一種氨基?；傅呐囵B(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種酶制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別公開(kāi)了一種氨基?；傅呐囵B(yǎng)方法。該氨基酰化酶的培養(yǎng)方法，其特征在于：以米曲霉誘變得到的菌株為菌種，將米曲霉誘變菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)54h，在5g麩曲培養(yǎng)物中加入pH7.0的0.01mol磷酸緩沖液30mL，之后浸提2h，用超濾膜過(guò)濾后，得到上清液，即為氨基?；复置敢?；將誘變株孢子懸液置于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，挑取生長(zhǎng)較迅速的單菌落，培養(yǎng)后測(cè)定酶活力。本發(fā)明選育的是以氨基?；副磉_(dá)優(yōu)勢(shì)的新菌種，目的基因argE的表達(dá)產(chǎn)物即為L(zhǎng)-氨基?；福哂忻富钚愿?，酶熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，且該菌的發(fā)酵周期短。
【專利說(shuō)明】一種氨基酰化酶的培養(yǎng)方法
[0001](一)

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種酶制劑【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種氨基?；傅呐囵B(yǎng)方法。
[0002](二)

【背景技術(shù)】
L-蛋氨酸是含硫必需氨基酸，與生物體內(nèi)各種含硫化合物的代謝關(guān)系密切，具有保肝解毒的作用，蛋氨酸可作為藥物治療疾病，也可作為飼料添加劑廣泛地使用。采用化學(xué)合成法所制得的氨基酸一般都是消旋的DL-氨基酸，而在食品、醫(yī)藥及飼料等方面的應(yīng)用皆要求為L(zhǎng)-氨基酸，所以，必須對(duì)化學(xué)合成的氨基酸進(jìn)行拆分。
[0003]氨基酰化酶的立體特異性為L(zhǎng)型，可以將化學(xué)合成的N-乙酰DL-氨基酸拆分，從而獲得L-氨基酸。反應(yīng)物中留下的D-型底物可以用化學(xué)方法消旋轉(zhuǎn)型繼續(xù)拆分或去乙?；@得D-氨基酸。這一方法幾乎適合于所以合成法獲得的DL-氨基酸的拆分。氨基酰化酶最初的來(lái)源為動(dòng)物腎臟，現(xiàn)在較普遍的來(lái)源為米曲霉。目前的研究熱點(diǎn)多集中在從米曲霉中提取氨基酰化酶及酶的固定化上，但其酶活力急待提高。
[0004](三)


【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種產(chǎn)品純度高、活性大的氨基?；傅呐囵B(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種氨基?；傅呐囵B(yǎng)方法，其特征在于:以米曲霉誘變得到的菌株為菌種，將米曲霉誘變菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)54h，在5g麩曲培養(yǎng)物中加入pH7.0的0.01mol磷酸緩沖液30mL，之后浸提2h，用超濾膜過(guò)濾后，得到上清液，即為氨基酰化酶粗酶液；將誘變株孢子懸液置于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，挑取生長(zhǎng)較迅速的單菌落，培養(yǎng)后測(cè)定酶活力。
[0006]本發(fā)明的重點(diǎn)是尋找具有高活性酶的菌種、發(fā)酵條件的油化以及高活力酶的純化，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)工作達(dá)到了很高的生產(chǎn)水平。
[0007]本發(fā)明的更優(yōu)方案為:
所述斜面培養(yǎng)基的成分為=NaNO3 0.3g、KCl 0.05g、K2HPO4 0.lg、MgSO4.7H20 0.05g、鹿糖 3g、H20 10g0
[0008]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:每升發(fā)酵液中含有200g土豆浸出液、20g葡萄糖、2g蛋白胨。
[0009]所述種子培養(yǎng)基的組成為豆餅粉55%、麩皮45%，其中料水比為100重量份:85體積份。
[0010]所述氨基酰化酶活力的定義為在pH7.0、37°C下，Ih內(nèi)由酶催化拆分產(chǎn)生lmol/L的L-Met的酶量為I個(gè)酶活力單位。
[0011]本發(fā)明選育的是以氨基酰化酶表達(dá)優(yōu)勢(shì)的新菌種，目的基因argE的表達(dá)產(chǎn)物即為L(zhǎng)-氨基?；?，具有酶活性高，酶熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，且該菌的發(fā)酵周期短。
[0012](四)【具體實(shí)施方式】實(shí)施例:1.菌種:米曲霉誘變得到的菌株。
[0013]2.培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基(查氏培養(yǎng)基):NaNO3 0.3g、KCl 0.05g、K2HPO4 0.lg、MgS04.7H20 0.05g、蔗糖3g、H2O 10g ;種子培養(yǎng)基:豆餅粉55%、麩皮45%，料:水=100: 85 (W/V);發(fā)酵培養(yǎng)基(g/U:200g 土豆浸出液、20g葡萄糖、2g蛋白胨。
[0014]3.方法
(I)氨基?；傅闹苽?br> 米曲霉經(jīng)查氏斜面培養(yǎng)基活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)54h，在5g麩曲培養(yǎng)物中加入pH7.0,0.1mol磷酸緩沖液30mL，32±2°C浸提2h，用超濾膜過(guò)濾后，得到上清液，即為氨基?；复置敢骸?br> [0015](2)高酶活力菌株的選育
將誘變株孢子懸液于平板培養(yǎng)24h后，挑取生長(zhǎng)較迅速的單菌落，培養(yǎng)后測(cè)定酶活力。
[0016](3)氨基?；富盍Φ臏y(cè)定
參照Chibata等人的方法進(jìn)行，酶活力單位定義為:在pH7.0、37°C下，Ih內(nèi)由酶催化拆分產(chǎn)生lmol/L的L-Met的酶量為I個(gè)酶活力單位(Iu)。
[0017](4)細(xì)胞的酶活力測(cè)定
稱取菌球0.5g加入0.lmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液25mL，37°C下保溫5min后，加入
0.05mol/L 的 N-乙酰 DL-Met (內(nèi)含 5 X 10_4mol/L 的 C02+) 5mL, 150rpm、37°C保溫 30min，反應(yīng)結(jié)束后取出ImL反應(yīng)液，用茚三酮顯色法測(cè)定所釋放出來(lái)的L-Met的量。
【權(quán)利要求】
1.一種氨基?；傅呐囵B(yǎng)方法，其特征在于:以米曲霉誘變得到的菌株為菌種，將米曲霉誘變菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)54h，在5g麩曲培養(yǎng)物中加入PH7.0的0.01mol磷酸緩沖液30mL，之后32±2°C浸提2h，用超濾膜過(guò)濾后，得到上清液，即為氨基?；复置敢?；將誘變株孢子懸液置于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，挑取生長(zhǎng)較迅速的單菌落，培養(yǎng)后測(cè)定酶活力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基酰化酶的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述斜面培養(yǎng)基的成分為=NaNO3 0.3g、KCl 0.05g、K2HPO4 0.lg、MgSO4.7H20 0.05g、蔗糖 3g、H20 10go
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基?；傅呐囵B(yǎng)方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:每升發(fā)酵液中含有200g 土豆浸出液、20g葡萄糖、2g蛋白胨。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基?；傅呐囵B(yǎng)方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基的組成為豆餅粉55%、麩皮45%，其中料水比為100重量份:85體積份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基酰化酶的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述氨基?；富盍Φ亩x為在PH7.0、37°C下，Ih內(nèi)由酶催化拆分產(chǎn)生lmol/L的L-Met的酶量為I個(gè)酶活力單 位。
【文檔編號(hào)】C12R1/69GK104130997SQ201410388288
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】王東陽(yáng), 蔡傳康, 徐強(qiáng), 閆汝?yáng)|, 張華
申請(qǐng)人:山東陽(yáng)成生物科技有限公司