手足綜合癥易感性檢測(cè)試劑盒和snp在其制備中的應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種手足綜合癥易感性檢測(cè)試劑盒和SNP在其制備中的應(yīng)用，所涉及的SNP位點(diǎn)是rs3890213。發(fā)明人根據(jù)卡培他濱代謝途徑相關(guān)基因，選取合適位點(diǎn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；收集轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的臨床病例，將臨床數(shù)據(jù)與相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，發(fā)現(xiàn)rs3890213位點(diǎn)基因型與手足綜合癥易感性之間存在顯著相關(guān)性。據(jù)此通過(guò)檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)的基因型，可以預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的手足綜合癥易感性，從而篩選卡培他濱使用的合適人群，提高臨床獲益以及避免嚴(yán)重不良反應(yīng)。【專利說(shuō)明】手足綜合癥易感性檢測(cè)試劑盒和SNP在其制備中的應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種手足綜合癥易感性檢測(cè)試劑盒以及SNP在制備手足綜合癥易感性檢測(cè)試劑盒中的用途。【
背景技術(shù)：
】[0002]乳腺癌是全世界女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，約有6-10%的乳腺癌患者在初診時(shí)及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時(shí)有30-40%病人在隨后的治療中發(fā)生遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移。出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的高峰在乳腺癌術(shù)后2-3年。轉(zhuǎn)移后患者的中位生存時(shí)間在9個(gè)月至3年不等。新出現(xiàn)的藥物和治療技術(shù)不但延長(zhǎng)了轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的中位生存期，同時(shí)還進(jìn)一步提高了患者的生存質(zhì)量。轉(zhuǎn)移性乳腺癌不可治愈，其治療目的是在保持最佳生活質(zhì)量的同時(shí)盡可能延長(zhǎng)總生存、緩解腫瘤癥狀以及抑制腫瘤的進(jìn)展。對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌，通常選擇卡培他濱、吉西他濱等非蒽環(huán)類藥物方案治療。[0003]卡培他濱是一種高效的氟尿嘧啶口服制劑，通過(guò)胸苷酸磷酸化酶的作用轉(zhuǎn)化成氟尿嘧啶的前體藥物，從而模擬氟尿嘧啶的持續(xù)緩慢靜滴，而胸苷酸磷酸化酶在腫瘤組織中含量較高，因此卡培他濱對(duì)腫瘤組織的作用強(qiáng)，應(yīng)用于多種實(shí)體瘤的治療。既往國(guó)外研究表明卡培他濱單藥或聯(lián)合其他藥物使用的有效率為28%-75%，其中卡培他濱聯(lián)合其他細(xì)胞毒性藥物使用，其臨床有效率及獲益率均明顯提高。這可能與細(xì)胞毒性藥物與卡培他濱有協(xié)同作用相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞毒性藥物能使胸苷酸磷酸化酶的活性升高相關(guān)。因此NCCN指南上推薦卡培他濱方案聯(lián)合治療方案作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的優(yōu)選方案。[0004]卡培他濱總體耐受尚可，有研究表明卡培他濱出現(xiàn)的不良反應(yīng)種類與治療方案和給藥頻率等因素相關(guān)?？ㄅ嗨麨I常見(jiàn)的毒性反應(yīng)為腹瀉、胃腸道反應(yīng)、手足綜合癥以及骨髓抑制等。Gomez-Martin.C等發(fā)現(xiàn)卡培他濱聯(lián)合其他細(xì)胞毒性藥物治療晚期胃癌，最常見(jiàn)不良反應(yīng)為手足綜合癥，其發(fā)生率為20%;而3-4度的中性粒細(xì)胞減少發(fā)生率約15.2%;腹瀉的發(fā)生率則為11.4%。Blum等觀察發(fā)現(xiàn)卡培他濱聯(lián)合紫杉醇周療最常見(jiàn)的不良反應(yīng)同樣為手足綜合征、中性粒細(xì)胞減少等，其發(fā)生率分別為15%和11%。其他多項(xiàng)II、111臨床研究也發(fā)現(xiàn)手足綜合癥、中性粒細(xì)胞減少等劑量限值性的不良反應(yīng)，但其發(fā)生率均有不同。[0005]從多項(xiàng)臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)上我們觀察到，無(wú)論是卡培他濱單藥還是聯(lián)合其他細(xì)胞毒性藥物或靶向藥物，其臨床有效率及獲益率和不良反應(yīng)發(fā)生率均有不同。究竟是何種原因引起的這種差異？[0006]隨著對(duì)分子分型、化療藥作用機(jī)制以及靶向藥物作用于信號(hào)通路的位點(diǎn)的深入理解，更要多關(guān)注功能性以及療效預(yù)測(cè)的研究。當(dāng)前功能性以及療效有關(guān)預(yù)測(cè)的研究主要集中于基因水平。而乳腺癌是一個(gè)多因素遺傳變異性疾病，只有不足10%是由于單基因缺陷引起的。隨著高通量基因技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多與乳腺癌相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因上潛在的遺傳變異（單核苷酸多態(tài)和拷貝數(shù)變異）可能引起乳腺癌藥物治療效果的差異。由于遺傳變異的存在使抗腫瘤藥物的代謝途徑以及藥物作用的目標(biāo)基因可能受到影響，進(jìn)而影響療效以及預(yù)后。單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP)為第三代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。目前對(duì)于不同分型乳腺癌預(yù)后、療效的預(yù)測(cè)性研究主要集中在SNP水平。[0007]目前通過(guò)高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)在信號(hào)通路中起著關(guān)鍵作用的基因中SNP發(fā)生變異使得相關(guān)步驟的失活或活性增加，從而出現(xiàn)藥物療效及不良反應(yīng)的發(fā)生在不同個(gè)體中的差異。[0008]基于以上原因，發(fā)明人根據(jù)卡培他濱代謝途徑相關(guān)基因，選取合適位點(diǎn)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；收集轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的臨床病例，將臨床數(shù)據(jù)與相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，以期望可以挑選出合適生物學(xué)標(biāo)志物，進(jìn)而預(yù)測(cè)卡培他濱使用的合適人群，提高臨床獲益以及避免嚴(yán)重不良反應(yīng)。【
發(fā)明內(nèi)容】[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠檢測(cè)手足綜合癥易感性的生物學(xué)標(biāo)記物，進(jìn)而預(yù)測(cè)卡培他濱使用的合適人群，提高臨床獲益以及避免嚴(yán)重不良反應(yīng)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了CES基因的rs3890213位點(diǎn)與手足綜合癥的發(fā)生相關(guān)，并當(dāng)rs3890213位點(diǎn)基因型為A/G時(shí)，受試者的手足綜合癥易感性升高。據(jù)此開(kāi)發(fā)了手足綜合癥易感性的檢測(cè)試劑盒，和檢測(cè)CES基因rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑在制備手足綜合癥易感性的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。[0010]一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑，所述試劑可以是采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP的試劑，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs3890213位點(diǎn)基因型即可。[0011]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑包括使用SequenomMassArray檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型所需的試劑，所述使用SequenomMassArray檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型所需的試劑包括用于擴(kuò)增rs3890213位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物，擴(kuò)增引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'。優(yōu)選地，檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑還包括用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物，延伸引物序列為5,-TGGAGATGGTGCCTGA-3，。[0012]另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)rS3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒，該試劑盒可以包括采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs3890213位點(diǎn)基因型即可。[0013]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物，擴(kuò)增引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'。[0014]在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物，延伸引物序列為5'-TGGAGATGGTGCCTGA-3'。[0015]在另一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物；擴(kuò)增引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'；延伸引物序列為5'-TGGAGATGGTGCCTGA-3'。[0016]又一方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)手足綜合癥易感性的試劑盒，該試劑盒可以包括采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP基因型的試劑，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs3890213位點(diǎn)基因型即可。[0017]在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)手足綜合癥易感性的試劑盒包括用于擴(kuò)增rs3890213位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物，擴(kuò)增引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'。[0018]在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)手足綜合癥易感性的試劑盒包括用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物，延伸引物序列為5'-TGGAGATGGTGCCTGA-3'。[0019]在另一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)手足綜合癥易感性的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物。擴(kuò)增引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'；延伸引物序列為5'-TGGAGATGGTGCCTGA-3'。[0020]優(yōu)選地，本發(fā)明的用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒和用于檢測(cè)手足綜合癥易感性的試劑盒還包括DNA提取試劑，DNA提取試劑包括苯酚、氯仿、異戊醇、乙醇。[0021]又一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的方法。所述檢測(cè)方法的操作步驟如下：[0022](1)提取基因組DNA;[0023]⑵使用SequenomMassArray檢測(cè)法檢測(cè)rs389〇2l3位點(diǎn)基因型。SequenomMassArray檢測(cè)法中使用用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物。[0024]步驟⑵中SequenomMassArray檢測(cè)法使用的用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'。用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物序列為5,-TGGAGATGGTGCCTGA-3，。[0025]本發(fā)明還提供了檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑在制備檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型的試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑盒可以包括采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP的試齊U，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs3890213位點(diǎn)基因型即可。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物。引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物，延伸引物序列為5'-TGGAGATGGTGCCTGA-3'。在另一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物。擴(kuò)增引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'；延伸引物序列為5,-TGGAGATGGTGCCTGA-3，。[0026]本發(fā)明還提供了用于rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑在制備用于檢測(cè)手足綜合癥易感性的試劑盒中應(yīng)用，所述試劑盒可以包括采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測(cè)SNP的試劑，只要其能夠檢測(cè)樣本中rs3890213位點(diǎn)基因型即可。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物。引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物，延伸引物序列為5'-TGGAGATGGTGCCTGA-3'。在另一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒包括用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物。擴(kuò)增引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'；延伸引物序列為5,-TGGAGATGGTGCCTGA-3，。[0027]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：[0028](1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了rs3890213位點(diǎn)與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者手足綜合癥易感性的關(guān)系；[0029](2)本發(fā)明在基因水平上檢測(cè)手足綜合癥易感性的影響因素，發(fā)現(xiàn)當(dāng)rs3890213位點(diǎn)基因型為A/G，患者為手足綜合癥易感者，據(jù)此可以將rs3890213位點(diǎn)基因型為A/G作為篩選轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者不能采用卡培他濱治療的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)上述原理研發(fā)的試劑盒可應(yīng)用于臨床，可有效提高臨床獲益以及避免嚴(yán)重不良反應(yīng)。[0030]具體的實(shí)施方式[0031]通過(guò)參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。[0032]實(shí)施例1人類手足綜合癥易感性相關(guān)基因SNPs位點(diǎn)的鑒定[0033]1.臨床資料[0034]1.1研究對(duì)象[0035]所選取的研究對(duì)象均為2010年1月至2012年9月間中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院診治的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，所有研究對(duì)象均有可提供的病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷的標(biāo)本（乳腺原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶）。[0036]1.2病理及臨床資料[0037]ER、PR狀態(tài)通過(guò)免疫組化的方法判定；HER2狀態(tài)通過(guò)免疫組化或熒光原味雜交的方案判定。ER陽(yáng)性和PR陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為>10%的腫瘤細(xì)胞核染色為陽(yáng)性。HER2陽(yáng)性的定義為熒光原位雜交無(wú)擴(kuò)增或者免疫組化染色3+(指大于30%的浸潤(rùn)性癌的完整細(xì)胞膜強(qiáng)著色）；Her2陰性定義為，免疫組化法Her2染色0或1+(無(wú)浸潤(rùn)性癌細(xì)胞膜著色，或浸潤(rùn)性癌中不足10%細(xì)胞膜染色或少部分細(xì)胞基底膜輕度著色），或免疫組化法Her2染色2+(2+定義為10-30%的浸潤(rùn)性癌部分細(xì)胞基底膜，中等強(qiáng)度著色），但Her2FISH檢測(cè)法確認(rèn)Her2基因無(wú)擴(kuò)增。[0038]所有患者均詳細(xì)記錄人口學(xué)及臨床病理資料。腫瘤分期按2010年美國(guó)腫瘤研究聯(lián)合委員會(huì)（AmericanJointCommitteeonCancerStagingGroup，AJCC)乳腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)（第7版）進(jìn)行。轉(zhuǎn)移性乳腺癌包括局部或區(qū)域復(fù)發(fā)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。局部或區(qū)域復(fù)發(fā)指臨床發(fā)現(xiàn)并通過(guò)病理性或影像學(xué)證實(shí)的同側(cè)胸壁、乳腺或區(qū)域淋巴結(jié)復(fù)發(fā)；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移指臨床發(fā)現(xiàn)及影像學(xué)證實(shí)有遠(yuǎn)處器官的侵犯。[0039]入排標(biāo)準(zhǔn)：[0040](1)經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)確診的女性乳腺癌患者；（2)除皮膚基底細(xì)胞癌外不合并其他惡性腫瘤；（3)有完整的臨床病歷資料，包括乳腺癌確診年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、分期、月經(jīng)狀態(tài)、受體和HER2狀況、以及既往局部和全身治療情況；(4)所有患者均可獲得完整的隨訪資料。[0041]最后共342例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者納入本研究。[0042]L3相關(guān)定義及觀察指標(biāo)[0043]治療療效依照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（ResponseEvaluationCriteriainSolidTumors,RECIST)1.0版進(jìn)行評(píng)價(jià)。[0044]完全緩解（completeresponse，CR)和部分緩解（partialresponse，PR)定義為含希羅達(dá)方案化療敏感，疾病穩(wěn)定（StableDisease,SD)和疾病進(jìn)展（ProgressionDisease，PD)定義為含希羅達(dá)方案化療不敏感。以CR和PR為有效計(jì)算總有效率。[0045]無(wú)病生存期（Disease-freesurvival,DFS):自乳腺癌手術(shù)日期至乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的時(shí)間。[0046]總生存期（postmetastasissurvival,MSR)是指確診轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)起至死亡或末次隨診的時(shí)間。[0047]1.4治療[0048]所有的患者均遵循美國(guó)國(guó)立癌癥中心（NationalComprehensiveCancerNetwork，NCCN)指南給予患者選擇含有卡培他濱的化療方案。2-3個(gè)周期治療后按實(shí)體瘤療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（ResponseEvaluationCriteriainSolidTumors，RECIST)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。[0049]1·5隨訪[0050]采用門診隨訪及電話隨訪的方式對(duì)納入研究的患者進(jìn)行定期訪視，詳細(xì)記錄腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況以及生存狀態(tài)，末次隨訪時(shí)間截止于2014年3月1日。[0051]2.相關(guān)候選基因多態(tài)性位點(diǎn)的選擇[0052]2.1原則[0053]關(guān)注卡培他濱藥物代謝途徑及DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因，選擇與轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療療效及毒性可能相關(guān)的基因作為候選基因，通過(guò)PUBMED進(jìn)行檢索既往報(bào)道結(jié)果，選定卡培他濱代謝相關(guān)基因：胸苷酸合成酶（Thymidylatesynthase,TYMS)、四氫葉酸還原酶（MethyleneTetrahydrofolateReductase，MTHFR)、羧酸酯酶（carboxylesterase，CES)、胞苷脫氨酶（Cytidinedeaminase,CDA)，DNA合成過(guò)程關(guān)鍵基因核糖核酸還原酶Ml(RibonucleotidereductaseMl,RRM1)。[0054]2.2SNP位點(diǎn)的選擇[0055]在國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃提供的SNP公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)以及千人基因組計(jì)劃中檢索上述候選基因及鄰近序列，選取有關(guān)漢族人群的SNP位點(diǎn)，再以其中的標(biāo)簽SNP(taggingsinglenucleotidepolymorphism,tagSNP)作為進(jìn)一步分型的候選多態(tài)位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合最小等位基因頻率（minorallelefrequence,MAF)以及哈迪-溫伯格平衡（Hardy-WeinbergEquilibrium，HWE)等對(duì)候選SNP進(jìn)行篩選以得出最佳的tagSNP。選取要求包括MAF>0.05且HWpvalX).1。最終符合要求的候選SNP位點(diǎn)29個(gè)。[0056]3.實(shí)驗(yàn)方法[0057]3.1DNA提取[0058]3.1.1提取方法[0059]全部入組患者采集2ml的抗凝外周血標(biāo)本,采用酚-氯仿法提取基因組DNA。DNA標(biāo)本分離自外周血白細(xì)胞。簡(jiǎn)述如下：[0060](1)將收集的抗凝血標(biāo)本從-80°c取出后置于室溫，待溶化后將血轉(zhuǎn)入另一干凈的離心管，蓋嚴(yán)后于5000Xg離心15min;[0061](2)將離心后的血上層棄去，留血細(xì)胞，加入適量裂解緩沖液（含10mMpH為8.0的Tris-HCl、0.1MEDTA、20yg/ml胰RNA酶、0·5%SDS)，混勻，于37°C溫浴lh，加蛋白酶Κ(100μg/ml)混勻后37°C溫浴過(guò)夜；[0062](3)溫浴結(jié)束后加入等體積經(jīng)Tris-HCl飽和過(guò)的平衡酚（pH7.4)充分混勻后于8000Xg離心15min;[0063](4)將上層水相移至另一離心管并加入等體積酚：氯仿（1:1)，充分混勻后8000Xg離心15min;[0064](5)將上層水相移入另一離心管中，加入10%體積的乙酸銨溶液（10M)，混勻后加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后放入-20°C。沉淀出的DNA經(jīng)75%乙醇洗滌兩次后，溶于適量TE緩沖液。使用分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。[0065]3.1.2提取DNA的質(zhì)量檢測(cè)和儲(chǔ)存[0066]提取出的DNA通過(guò)分光光度法來(lái)測(cè)定其濃度，Sequenom技術(shù)要求DNA達(dá)以下標(biāo)準(zhǔn)：濃度在l〇ng/ul以上；0D260/280=1.8?2.0。DNA樣品置于1.5mlEP管中儲(chǔ)存于-80°C超低溫冰箱內(nèi)。進(jìn)行SNP分型檢測(cè)時(shí)，樣品被編碼后分裝于96孔板內(nèi)。[0067]3.2候選多態(tài)基因型分析[0068]3.2.1SNP分型方法[0069]根據(jù)NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)的基因序列，設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR)引物和延伸引物序列，采用高通量的MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜生物芯片系統(tǒng)（Sequenom)分析候選SNP的基因型。SNP分型由博淼生物科技（北京）有限公司協(xié)助完成。[0070]MassARRAY系統(tǒng)的工作原理是利用雜交探針與PCR產(chǎn)物結(jié)合后進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)不同等位基因延伸長(zhǎng)度不同，通過(guò)質(zhì)譜飛行時(shí)間不同鑒別探針延伸長(zhǎng)度來(lái)確定不同基因型，其基因分型準(zhǔn)確率達(dá)到97%以上。MassARRAY系統(tǒng)是目前唯一采用質(zhì)譜法直接檢測(cè)SNP的設(shè)備，其反應(yīng)體系不依賴雜交，因此不受雜交錯(cuò)配的干擾。該系統(tǒng)與TaqMan分型平臺(tái)不同，也不需要對(duì)引物或探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，避免了熒光物質(zhì)對(duì)基因分型過(guò)程的干擾。[0071]為了質(zhì)量控制，基因分型檢測(cè)時(shí)均設(shè)平行重復(fù)樣品和陰性對(duì)照（不含DNA的空白），平行樣品分析結(jié)果的重現(xiàn)率為1〇〇%。此外，每一樣品的疾病狀態(tài)對(duì)分型操作及分析人員保持盲態(tài)。[0072]3.2.2Sequenom實(shí)驗(yàn)操作步驟[0073]3.2.2.1引物設(shè)計(jì)及合成[0074]根據(jù)確定的SNP位點(diǎn)，以SNP位點(diǎn)為中心截取100bp以上長(zhǎng)度的基因序列。將得到的基因序列利用引物設(shè)計(jì)軟件AssayDesign3.1設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)和單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物并合成。[0075]表1候選基因SNP位點(diǎn)的PCR引物和延伸引物的序列[0076]【權(quán)利要求】1.一種用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑，所述試劑包括使用SequenomMassArray檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型所需的試劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述使用SequenomMassArray檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型所需的試劑包括用于擴(kuò)增rs3890213位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和/或用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述擴(kuò)增引物序列如下所示：正向引物5，-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3，，反向引物5，-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3，。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述延伸引物序列為5,-TGGAGATGGTGCCTGA-3，。5.-種用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試劑。6.-種用于檢測(cè)手足綜合癥敏感性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試劑。7.-種檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法的操作步驟如下：(1)提取基因組DNA;⑵使用SequenomMassArray檢測(cè)法檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型；SequenomMassArray檢測(cè)法中使用用于擴(kuò)增SNP位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物和用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟（2)中SequenomMassArray檢測(cè)法使用的用于擴(kuò)增rs3890213位點(diǎn)在內(nèi)的核苷酸序列的引物序列如下所示：正向引物5'-ACGTTGGATGGATAACCAGGGCCTGAACAC-3'，反向引物5'-ACGTTGGATGGATTAGGAGGAAGGATCAGC-3'；所述用于單堿基擴(kuò)增反應(yīng)的延伸引物序列為5'-TGGAGATGGTGCCTGA-3'。9.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試劑在制備用于檢測(cè)rs3890213位點(diǎn)基因型的試劑盒中的用途。10.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試劑在制備用于檢測(cè)手足綜合癥易感性的試劑盒中的用途。【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104120188SQ201410387514【公開(kāi)日】2014年10月29日申請(qǐng)日期:2014年8月7日優(yōu)先權(quán)日:2014年8月7日【發(fā)明者】徐兵河,馬飛,岳健申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院