一種特異性結(jié)合甲胎蛋白核酸適配體的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用毛細(xì)管電泳技術(shù)篩選甲胎蛋白特異性核酸適配體的方法，包括以下步驟：設(shè)計(jì)并構(gòu)建隨機(jī)寡核苷酸文庫，聯(lián)合毛細(xì)管電泳技術(shù)與SELEX篩選方法，富集到能與甲胎蛋白結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)克隆、測序、毛細(xì)管電泳分析以及免疫熒光驗(yàn)證，最終獲得能與甲胎蛋白特異性結(jié)合的寡核苷酸，即適配體。本發(fā)明提供了一種高效、特異的適配體篩選方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：依賴于毛細(xì)管電泳技術(shù)的優(yōu)勢，縮短了篩選時(shí)間，僅用4輪循環(huán)即可完成；同時(shí)減少了由基質(zhì)作用引起的非特異性篩選。
【專利說明】一種特異性結(jié)合甲胎蛋白核酸適配體的篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是一種特異性結(jié)合甲胎蛋白核酸適配體的篩選方法。

【背景技術(shù)】
[0002]核酸適配體(aptamer)是一種通過結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別祀分子的單鏈寡核苷酸(ssDNA或RNA)。其作用原理與抗體相似，同時(shí)又具有無免疫原性、可化學(xué)合成、易改造、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷、新藥開發(fā)以及基礎(chǔ)研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]Aptamer篩選技術(shù)被命名為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，簡稱SELEX(Systematic evolut1n of ligand by exponential enrichment),是在 20 世紀(jì) 90 年代初發(fā)展起來的一種組合化學(xué)新技術(shù)。其基本思路是:體外構(gòu)建寡核苷酸文庫并與靶分子結(jié)合，通過特定的方法分離出與靶分子結(jié)合的核酸，借助PCR技術(shù)指數(shù)富集，經(jīng)過反復(fù)篩選與擴(kuò)增(一般為5-18個(gè)循環(huán))，最終獲得與靶分子高親和力、高特異性結(jié)合的aptamer。
[0004]SELEX篩選過程中的關(guān)鍵步驟是游離核酸與能同靶分子結(jié)合核酸的分離。靶分子的性質(zhì)不同，分離方法也相應(yīng)不同。經(jīng)過十幾年的研究，在結(jié)合了其它新技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了許多新的SELEX篩選方法，為高效獲得特異性aptamer提供了更多選擇。
[0005]甲胎蛋白(AF P)是肝腫瘤最常用的標(biāo)志物之一，其血清水平的升高通常預(yù)示著肝癌的發(fā)生。目前臨床和科研中對(duì)AFP定性和定量的檢測大都借助于抗體，靈敏度和特異性雖較高，但抗體存在著如成本高、具有免疫原性等缺點(diǎn)。Aptamer被稱為“人工替代抗體”，若能篩選到特異性結(jié)合AFP的aptamer并取代抗體,就可以降低成本，同時(shí)還可以解決抗體批間差異大、不易保存和運(yùn)輸?shù)葐栴}。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種特異性結(jié)合甲胎蛋白核酸適配體的篩選方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
所述的篩選方法包括以下步驟:設(shè)計(jì)并構(gòu)建大容量隨機(jī)寡核苷酸文庫以及用于PCR擴(kuò)增的上游引物和下游引物，通過以毛細(xì)管電泳為基礎(chǔ)的SELEX方法，富集能與AFP結(jié)合的寡核苷酸，最終經(jīng)克隆、測序以及驗(yàn)證后得到與AFP特異性結(jié)合的寡核苷酸，即aptamer。
[0008]所述的隨機(jī)寡核苷酸文庫以及上、下游引物序列為:
隨機(jī)寡核苷酸文庫的序列如SEQ ID N0.1所示；
上游引物的序列如SEQ ID N0.2所示；
下游引物的序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]隨機(jī)區(qū)域?yàn)?5個(gè)堿基的寡核苷酸文庫的容量理論上為435，構(gòu)象豐富，可以篩選出任何祀分子的aptamer。
[0010]所述的以毛細(xì)管電泳為基礎(chǔ)的SELEX方法包括以下步驟:隨機(jī)寡核苷酸文庫與AFP共同孵育，混合物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，寡核苷酸與AFP結(jié)合后所形成的復(fù)合物在毛細(xì)管柱中的遷移率不同于未與靶分子結(jié)合的寡核苷酸，因此與AFP特異性結(jié)合的寡核苷酸被分離出來，收集與AFP結(jié)合的寡核苷酸，常規(guī)PCR擴(kuò)增，制備單鏈DNA文庫，文庫純化后用于下一輪篩選。
[0011]所述常規(guī)PCR擴(kuò)增條件為:94°C, 3 min ；94 °C, 30 s，58 °C，30 s，72 °C，30 s，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)；72 °C, 5 min。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定應(yīng)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行優(yōu)化,選取條帶亮度和特異性好的循環(huán)數(shù)。
[0012]所述單鏈DNA文庫制備方法包括以下步驟:在鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠中加入常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，常溫孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與磁珠上的鏈霉親和素的相互作用將雙鏈DNA吸附到磁珠表面，洗滌磁珠后加入堿液，常溫變性，含有單鏈DNA的上清液用弱酸中和，產(chǎn)物PAGE切膠純化。
[0013]所述的SELEX篩選的次數(shù)為4次。
[0014]所述的磁珠與PCR產(chǎn)物的孵育時(shí)間控制在20-30 min，堿變性時(shí)間控制在5_10min。
[0015]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明提供的篩選方法依賴于毛細(xì)管電泳本身的高效性，由此每次分離都獲得了具有強(qiáng)相互作用的寡核苷酸；其次，由于靶目標(biāo)為自由態(tài)，不存在基質(zhì)的干擾，不必為由基質(zhì)引起的非特異作用而增加工作量。因此，常規(guī)篩選需要通過8~15次循環(huán)才能達(dá)到的選擇性，本發(fā)明經(jīng)過4次循環(huán)就可以實(shí)現(xiàn)，僅需2~4天即可完成。經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測和免疫熒光驗(yàn)證，篩選到的aptamer能與AFP特異性結(jié)合。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]附圖1是本發(fā)明實(shí)施例中毛細(xì)管電泳篩選AFP特異性aptamer的第一輪電泳圖
-1'TfeP曰。
[0017]附圖2是本發(fā)明實(shí)施例中毛細(xì)管電泳驗(yàn)證aptamer-273與AFP蛋白的結(jié)合能力及特異性的檢測結(jié)果。
[0018]附圖3是本發(fā)明實(shí)施例中免疫突光檢測aptamer-273、Ant1-AFP、aptamer-Library對(duì)人肝癌細(xì)胞H印G2以及aptamer-273、Ant1-AFP對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的結(jié)合能力及特異性的檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明，實(shí)施例中未詳細(xì)說明的操作步驟請(qǐng)參閱《分子克隆》及所用試劑的說明書。
[0020]實(shí)施例1核酸適配體的篩選
1.儀器與材料:p/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國Beckman-Coulter公司),配備二極管陣列(PDA)和激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測器；PVA涂層彈性石英毛細(xì)管柱全長40 cm，有效長度30 cm,內(nèi)徑 50 μ m,外徑 360 μ m。
[0021]2.電泳緩沖液配制:使用超純水配制30 mM NaH2PO3，用I M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5, 0.45 μ m濾膜過濾。
[0022]3.設(shè)計(jì)并合成全長75個(gè)堿基的隨機(jī)寡核苷酸文庫，序列如SEQ ID N0.1所示，5’ -GTGACGCTCCTAACGCTGAC-35N-CCTGTCCGTCCGAACCAATC-3’，其中兩端分別為 20 個(gè)堿基的固定序列，中間35個(gè)堿基為隨機(jī)序列。
[0023]4.合成用于PCR擴(kuò)增的上游引物和下游引物，序列為:
上游引物 5’-GTGACGCTCCTAACGCTGAC-3’ (SEQ ID N0.2),
下游引物 5’-B1tin-GATTGGTTCGGACGGACAGG-3’ (SEQ ID N0.3)。
[0024]5.寡核苷酸文庫和AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:使用超純水溶解寡核苷酸文庫，濃度為10 μ M ;使用PBS配制AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.1 mg/ml。
[0025]6.毛細(xì)管電泳分離條件:電泳緩沖液為30 mM NaH2PO3^pH 7.5 ;PVA涂層毛細(xì)管柱內(nèi)徑50 μπι,全長度40 cm,有效長度30 cm;分離電壓_8 kV,加壓34 mbar ;溫度25 V ;壓力34 mbar進(jìn)樣隨機(jī)寡核苷酸文庫與AFP混合物(體積比1:1) 10 s ;檢測波長256 nm。電泳結(jié)果如圖1所示，收集游離寡核苷酸峰后至蛋白峰間的結(jié)合寡核苷酸。
[0026]新毛細(xì)管在使用前需用超純水水化10 min。每次開機(jī)運(yùn)行前依次以超純水和電泳緩沖液依次沖洗5、10 min，每針樣品間分別用超純水和電泳緩沖液依次沖洗5、5 min。每進(jìn)樣3次更換I組電泳緩沖液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用超純水沖洗10 min，然后將毛細(xì)管兩端保存于超純水中。
[0027]7.常規(guī)PCR擴(kuò)增:取步驟6中收集到的與AFP結(jié)合的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94 °C, 3 min ；94 °C, 30 S，58 °C, 30 S，72 °C, 30 S，擴(kuò)增 10 個(gè)循環(huán)；72 °C，5 min。
[0028]8.制備單鏈DNA文庫:取100 μ I鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠置于磁力架上，吸去上清，用 500 μ I B&ff Buffer (5 mM Tris-HCl, pH 7.5,0.5 mM EDTA, I M NaCl)洗滌 2 次，去上清。將步驟7中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入磁珠中，常溫孵育20 min,通過雙鏈DNA上的生物素與磁珠上的鏈霉親和素的相互作用將雙鏈DNA吸附到磁珠表面。用500 μ I B&ffBuffer洗滌磁珠3次，去上清。加入150 mM NaOH溶液100 μ 1，常溫變性5 min,收集上清。上清用150 mM HAc溶液中和，中和產(chǎn)物PAGE切膠純化，純化產(chǎn)物用于下一輪篩選。
[0029]9.根據(jù)步驟6、7、8循環(huán)4次，富集能與AFP特異性結(jié)合的寡核苷酸。
[0030]實(shí)施例2核酸適配體的克隆與測序
在微量離心管中配制下列溶液，全量為5 μ I:pMD19-T Vector I μ 1，寡核苷酸PCR產(chǎn)物 0.2 pmol，ddH20 補(bǔ)充至 5 μ I。加入 5 μ I 的 Solut1n I。16 °C 反應(yīng) 30 min。全量(10 μ I)加入至100 μ I Trans5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30 min。42 °C加熱45 s后，再在冰中放置I min。加入890 μ I LB培養(yǎng)基，37 1:振蕩培養(yǎng)60 min。在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37 °C培養(yǎng)，形成單菌落。挑選白色單克隆菌落至2 mlLBCAmp 80 μ g/ml)液體培養(yǎng)基中，200 rpm、37 °〇振蕩培養(yǎng)16 h，菌液交由上海生工測序。
[0031]實(shí)施例3核酸適配體的驗(yàn)證
測序得到83條寡核苷酸序列。對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行整理和結(jié)構(gòu)預(yù)測，選出14條結(jié)構(gòu)具有代表性的序列進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，從中挑選出I條特異性高的序列aptamer-273。
[0032]Aptamer-273 的序列如 SEQ ID N0.4 所不。
[0033]考察1:毛細(xì)管電泳檢測本實(shí)施例中熒光標(biāo)記aptamer-273與AFP蛋白的結(jié)合特異性。
[0034]電泳緩沖液為30 mM NaH2PO3^ pH 7.5，AFP 濃度為 0.1 mg/ml, aptamer 濃度為 10μ M。PVA涂層毛細(xì)管柱內(nèi)徑50 μ m，全長度40 cm，有效長度30 cm;分離電壓_8 kV，加壓34 mbar ;溫度25 V ;壓力34 mbar進(jìn)樣熒光(FAM)標(biāo)記的aptamer-273與AFP混合物(20:1)10 s;LIF檢測器488 nm激發(fā)，520 nm發(fā)射。檢測到AFP蛋白出峰時(shí)間處AFP特異性aptamer產(chǎn)生的信號(hào)峰。峰面積大于10倍性噪比，即認(rèn)定為特異性結(jié)合峰。采用不加入AFP蛋白的FAM標(biāo)記的aptamer-273作為陰性對(duì)照。檢測結(jié)果如圖2顯示:本實(shí)施例的適配體aptamer-273能與AFP特異性結(jié)合,在AFP極端稀釋的情況下仍具有極強(qiáng)的檢測定量能力，能有效檢測到極低濃度的AFP蛋白。
[0035]考察2:免疫熒光檢測本實(shí)施例中熒光標(biāo)記aptamer-273與H印G2細(xì)胞的結(jié)合能力及特異性。
[0036]在玻底皿中分別培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞!fepG2和人肺癌細(xì)胞A549(陰性對(duì)照)，4%多聚甲醛室溫固定 30 min，PBS 洗 3 次，5 % BSA 封閉 30 min,與 500 nM FAM 標(biāo)記的 aptamer-273(Library)室溫孵育60 min (aptamer用I % BSA稀釋)，PBS洗3次，DAPI染色細(xì)胞核30 s，PBS洗3次，觀察綠色熒光信號(hào)及其定位。檢測的同時(shí)以抗AFP抗體作為陽性對(duì)照，比較aptamer與抗體識(shí)別AFP能力的差異。檢測結(jié)果如圖3所示:本實(shí)施例的適配體aptamer-273能夠識(shí)別人肝癌細(xì)胞H印G2中表達(dá)的AFP，而對(duì)無AFP表達(dá)的人肺癌細(xì)胞A549沒有信號(hào)顯不；同時(shí)，未經(jīng)篩選的aptamer-Library在HepG2細(xì)胞中也沒有信號(hào)顯不,表明篩選到的aptamer-273具有特異性；與抗體相比，分子量小的aptamer-273更容易進(jìn)入細(xì)胞，綠色熒光信號(hào)更強(qiáng)。
[0037]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種特異性結(jié)合甲胎蛋白核酸適配體的篩選方法，其特征在于，所述的篩選方法包括以下步驟:設(shè)計(jì)并構(gòu)建大容量隨機(jī)寡核苷酸文庫以及用于PCR擴(kuò)增的上游引物和下游引物，通過以毛細(xì)管電泳為基礎(chǔ)的SELEX方法，富集能與甲胎蛋白結(jié)合的寡核苷酸，最終經(jīng)克隆、測序以及驗(yàn)證后得到與甲胎蛋白特異性結(jié)合的寡核苷酸，即適配體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的隨機(jī)寡核苷酸文庫以及上、下游引物序列為: 核苷酸文庫的序列如SEQ ID N0.1所示； 物的序列如SEQ ID N0.2所示； 物的序列如SEQ ID N0.3所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的以毛細(xì)管電泳為基礎(chǔ)的SELEX方法包括以下步驟:隨機(jī)寡核苷酸文庫與甲胎蛋白共同孵育，混合物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，收集與甲胎蛋白結(jié)合的寡核苷酸，常規(guī)PCR擴(kuò)增，制備單鏈DNA文庫，文庫純化后用于下一輪篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述常規(guī)PCR條件為:94°C, 3 min ；94°C, 30 S，58 °C, 30 S，72 °C, 30 S，擴(kuò)增 10 個(gè)循環(huán)；72 °C，5 min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述單鏈DNA文庫制備方法包括以下步驟:在鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠中加入常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，常溫孵育，通過雙鏈DNA上的生物素與磁珠上的鏈霉親和素的相互作用將雙鏈DNA吸附到磁珠表面，洗滌磁珠后加入堿液，常溫變性，含有單鏈DNA的上清液用弱酸中和，產(chǎn)物PAGE切膠純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的SELEX篩選的次數(shù)為4次。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的磁珠與PCR產(chǎn)物的孵育時(shí)間控制在20-30 min，堿變性時(shí)間控制在5-10 min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104131105SQ201410390057
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】吳偉忠, 胡洪衛(wèi), 郭瑋, 冬黎黎, 談綺文 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院, 上海艾津生物醫(yī)藥科技有限公司