囊胚培養(yǎng)液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種囊胚培養(yǎng)液及其制備方法，囊胚培養(yǎng)液，包含對受精卵進行處理培養(yǎng)的組合物、殺菌劑及選擇性添加的指示劑和選擇性添加人血清白蛋白。本發(fā)明的囊胚培養(yǎng)液各項指標達到體外培養(yǎng)液的標準使用安全且易于判斷培養(yǎng)液是否變質(zhì)，為輔助生殖技術(shù)提供有力保證。
【專利說明】囊胚培養(yǎng)液及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及人工輔助生殖技術(shù)，尤其涉及一種囊胚培養(yǎng)液及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 囊胚培養(yǎng)液對胚胎的發(fā)育培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于試管嬰兒技術(shù)中。囊胚培養(yǎng)液的目的 是：一是提供胚胎存活并發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)；二是為胚胎的生存提供必要的環(huán)境。囊胚培養(yǎng) 液的用途：實驗室或臨床在二氧化碳環(huán)境下對體外囊胚提供分裂發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)及必要環(huán) 境。
[0003] 目前，我國輔助生殖技術(shù)中的囊胚培養(yǎng)液依賴進口成品，成本高且溶液的有效性 的好壞不能很好的表現(xiàn)，如果在培養(yǎng)液變質(zhì)后仍繼續(xù)使用將對實驗或臨床操作造成不可逆 轉(zhuǎn)的結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種各項指標達到體外培養(yǎng)液的標準使用安全，易于判斷 培養(yǎng)液是否變質(zhì)的囊胚培養(yǎng)液，為輔助生殖技術(shù)提供有力保證。
[0005] 本發(fā)明的囊胚培養(yǎng)液，包含對受精卵進行處理培養(yǎng)的組合物、殺菌劑。
[0006] 所述殺菌劑為慶大霉素，濃度9. 5-10. 5mg/L。
[0007] 所述組合物中包含氯化鈉90. 25-99. 75mmol/L，氯化鉀2. 375-2. 625 mmol/L，磷 酸二氫鉀 〇· 333-0. 368mmol/L，硫酸鎂 0· 19-0. 21mmol/L，葡萄糖 3. 04-3. 36mmol/L，氯化 鈣 1. 615-1. 785 mmol/L，乳酸鈉 1. 418-1. 567g/L，丙酮酸鈉 0· 095-0. 105mmol/L，碳酸氫鈉 23. 75-26. 25mmol/L，丙氨酰谷氨酰胺 0. 95-1. 05mmol/L，牛磺酸 0. 38-0. 42mmol/L，4-羥乙 基哌嗪乙磺酸HEPES 2. 375-2. 625mmol/L，非必需氨基酸0. 95-1. 05% (v/v)，必需氨基酸 1. 9-2. 1% (v/v)，維生素 0· 95-1. 05% (v/v)，慶大霉素 9. 5-10. 5mg/L。
[0008] 所述非必需氨基酸為L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨 酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸中的一種或者幾種。
[0009] 所述必需氨基酸為L-精氨酸、L-胱氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴 氨酸、L-蛋氨酸、苯L-丙氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸中的一種或者 幾種。
[0010] 所述維生素為氯化膽堿、葉酸、肌醇、煙酰胺、D-泛酸、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫 氨酸中的一種或者幾種。
[0011] 囊胚培養(yǎng)液的溶劑采用超純水。
[0012] 本發(fā)明所述囊胚培養(yǎng)液中可以選擇性加入指示劑為酚紅，濃度4. 75-5. 25mg/L。
[0013] 本發(fā)明囊胚培養(yǎng)液中含有人血清白蛋白9. 5-10. 5%，v/v，可在使用時添加或分裝 前添加。
[0014] 本發(fā)明的囊胚培養(yǎng)液的ρΗ=7· 20-7. 50,滲透壓260-290m0sm/Kg。
[0015] 本發(fā)明囊胚培養(yǎng)液的制備方法，包括下面步驟： (1) 基礎(chǔ)液的配制 a、 先按照比例稱量各組分，并分開放置； b、 先將稱量好的組分（除殺菌劑、選擇性添加指示劑、碳酸氫鈉以及人血清白蛋白）溶 于超純水中，溶解過程中遵循先固體后液體，NaHC0 3最后加入的原則； c、 向步驟b所得溶液中加入稱量好的殺菌劑、選擇性添加指示劑和碳酸氫鈉； d、 將配置好的基礎(chǔ)液放置37°C、5. 5%的C02培養(yǎng)箱中平衡6-12小時，此步驟用來調(diào)節(jié) PH在7. 20-7. 50范圍內(nèi)； (2) 囊胚培養(yǎng)液的原液配制 a、 將囊胚培養(yǎng)液的基礎(chǔ)液在超凈工作臺下利用0. 2 μ m的濾膜過濾除菌，得到濾液A ; b、 在濾液A中加入人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得到囊胚培養(yǎng)液的原液；或者 省略該步驟，將濾液A作為囊胚培養(yǎng)液的原液，醫(yī)生使用時添加人血清白蛋白； (3) 囊胚培養(yǎng)液原液的處理 在無菌環(huán)境下對囊胚培養(yǎng)液原液進行分裝封口，得到囊胚培養(yǎng)液，將其放置冰箱或冷 庫內(nèi)保存； (4) 囊胚培養(yǎng)液的檢測 檢測項目是pH值、滲透壓、細胞毒性、皮內(nèi)刺激、致敏、無菌、熱原、細菌內(nèi)毒素、體外鼠 胚試驗來判斷囊胚培養(yǎng)液是否合格。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是，1、本發(fā)明囊胚培養(yǎng)液的原料均是已經(jīng)證明其安全性的物 質(zhì)，在制備過程中其溶劑采用超純水，超純水的總有機碳（T0C)超低，避免了因雜質(zhì)過多影 響測定的結(jié)果。2、國內(nèi)還沒有成型的用于試管嬰兒技術(shù)的培養(yǎng)液，此配方和制備方法為國 內(nèi)的試管嬰兒技術(shù)提供了有力的保證，避免了國外產(chǎn)品因長途運輸帶來的不明因素，同時 配制工藝操作簡單合理，檢測嚴密，能夠提供新鮮的培養(yǎng)液供生殖中心或科研院所使用。3、 使用抗生素來抑制細菌的生長，如慶大霉素是一種廣譜、熱穩(wěn)定性好的抗生素，在囊胚培養(yǎng) 液中添加慶大霉素可以有效抑制細菌的生長。4、囊胚培養(yǎng)液中選擇性添加指示劑酚紅，酚 紅在pH變化時顏色變化明顯，pH在7. 20-7. 50范圍內(nèi)酚紅溶液為粉紅色到橙紅色，當pH值 小于6. 8時為黃色，當pH值大于8. 4時為紅色，變色比較明顯，囊胚培養(yǎng)液的pH7. 20-7. 50 在此范圍內(nèi)溶液為粉紅色到橙紅色，當囊胚培養(yǎng)液顏色與此不符時，說明該囊胚培養(yǎng)液變 質(zhì)，不能用于實驗或臨床，從而避免了使用變質(zhì)囊胚培養(yǎng)液而產(chǎn)生的風(fēng)險。囊胚培養(yǎng)液中如 不含酚紅指示劑，則溶液呈透明、清澈，在有效期內(nèi)能保證無菌且正常使用，如變渾濁則不 能使用。

【具體實施方式】
[0017] 以下通過實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0018] 一、囊胚培養(yǎng)液配方及制備方法 表1囊胚培養(yǎng)液的配方

【權(quán)利要求】
1. 囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，包含對受精卵進行處理培養(yǎng)的組合物、殺菌劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，所述殺菌劑為慶大霉素，濃度 9. 5-10. 5mg/L〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，所述組合物中包含氯化鈉 90. 25-99. 75mmol/L，氯化鉀 2. 375-2. 625 mmol/L，磷酸二氫鉀 0· 333-0. 368mmol/L，硫 酸鎂 0· 19-0. 21mmol/L，葡萄糖 3. 04-3. 36mmol/L，氯化鈣 1. 615-1. 785 mmol/L，乳酸 鈉 1. 418-1. 567g/L，丙酮酸鈉 0. 095-0. 105mmol/L，碳酸氫鈉 23. 75-26. 25mmol/L，丙氨 酰谷氨酰胺〇. 95-1. 05mmol/L，?；撬?. 38-0. 42mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸HEPES 2. 375-2. 625mmol/L，非必需氨基酸 0. 95-1. 05%，v/v，必需氨基酸 1. 9-2. 1%，v/v，維生素 0.95-1.05%，v/v，慶大霉素 9. 5-10. 5mg/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，所述非必需氨基酸為L-丙氨酸、 L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸中的一種或者幾 種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，所述必需氨基酸為L-精氨酸、 L-胱氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、苯L-丙氨酸、L-蘇 氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸中的一種或者幾種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，所述維生素為氯化膽堿、葉酸、肌 醇、煙酰胺、D-泛酸、吡哆醛、吡哆醇、核黃素、硫氨酸中的一種或者幾種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，囊胚培養(yǎng)液的溶劑采用超純水。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中選擇性添 加指示劑酚紅，濃度4. 75-5. 25mg/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的囊胚培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中含有人血 清白蛋白9. 5-10. 5%，v/v，可在使用時添加或分裝前添加。
10. 制備權(quán)利要求1-9所述的囊胚培養(yǎng)液的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 基礎(chǔ)液的配制 a、 先按照比例稱量各組分，并分開放置； b、 先將除殺菌劑、選擇性添加指示劑、碳酸氫鈉、人血清白蛋白外的稱量好的組分溶于 稱量好的超純水中； c、 向步驟b所得溶液中加入稱量好的殺菌劑、選擇性添加指示劑和碳酸氫鈉； d、 將配置好的基礎(chǔ)液放置37°C、5. 5%的C02培養(yǎng)箱中平衡6-12小時； (2) 囊胚培養(yǎng)液的原液配制 a、 將囊胚培養(yǎng)液的基礎(chǔ)液在超凈工作臺下利用0. 2 μ m的濾膜過濾除菌，得到濾液A ; b、 在濾液A中加入人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得到囊胚培養(yǎng)液的原液；或者 省略該步驟，將濾液A作為囊胚培養(yǎng)液的原液，醫(yī)生使用時添加人血清白蛋白； (3) 囊胚培養(yǎng)液原液的處理 在無菌環(huán)境下對囊胚培養(yǎng)液原液進行分裝封口，得到囊胚培養(yǎng)液，將其放置冰箱或冷 庫內(nèi)保存； (4) 囊胚培養(yǎng)液的檢測 檢測項目是pH值、滲透壓、細胞毒性、皮內(nèi)刺激、致敏、無菌、熱原、細菌內(nèi)毒素、體外鼠 胚試驗來判斷囊胚培養(yǎng)液是否合格。
【文檔編號】C12N5/073GK104140949SQ201410388960
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】王維華, 呂汝舉, 劉美靜, 莊巍, 王英超 申請人:山東威高新生醫(yī)療器械有限公司