
[0009] 2)流式分析檢測，采用抗體為抗SUSD2單抗；
[0010] 3)磁珠分選，采用抗體為抗SUSD2單抗。
[0011] 上述方法中，所述待測細胞為胰腺內胚層細胞。
[0012] 上述方法中，所述胰腺內胚層細胞為人源胰腺內胚層細胞。
[0013] 本發(fā)明另一個目的是通過分析胰腺內胚層細胞的基因表達，發(fā)現SUSD2基因在胰 腺分泌前體細胞及新生的分泌細胞中富集表達，即該基因表達的SUSD2蛋白為兩者的分子 記。
[0014] 基于上述發(fā)現，本發(fā)明提供了 SUSD2蛋白作為標記物在鑒定、篩選或分選胰腺內 分泌前體細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞中的應用，所述SUSD2蛋白的氨基酸序列如序 列1所示。
[0015] 所述 SUSD2 蛋白在 NCBI 的登錄號為（NCBI Reference Sequence) :ΝΡ_062547· 1。
[0016] 所述新生的胰腺內分泌細胞：在人多能干細胞向胰腺beta細胞定向誘導分化的 過程中，產生的一群激素（包括 Insulin，Glucagon，Ghrelin，Pancreatic Polypeptide， Somatostatin等）陽性的細胞，這一群細胞通常是多激素共表達的，與成熟的胰腺內分泌 細胞相比功能并不成熟。在體內發(fā)育過程中，所述新生的胰腺內分泌細胞主要是指胚胎發(fā) 育時期功能并不成熟的胰腺內分泌細胞。
[0017] 本發(fā)明還提供了能夠與所述SUSD2蛋白特異性結合的抗體在制備鑒定、篩選或分 選胰腺內分泌前體細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞試劑中的應用。
[0018] 所述SUSD2蛋白是基因 SUSD2表達的蛋白，它既不是轉錄因子，也不是分泌蛋白， 而是位于細胞膜上的受體蛋白。
[0019] 通過免疫熒光抗體法檢測待測細胞是否含有SUSD2蛋白，從而確定待測細胞是否 為胰腺分泌前體細胞或新生的胰腺內分泌細胞。
[0020] 所述的抗體可以是完整的抗體分子、嵌合抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重 鏈、抗體輕鏈、重鏈和輕鏈的同二聚體和異二聚體，以及抗原結合片段和衍生物。完整的抗 體分子可以是多抗或單抗，優(yōu)選為單抗。
[0021] 如上所述，一般可以通過免疫熒光抗體法檢測SUSD2蛋白，所述抗體或抗該抗體 的二抗需攜帶相應的熒光標識。
[0022] 所述胰腺內分泌前體細胞和新生的胰腺內分泌細胞是指胰腺內胚層細胞中的一 群細胞，在適當條件下能夠產生功能成熟的胰腺內分泌細胞。
[0023] 所述的人胰腺內胚層細胞主要是指人多能干細胞向胰腺beta細胞定向誘導分化 過程中胰腺內胚層階段的細胞，或新鮮分離的及經離體培養(yǎng)的相應發(fā)育階段的人胚胎胰腺 組織細胞，主要包括胰腺前體細胞、胰腺內分泌前體細胞以及新生的胰腺內分泌細胞，本發(fā) 明的主要目的在于從胰腺內胚層細胞群中篩選或分選胰腺內分泌前體細胞以及新生的胰 腺內分泌細胞。
[0024] 所述胰腺內胚層細胞的來源包括：1、人多能干細胞定向誘導分化獲得；2、從分離 的人胚胎胰腺組織獲?。?、分離的人胚胎胰腺內胚層細胞經體外培養(yǎng)后的細胞。
[0025] 所述篩選或分選的方法主要采用免疫磁珠分離法或流式分選法。
[0026] SUSD2基因表達過程中首先轉錄成mRNA，然后再翻譯成SUSD2蛋白前體蛋白，再經 過加工后產生成熟的SUSD2蛋白。
[0027] 基于以上原因，本發(fā)明還提供了編碼所述SUSD2蛋白的前體蛋白的mRNA作為標記 物在鑒定胰腺內分泌前體細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞中的應用。
[0028] 本發(fā)明又提供了能夠與mRNA特異性結合的引物、探針或它們的互補鏈在制備鑒 定胰腺內分泌前體細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞試劑中的應用。
[0029] 所述引物可以是擴增整個mRNA的引物，也可以是擴增mRNA特征區(qū)域的引物，所述 探針是識別mRNA特定區(qū)域的核苷酸，一般攜帶標識。
[0030] 根據實施例的記載，本發(fā)明提供了一對具體擴增所述mRNA的引物，如下所示：
[0031] 上游引物：GGCACCGCCAACACCTCA
[0032] 下游引物：GCGTGGGCAGCGACTTGA。
[0033] 所述鑒定的方法可以采用熒光定量PCR。
[0034] 本發(fā)明通過分析內胚層細胞的基因表達，發(fā)現SUSD2基因在胰腺分泌前體細胞及 新生的胰腺內分泌細胞中富集表達，而且其編碼的蛋白為細胞膜上的受體蛋白，以該蛋白 作為標記物可以用于鑒定、篩選或分選胰腺內分泌前體細胞及新生的胰腺內分泌細胞，對 研究各發(fā)育階段的胰腺相關細胞具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為人多能干細胞定向分化產生胰腺內胚層細胞。（a)人多能干細胞向胰腺 beta細胞定向誘導分化示意圖；(b)免疫熒光染色檢測分化第四階段末胰腺內胚層相關蛋 白及標記NGN3基因的綠色熒光蛋白（EGFP)的表達的染色圖。
[0036] 圖2為流式分析法鑒定胰腺內胚層中的NGN3-EGFP+細胞為胰腺內分泌前體細胞 或新生的內分泌細胞的結果圖。（a)流式分析法檢測胰腺內胚層細胞中NGN3-EGFP及NGN3， NKX2. 2, NEUR0D1，CHR0M0GRANIN A(CHGA)等胰腺內分泌相關蛋白的表達；(b)流式分析法 檢測胰腺內胚層細胞中NGN3-EGFP與胰腺前體細胞標記蛋白Η)Χ1的表達，表明NGN3-EGFP+ 細胞低表達或不表達胰腺前體相關蛋白roxi。
[0037] 圖3為mRNA測序分析分選獲得的NGN3-EGFP+細胞、NGN3-EGFP-細胞中胰腺相關 基因的表達情況，表明NGN3-EGFP+的胰腺內分泌前體細胞及新生的內分泌細胞群相對富 集膜腺內分泌相關基因的表達。
[0038] 圖4為免疫有關染色檢測SUSD2和NGN3-EGFP的共染情況，說明SUSD2可以用來 標記人多能干細胞分化來源的NGN3-EGFP+細胞。
[0039] 圖5為流式分析檢測人多能干細胞來源的胰腺內胚層細胞中SUSD2及胰腺發(fā)育 相關蛋白的表達情況分析圖，說明SUSD2可用于標記體外分化得到的胰腺內分泌前體細胞 及新生的內分泌細胞。（a)流式分析檢測胰腺內胚層細胞中SUSD2及胰腺內分泌相關蛋白 NGN3，NKX2. 2，NEUR0D1，CHR0M0GRANIN A(CHGA)等的表達情況；(b)流式分析檢測胰腺內胚 層細胞中SUSD2與胰腺前體細胞相關蛋白roxi的表達。
[0040] 圖6為RT-QPCR鑒定流式分選獲得的SUSD2+細胞，SUSD2-細胞及未分選的胰腺 內胚層細胞中胰腺發(fā)育相關基因的表達情況，表明SUSD2+細胞相對富集胰腺內分泌前體 細胞相關基因及胰腺內分泌細胞相關基因的表達，相對低表達胰腺前體細胞相關基因的表 達，證明SUSD2標記的是胰腺內分泌前體細胞和/或新生的內分泌細胞。
[0041] 圖7為SUSD2抗體用于磁珠分選來富集胰腺內分泌前體細胞及新生的胰腺內分 泌細胞。（a)流式分析檢測用SUSD2抗體對體外分化獲得的胰腺內胚層細胞進行磁珠分選 所富集的SUSD2+細胞、SUSD2-細胞中胰腺內分泌前體細胞及胰腺內分泌細胞的標記蛋白 NKX2. 2的表達，說明SUSD2抗體用于磁珠分選能夠高效富集NKX2. 2+胰腺內分泌前體細胞 及新生的胰腺內分泌細胞。（b)對磁珠分選獲得的SUSD2+細胞、SUSD2-細胞及未分選的胰 腺內胚層細胞進行延長培養(yǎng)后，免疫組化檢測胰腺前體及胰腺內分泌相關蛋白的表達，表 明SUSD2+細胞能夠大量產生內分泌細胞，證明其為內分泌前體細胞或新生的內分泌細胞； (c)將磁珠分選獲得的SUSD2+細胞、SUSD2-細胞移植到免疫缺陷小鼠體內，19周后對移植 物免疫熒光染色，檢測胰腺內分泌相關蛋白的表達，表明SUSD2+細胞能夠產生多種類型的 胰腺內分泌細胞，而SUSD2-細胞主要產生導管樣細胞，證明SUSD2富集的是胰腺內分泌前 體細胞或新生的胰腺內分泌細胞。
[0042] 圖8為SUSD2能夠用于標記人胚胎來源的胰腺內分泌前體細胞及新生的胰腺內分 泌細胞。（a)免疫組化檢測胚胎胰腺組織及成體胰腺組織中SUSD2與胰腺內分泌前體細胞 相關蛋白、胰腺內分泌細胞相關蛋白的共表達，表明SUSD2僅在胚胎胰腺組織中的胰腺內 分泌前體或內分泌細胞中表達。（b)免疫熒光檢測胚胎胰腺組織中SUSD2與胰腺內分泌相 關蛋白及胰腺導管相關蛋白的表達。
[0043] 圖9為SUSD2能夠用于富集人胚胎來源的胰腺內分泌前體細胞及新生的胰腺內分 泌細胞。

【具體實施方式】
[0044] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。SUSD2基因如序列2所示，編碼的 蛋白的氨基酸序列為序列1。
[0045] 實施例1、SUSD2作為胰腺內分泌前體細胞標記基因的發(fā)現及應用
[0046] -、SUSD2作為修飾過人多能干細胞分化得到的胰腺內分泌前體細胞標記基因
[0047] 1. 1、胰腺內胚層細胞的獲得
[0048] 將 EGFP 基因（NC_013179. 1 (3313. .4126))通過同源重組（Ngn3 contig編號：ΝΤ_030059· 13,位于Chromosome 10，左側同源臂在基因組中的位 置：71325654-71332154 ;右側同源臂在基因組中的位置：71332158-71467568)離體的人多 能干細胞系Hl (WiCell Research Institute，NIH編號為WA01)，得到修飾后細胞的人多能 干細胞系NGN3-EGFP。將其按15% -20%接種到細胞培養(yǎng)液I，培養(yǎng)1天；再直接換用細胞 培養(yǎng)液Π ，培養(yǎng)1-2天；再直接換用細胞培養(yǎng)液III，培養(yǎng)1天；繼續(xù)直接換用細胞培養(yǎng)液 IV，培養(yǎng)2天；直接換用細胞培養(yǎng)液V，培養(yǎng)1天；直接換用細胞培養(yǎng)液VI，培養(yǎng)3天；直接 換用細胞培養(yǎng)液VII，培養(yǎng)4天；直接換用細胞培養(yǎng)液VIII，培養(yǎng)4-6天；直接換用細胞培養(yǎng) 液IX，培養(yǎng)4-6天，得到胰腺內胚層細胞。
[0049] 通過免疫熒光抗體法檢測該階段細胞群體中胰腺內胚層相關的多個標識轉錄因 子的表達情況。
[0050] 檢測NKX2. 2的抗體是鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產品目錄號為74. 5A5); 檢測roxi的是山羊來源的多抗（該抗體購自R&D Systems，產品目錄號為AF2419);檢測 EGFP的是雞來源的多抗（該抗體購自Abeam，產品目錄號為AB13970);檢測NGN3的抗體是 綿羊來源的多抗（該抗體購自R&D System，產品目錄號為AF3444)。
[0051] 所有抗體均為非直標抗體，檢測中分別用Jackson ImmunoResearch公司購來的抗 體復染=Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗山羊的多抗（產品目錄號為705-545-147); Cyanine Cy3標記的驢來源的抗山羊的多抗（產品目錄號為705-165-147) ;Cyanine Cy3標 記的驢來源的抗綿羊的多抗（產品目錄號為715-165-147) Alexa Fluor 488標記的驢來源 的抗小鼠的多抗（產品目錄號為715-545-151) ;Cyanine Cy3標記的驢來源的抗小鼠的多 抗（產品目錄號為715-165-151) ;Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗雞的多抗（產品目 錄號為 703-545-155)。
[0052] 結果如圖1所示，該階段獲得的細胞中，部分細胞表達roxi這一胰腺前體的標記 蛋白（圖1(b)中的A);另一部分細胞表達NGN3-EGFP，兩者幾乎不共染（圖1(b)中的B); NGN3-EGFP+細胞表達胰腺內分泌前體細胞標識轉錄因子NGN3或者早期階段內分泌細胞相 關蛋白NKX2. 2、CHR0M0GRANIN A(CHGA)等（圖1(b)中的C和D);說明獲得的細胞為胰腺 內胚層階段的細胞，其中存在NGN3-EGFP標記的胰腺內分泌前體細胞或者新生的內分泌細 胞。
[0053] 上述采用的培養(yǎng)液配方如下：
[0054] 細胞培養(yǎng)液I按照如下方法配制得到：將Essential 8培養(yǎng)基、和Y27632混合，得 到細胞培養(yǎng)液I，其中Essential 8培養(yǎng)基和Y27632的配比為Iml :10 μ mol。
[0055] 細胞培養(yǎng)液II為Essential 8培養(yǎng)基。
[0056] 細胞培養(yǎng)液III按照如下方法配制得到：將DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA，rmWnt3A和 ActivinA混合，得到細胞培養(yǎng)液III，其中DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA，rmWnt3A和ActivinA的 配比為：1ml :0· Ig :25ng :120ng。
[0057] 細胞培養(yǎng)液IV按照如下方法配制得到：將DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA和ActivinA 混合，得到細胞培養(yǎng)液IV，其中DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA和ActivinA的配比為：1ml :0. Ig : 120ng〇
[0058] 細胞培養(yǎng)液V按照如下方法配制得到：將DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA，ActivinA和 Wnt-C59混合，得到細胞培養(yǎng)液V，其中DMEM/F12培養(yǎng)基，BSA，ActivinA和Wnt-C59的配比 為：1ml :0· Ig :120ng :50nmol〇
[0059] 細胞培養(yǎng)液VI按照如下方法配制得到：將DMEM/F12培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，KGF和SB525334混合，得到細胞培養(yǎng)液VI，其中DMEM/F12培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，KGF 和 SB525334 的配比為：1ml :10 μ I :50ng:l μ mol。
[0060] 細胞培養(yǎng)液VII按照如下方法配制得到：將DMEM-H培養(yǎng)基，B27 suppIement， all-trans retinoic acid，NOGGIN和 SANT-I 混合，得到細胞培養(yǎng)液 VII，其中 DMEM-H培養(yǎng) 基，B27 supplement，all-trans retinoic acid，NOGGIN和 SANT-1 的配比為：1ml :10μ 1 : 2 μ mol :250ng :0·25 μ mol〇
[0061] 細胞培養(yǎng)液VIII按照如下方法配制得到：將DMEM-H培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，NOGGIN 和 TPB((2S，5S)-(E，E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl) phenyl)_2, 4_pentadienoylamino)benzolactam)混合，得到細胞培養(yǎng)液 VIII，其中 DMEM-H 培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，NOGGIN 和 TPB 的配比為：1ml : 10 μ I :250ng : 50nmol〇
[0062] 細胞培養(yǎng)液IX按照如下方法配制得到：將DMEM-H培養(yǎng)基，Β27 suppIement without VitaminA，N0GGIN，human LIF和 Alk5 inhibitor II 混合，得到細胞培養(yǎng)液VIII, 其中 DMEM-H 培養(yǎng)基，B27 supplement without VitaminA，NOGGIN 和 TPB 的配比為：1ml : 10 μ I :250ng : IOng : 1 μ mol。
[0063] 1. 2、流式分析鑒定NGN3-EGFP+細胞是否為胰腺內分泌前體細胞或新生的內分泌 細胞
[0064] 將上述得到的胰腺內胚層細胞用BD FACS Aria IIu進行流式分析，得到 NGN3-EGFP+(含有胰腺內分泌前體來源的細胞群體）、NGN3-EGFP-(不含有胰腺內分泌前體 來源的細胞群體）兩群細胞，EGFP為FLl通道。
[0065] 通過胞內流式分析檢測NGN3-EGFP+和NGN3-EGFP-群體中是否含有胰腺內分泌前 體細胞的多個標識轉錄因子或分泌蛋白。
[0066] 檢測NKX2. 2的抗體是鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產品目錄號為74. 5A5); 檢測NGN3的抗體是綿羊來源的多抗（該抗體購自R&D Systems，產品目錄號為AF3444)和 小鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產品目錄號為F25A1B3);檢測NEUR0D1的是山羊來源 的多抗（該抗體購自R&D Systems，產品目錄號為AF2746);檢測Η)Χ1的是山羊來源的多抗 (該抗體購自R&D Systems，產品目錄號為AF2419);檢測CHR0M0GRANIN A的是兔來源的多 抗（該抗體購自中杉金橋，產品目錄號為ZA-0507)。
[0067] 所有抗體均為非直標抗體，檢測中分別用Jackson ImmunoResearch公司購來的抗 體復染。Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗山羊的多抗（產品目錄號為705-545-147); Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗小鼠的多抗（產品目錄號為715-545-151)，Alexa Fluor 647標記的驢來源的抗小鼠的多抗（產品目錄號為715-605-151) ;Alexa Fluor488 標記的山羊來源的抗小鼠抗原亞型1的多抗（產品目錄號為115-545-205)，Alexa Fluor 647標記的山羊來源的抗小鼠的多抗（產品目錄號為115-605-205) ;Alexa Fluor488標記 的山羊來源的抗小鼠抗原亞型2b的多抗（產品目錄號為115-545-207)，Alexa Fluor 647 標記的山羊來源的抗小鼠抗原亞型2b的多抗（產品目錄號為115-605-207) ;Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗兔的多抗（產品目錄號為711-545-152)。
[0068] 結果如圖2所示，NGN3-EGFP+(含有胰腺內分泌前體細胞或新生的內分泌細胞）群 體中有NKX2. 2、NGN3、CHR0M0GRANIN A(CHGA)的表達，而不表達或低表達胰腺前體相關基因 PDXl，表明該細胞群的確主要為胰腺內分泌前體細胞或新生的內分泌細胞。
[0069] NGN3-EGFP-群體中無 NKX2. 2、CHR0M0GRANIN A (CHGA)、GFP 的表達，主要高表達胰 腺前體相關轉錄因子roXl，有極少部分細胞表達NGN3或NEUR0D1，表明該細胞群主要為胰 腺前體細胞或非胰腺細胞類型細胞。
[0070] L 3、NGN3-EGFP+細胞群富集SUSD2的表達
[0071] I) RNA測序顯示SUSD2在NGN3-EGFP+細胞群里富集表達
[0072] 用 QIAGEN 的 RNeay Plus Mini Kit 對上述 2 獲得的 NGN3-EGFP+ 細胞以及 NGN3-EGFP-細胞進行提取，各獲得2 μ g的總mRNA。將得到的mRNA純化后進行反轉錄得到 單鏈cDNA。用末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase)對得 到的單鏈cDNA的3'端加上poly A尾巴。將cDNA擴增12個PCR循環(huán)之后，用Illumina Paired-End DNA Sample Prep Kit進行cDNA文庫的構建。然后用 Illumina Hiseq2000對其 進行測序。用Tophat軟件將測序結果（raw reads)和人參考基因組（the human reference genome，NCBI Build 37, hgl9)進行比對，通過將配對序列（Mapping reads)和 NCBI 的參 考數據庫（RefSeq Genes hgl9)進行正向或反向匹配后重建轉錄組。通過計算所有基因 的表達豐度，并將其用RPKM進行標準化以后，下列標準來判斷一個基因在NGN3-EGFP+與 NGN3-EGFP-細胞之間差異表達的顯著性：1)表達倍比關系（fold change)大于2或小于 0. 5 ;2)P值小于0. 05。采用R軟件的熱圖軟件包（heatmap package)對獲得的數據基于 RPKM采用IoglO進行熱圖分析。利用差異基因表達（Differential Gene Expression, DGE) 進行GO分析。
[0073] 結果如圖3所示，相較于NGN3-EGFP-細胞，NGN3-EGFP+細胞富集表達胰腺內分泌 相關基因 NGN3、NEUR0D1、NKX2. 2、PAX4、ARX等，低表達胰腺前體細胞相關基因 H)X1、HNF1B、 HNF6等，說明分選獲得的NGN3-EGFP+細胞是胰腺內分泌前體細胞及新生的內分泌細胞。
[0074] NGN3-EGFP+細胞富集表達SUSD2(NR02212)，表達倍比關系是2. 30,說明從mRNA水 平上，SUSD2基因（序列2)可以作為鑒定待測細胞是否為胰腺內分泌前體細胞或新生的胰 腺內分泌細胞的標志。下一步鑒定SUSD2基因表達的蛋白是否也是同樣的情況。
[0075] 2)免疫熒光抗體法驗證SUSD2能夠標記NGN3-EGFP+細胞群
[0076] 對上述2獲得的NGN3-EGFP+細胞以及NGN3-EGFP-細胞用免疫熒光抗體法檢測 EGFP和SUSD2的表達。
[0077] 檢測EGFP的是雞來源的多抗（該抗體購自Abeam，產品目錄號為AB13970);檢測 SUSD2的是鼠來源的單抗（該抗體購自BioLegend，產品目錄號為327401)。
[0078] 所有抗體均為非直標抗體，檢測中分別用Jackson ImmunoResearch公司購來的抗 體復染。Cyanine Cy3標記的驢來源的抗小鼠的多抗（產品目錄號為715-165-151) ;Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗雞的多抗（產品目錄號為703-545-155)。
[0079] 結果如圖4所示，免疫組化結果顯示，SUSD2的表達與NGN3-EGFP完全吻合，且在 NGN3-EGFP-細胞中不表達，即在NGN3-EGFP+細胞中富集表達；說明SUSD2可以用來鑒定或 標記NGN3-EGFP+細胞，即胰腺內分泌前體細胞或新生的胰腺內分泌細胞所組成的混合細 胞群。
[0080] 二、SUSD2作為人多能干細胞分化得到的胰腺內分泌前體細胞標記基因
[0081] 2. 1、胰腺內胚層細胞的獲得
[0082] 將離體的人多能干細胞系NGN3-EGFP按照I. 1的方法，分化得到胰腺內胚層細 胞；
[0083] 2. 2、流式分析檢測SUSD2基因的表達及胰腺內分泌前體細胞標記基因 NKX2. 2、 NEUROD1的表達
[0084] 將上述2. 1得到的胰腺內胚層細胞通過流式分析法檢測SUSD2基因編碼蛋白的表 達，按照BD Biosciences購來的細胞固定/通透試劑盒（產品目錄號為554714)進行，將上 述2. 1得到的胰腺內胚層細胞固定后使用對應抗體和SUSD2直標抗體（小鼠來源的PE標記 的抗SUSD2的單抗（購自BioLegend，產品目錄號為327406);以及小鼠來源的APC標記單 抗（購自BioLegend,產品目錄號為327408)。小鼠來源的未標記的單抗（購自BioLegend, 產品目錄號為327401))染色，之后再用熒光二抗復染。用流式分選儀進行分析。
[0085] 檢測NKX2. 2的抗體是鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產品目錄號為74. 5A5); 檢測NGN3的抗體是綿羊來源的多抗（該抗體購自R&D Systems，產品目錄號為AF3444)和 小鼠來源的單抗（該抗體購自DSHB，產品目錄號為F25A1B3);檢測NEUR0D1的是山羊來源 的多抗（該抗體購自R&D Systems，產品目錄號為AF2746);檢測Η)Χ1的是山羊來源的多抗 (該抗體購自R&D Systems，產品目錄號為AF2419);檢測CHR0M0GRANIN A的是兔來源的多 抗（該抗體購自中杉金橋，產品目錄號為ZA-0507)。
[0086] 二抗購自Jackson ImmunoResearch :Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗山羊的 多抗（產品目錄號為705-545-147) ;Alexa Fluor 488標記的山羊來源的抗小鼠抗原亞型 2b的多抗（產品目錄號為115-545-207)，Alexa Fluor 647標記的山羊來源的抗小鼠抗原 亞型2b的多抗（產品目錄號為115-605-207) ;Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗兔的多 抗（產品目錄號為711-545-152) ;Alexa Fluor 488標記的驢來源的抗雞的多抗（產品目 錄號為 703-545-155)。
[0087] 結果圖如圖5所示，在第四階段第0天的時候，NGN3陽性或弱陽性的細胞并不表達 SUSD2或NEUR0D1，弱表達NKX2. 2。在第四階段第1天，分別有80%、93% and88%的SUSD2+ 細胞表達NGN3，NKX2. 2和NEUR0D1。這表明絕大部分SUSD2+細胞同時表達NGN3、NKX2. 2和 NEUROD1，說明這一群SUSD2+細胞具有內分泌前體細胞特征。在第四階段第4天的時候，大 部分SUSD2+細胞表達NKX2. 2或CHR0M0GRANIN A(CHGA)，并不表達NGN3,說明在該時期這 群SUSD2+/NGN3-的細胞具有內分泌細胞的特征。此外，SUSD2+細胞持續(xù)低表達或不表達胰 腺前體的標記Η)Χ1。說明SUSD2可以用來標記胰腺內分泌前體細胞及其子代內分泌細胞。
[0088] 在整個分化過程中，盡管存在部分SUSD2-細胞表達胰腺內分泌相關蛋白NGN3、 NKX2. 2等，絕大部分SUSD2-細胞不表達這些胰腺內分泌相關蛋白，而表達胰腺前體相關蛋 白PDX1，說明SUSD2-細胞主要包含胰腺前體細胞或非胰腺細胞類型細胞（圖5)。
[0089] 上述結果表明，SUSD2+細胞為胰腺內分泌前體細胞或新生的胰腺內分泌細胞，進 一步證明，SUSD2基因編碼蛋白的表達可以鑒定細胞是否為目的細胞。
[0090] 2. 3、SUSD2+細胞的mRNA水平上檢測用流式分選獲得了 SUSD2-細胞和SUSD2+細 胞，用定量PCR技術分析了這兩群細胞及未分選的胰腺內胚層細胞的基因表達情況。采用 Power SYBR? Master Mix試劑盒進行定量PCR(購自Life Technologies,產品目錄號為 4367659)，擴增引物見表1，內參引物為GAPDH，具體操作參見說明書。
[0091] 表1為擴增引物
[0092]

【權利要求】
1. 一種分選或輔助分選待測細胞群體中的胰腺內分泌前體細胞或新生的胰腺內分泌 細胞的方法，包括如下步驟：檢測待測細胞群體中的細胞是否表達SUSD2基因，若某些細胞 表達SUSD2基因，則某些細胞為或候選為胰腺內分泌前體細胞或新生的內分泌細胞；若某 些細胞不表達SUSD2基因，則某些細胞不為或候選不為胰腺內分泌前體細胞或新生的內分 泌細胞； 所述SUSD2基因的核苷酸序列為序列表中序列2。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述檢測待測細胞群體中的細胞是否表 達SUSD2基因是通過檢測待測細胞群體中的細胞是否含有SUSD2基因表達的蛋白，所述檢 測待測細胞群體中的細胞是否含有SUSD2基因表達的蛋白的方法為如下1)或2)或3): 1) 免疫熒光抗體法檢測，采用抗體為抗SUSD2單抗； 2) 流式分析檢測，采用抗體為抗SUSD2單抗； 3) 磁珠分選，采用抗體為抗SUSD2單抗。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待測細胞為胰腺內胚層細胞。
4. 根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述胰腺內胚層細胞為人源胰 腺內胚層細胞。 5. SUSD2蛋白或其編碼基因或編碼所述SUSD2蛋白的前體蛋白的mRNA作為標記物在鑒 定、篩選或分選胰腺內分泌前體細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞中的應用； 所述SUSD2蛋白的氨基酸序列為序列表中序列1所示； 所述SUSD2蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
6. 能夠與所述SUSD2蛋白特異性結合的抗體在制備鑒定、篩選或分選胰腺內分泌前體 細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞試劑中的應用。
7. 如權利要求6所述的應用，其特征在于：所述抗體攜帶熒光標記；所述抗體為單抗。
8. 如權利要求6或7所述的應用，其特征在于：所述應用為從胰腺內胚層細胞中篩選 或分選胰腺內分泌前體細胞和/或新生的胰腺內分泌細胞； 所述篩選或分選的方法為免疫磁珠分離法及流式細胞分選法； 所述鑒定的方法為免疫熒光抗體法及流式細胞分析法。
9. 能夠與編碼所述SUSD2蛋白的前體蛋白的mRNA特異性結合的引物對、探針或它們的 互補鏈在制備鑒定胰腺內分泌前體細胞和/或新生的內分泌細胞試劑中的應用。
10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述引物對由序列表中序列3所示的單鏈 DNA分子和序列表中序列4所不的單鏈DNA分子組成。
【文檔編號】C12Q1/68GK104215768SQ201410386506
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月7日 優(yōu)先權日:2014年8月7日
【發(fā)明者】鄧宏魁, 劉海松, 朱迪聰, 楊歡, 梁振 申請人:北京大學, 北京大學深圳研究生院, 北京瑞普晨創(chuàng)科技有限公司