純化多肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及改善的通過相對于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一種或更多雜質(zhì)的量，增加結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的量來純化目的多肽的方法。此效應通過在通過由于相反于離子交換基質(zhì)的電荷的電荷而也結(jié)合于離子交換基質(zhì)的方法中添加化合物來達到，減少雜質(zhì)的結(jié)合多于目的多肽的結(jié)合。
【專利說明】純化多肽的方法
[0001] 本申請是申請日為2010年12月15日、申請?zhí)枮?01080057393. X、發(fā)明名稱為"純 化多肽的方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0002] 本發(fā)明涉及改善的通過相對于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一種或更多雜質(zhì)的量，增加 結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的量來純化目的多肽的方法。此效應通過在方法中添加化 合物來達到，其通過也結(jié)合于離子交換基質(zhì)減少雜質(zhì)的結(jié)合多于目的多肽的結(jié)合。 【【背景技術(shù)】】
[0003] 多肽的大規(guī)模，經(jīng)濟純化是對于生物技術(shù)工業(yè)越來越重要問題。多肽通過使用加 工成通過插入含有該多肽的基因的重組質(zhì)粒來產(chǎn)生目的多肽的哺乳動物或細菌細胞系進 行細胞培養(yǎng)來產(chǎn)生。由于使用的細胞系是活體，常常給它們供應含有糖，氨基酸和生長因子 的復合生長培養(yǎng)基，在一些情況中，也供給自動物血清的制備物。自飼喂給細胞的化合物的 混合物及自細胞本身的副產(chǎn)物分離期望的目的多肽到對于用作人治療劑足夠的純度是棘 手的挑戰(zhàn)。
[0004] 重組體治療性多肽通常在幾種哺乳動物宿主細胞系（包括中國倉鼠卵巢（CH0)細 胞，幼倉鼠腎（BHK)細胞，人胚胎腎（HEK)細胞，鼠骨髓瘤NS0細胞），酵母細胞和細菌細胞 (諸如E.coli)和昆蟲細胞中產(chǎn)生。各細胞系在由細胞產(chǎn)生的多肽的產(chǎn)率和特征上具有優(yōu) 勢和缺點。商業(yè)產(chǎn)生細胞系的選擇常常平衡對具有遞送給定產(chǎn)物需要的產(chǎn)物質(zhì)量屬性的能 力的高產(chǎn)率的需求。發(fā)酵和細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展大大增加了培養(yǎng)液中靶多肽的濃度。此上 游效率的增加導致了細胞-收獲階段下游處理的瓶頸。細胞收獲，或收獲的細胞培養(yǎng)液的 澄清，是幾乎全部基于生物技術(shù)的產(chǎn)物的下游純化中的重要過程。
[0005] -旦多肽以期望的水平表達，從宿主細胞移出多肽及收獲。懸浮的粒子，諸如細 胞，細胞碎片，脂質(zhì)和其他不溶性物質(zhì)一般通過過濾或離心自含有多肽的流體移出，產(chǎn)生 在溶液中含有目的多肽以及其他可溶性雜質(zhì)的澄清的流體。自細胞碎片純化多肽的方法起 初依賴于多肽表達的位點。導致一些多肽直接從細胞分泌到周圍生長培養(yǎng)基；其他在細胞 內(nèi)制造。對于后者多肽，純化過程的第1步驟涉及細胞的裂解，其可通過各種方法，包括機 械剪切力，滲透休克或酶促處理進行。該分裂將細胞的整個內(nèi)容物釋放為勻漿物，且此外產(chǎn) 生由于它們的小尺寸而難以去除的亞細胞碎片。這些通常通過離心或通過過濾去除。盡管 更小規(guī)模，但伴隨由于多肽產(chǎn)生過程中細胞的天然的死亡和細胞內(nèi)宿主細胞多肽的釋放的 直接分泌的多肽，出現(xiàn)相同的問題。
[0006] 包括宿主細胞多肽，產(chǎn)物變體，宿主細胞DNA，小分子，方法相關(guān)的混雜物，內(nèi)毒素， 朊病毒和病毒粒子的雜質(zhì)必需去除。使用的純化技術(shù)必需是可縮放，有效，成本-有效，可 靠及符合最終產(chǎn)物的嚴格純度需求。當前純化技術(shù)一般涉及多層析分離。典型過程可包括 全部或至少一些以下步驟：沉淀，透析，電泳，超濾，親和層析，陽離子交換層析，陰離子交換 層析和疏水相互作用層析。常規(guī)柱層析步驟是有效和可靠的，但通常具有低產(chǎn)物通量。
[0007] -旦獲得含有目的多肽的溶液，通常使用不同層析技術(shù)的組合嘗試其從由細胞產(chǎn) 生的其他多肽的分離。在一些情況中，從雜質(zhì)分離期望的多肽，其中雜質(zhì)特別粘附于柱，而 目的多肽不，即，目的多肽存在于〃流通"中（"陰性-模式"層析）。
[0008] 層析技術(shù)開發(fā)多肽的化學和物理性質(zhì)以達到高程度的純化。這些化學和物理 性質(zhì)一般包括尺寸，等電點，電荷分布，疏水位點和對配體的親和性（Janson, J. C. and L. Ryden(eds. ). (1989)Polypeptide Purification:Principles, High Resolution Methods and Applications. VCH Publishers, Inc·, New York)。層析的各種分離模式包括：離子交 換，層析聚焦，凝膠過濾（大小排阻），疏水相互作用，反相和親和層析。離子-交換層析 (IEX)，包括陰離子-交換層析（AEX)和陽離子-交換層析（CEX)，通過它們的凈表面電荷的 差異的分離分析物（例如多肽）。IEX是從細胞碎片和其他雜質(zhì)分離表達的多肽的主要工 具。今天，IEX是純化多肽，肽，核酸和其他帶電的生物分子最常使用的技術(shù)之一，提供高分 辨率和具有高裝載容量的組分離。技術(shù)能分離它們的電性具有僅少數(shù)差異的分子物質(zhì)，例 如一個帶電的氨基酸不同的2種多肽。這些特征使得IEX良好適合于自微量純化和分析使 用純化流程和技術(shù)中的捕獲，中間純化或拋光步驟，至幾 kg產(chǎn)物的純化。
[0009] IEX，根據(jù)可交換的對離子命名，是可應用于可離子化的分子的純化的過程。離子 化的分子基于它們的帶電基團與附接于固相支持基質(zhì)的帶反電荷的分子的非特異性靜電 相互作用來分離，由此延緩與固相更強烈相互作用的那些離子化的分子。各類型的離子化 的分子的凈電荷，及其對基質(zhì)的親和性，根據(jù)帶電基團數(shù)，各基團的電荷，及與帶電的固相 基質(zhì)相互作用的分子競爭的性質(zhì)而改變。這些差異導致通過IEX的各種分子類型的分辨 率。在使用IEX的典型多肽純化中，將源于宿主細胞的許多多肽的混合物，諸如在哺乳動物 細胞培養(yǎng)中，應用于離子交換柱。在洗滌出非-結(jié)合分子之后，諸如通過以逐步或梯度-模 式改變PH，對離子濃度等來調(diào)整條件，以從固相釋放非-特別保留的或延緩的離子化的目 的多肽及從具有不同電荷特征的多肽將其分離。AEX涉及在特定分離過程的pH及條件下陰 離子目的分子與用于與附接于固相基質(zhì)的帶正電的分子相互作用的陰離子的競爭。相反， CEX涉及在特定分離過程的pH及條件下，陽離子目的分子與用于附接于固相基質(zhì)的帶負電 的分子的陽離子的競爭?；旌系哪Ｊ诫x子交換層析涉及在相同的步驟中離子交換層析和疏 水相互作用層析介質(zhì)的組合的使用。尤其是，〃混合的-模式〃指稱共價附接有疏水相互 作用的混合物及陽離子交換或陰離子交換部分的固相支持基質(zhì)。
[0010] 維生素 K-依賴性多肽通過共享分子的氨基末端部分的共同結(jié)構(gòu)特征區(qū)別于其他 多肽。這些多肽的N-端部分，也稱之為Gla-結(jié)構(gòu)域，富含罕見的氨基酸，γ -羧基谷氨酸， 其在由酶谷氨酰羧基化酶催化的維生素 K-依賴性反應中由谷氨酸合成。因為存在約 2?12個Gla殘基，Gla-結(jié)構(gòu)域特征在于能結(jié)合二價陽離子諸如Ca2+。結(jié)合金屬離子之 后，這些多肽經(jīng)歷通過幾種技術(shù)諸如圓二色性和熒光發(fā)射可測量的構(gòu)象變化。在1980年 代，使用含有Gla的多肽的獨特性質(zhì)經(jīng)歷金屬誘導的構(gòu)象變化，開發(fā)了構(gòu)象特定假親和性 層析。假親和性層析不同于常規(guī)親和層析在于，無固定的親和性配體涉及，且其在常規(guī)層析 基質(zhì)上進行（Yan S. B.，J. Mol. Recog. 1996 ;9, 211-218)。Gla多肽可通過消除二價金屬離 子吸附于陰離子交換物質(zhì)。隨后，通過添加 Ca2+到洗脫緩沖劑來進行洗脫。
[0011] 在1986年，Bjoern和Thim報道了在利用因子VII的Gla-結(jié)構(gòu)域的Ca2+-結(jié) 合性質(zhì)的陰離子交換材料上的重組因子VII的純化（Bjoern S.及Thim L.，Research Dislosure，1986, 26960-26962.)。吸附在無 Ca2+的緩沖劑中實現(xiàn)，及因子VII的洗脫在使 用具有低離子強度的含有Ca2+的緩沖劑及在弱條件下是可能的。Yan等人使用了純化重組 人多膚 C 的相同的原理（Yan S. B.等人，Bio/technology. 1990 ;8, 655-661)。
[0012] 有GLA-結(jié)構(gòu)域的多肽包括，但不限于，以下多肽：GAS-6,多肽S，因子II (凝血酶 原），凝血酶，因子X/Xa，因子IX/IXa，多肽C，因子VII/VIIa，多肽Z，跨膜γ -羧基谷氨酸 多肽1，跨膜羧基谷氨酸多肽2,跨膜γ羧基谷氨酸多肽3,跨膜γ-羧基谷氨酸多肽 4,基質(zhì)Gla多膚，及骨|丐素。
[0013] 在本領(lǐng)域中，已描述了從目的多肽減少雜質(zhì)的幾個嘗試。
[0014] W0 2009/082443涉及聚合物，諸如在含有未澄清的生物物質(zhì)的流體和使用該物質(zhì) 而無需之前澄清而從該流純化一種或更多期望的生物分子的方法中能不可逆地結(jié)合于不 溶性粒子和可溶性雜質(zhì)的子集，且也能可逆地結(jié)合于一種或更多期望的生物分子的可溶性 聚合物。
[0015] 僅當沉淀出溶液時，聚合物能在未澄清的細胞肉湯中的流內(nèi)可逆地結(jié)合于一種或 更多期望的生物分子（多肽，多肽，等）?？扇缓髲牧鞒コ恋砦?，諸如通過從流的殘留物 過濾出，及回收期望的生物分子，諸如通過從沉淀物選擇性洗脫。然后去除流的混合物的大 多數(shù)雜質(zhì)，諸如細胞培養(yǎng)基，抗泡沫物質(zhì)，添加劑和可溶性組分。
[0016] W0 2008/122089公開了混雜多肽的優(yōu)先沉淀，包括宿主多肽及切割的融合偶體， 使重組多肽留在溶液中用于隨后回收。由此使包含目的肽和可溶性混雜多肽的溶液經(jīng)歷導 致混雜多肽（例如宿主細胞多肽，切割的多肽融合偶體和肽性切割劑諸如蛋白酶）的優(yōu)先 沉淀的條件。然后可從含有目的肽的溶液分離沉淀物，其然后可從該溶液通過適合的技術(shù) 諸如冷凍干燥等回收。
[0017] W0 2008/091740提供與通過用聚電解質(zhì)，諸如多聚陰離子聚電解質(zhì)或用聚陽離子 聚電解質(zhì)沉淀多肽來分離和純化源于細胞培養(yǎng)液多肽的相關(guān)的方法。沉淀步驟可之后是陽 離子交換層析，陰離子交換層析，及其他沉淀步驟。
[0018] W0 2008/031020涉及通過使裝載液通過結(jié)合產(chǎn)物的培養(yǎng)基，之后是使用洗脫溶液 使含有精氨酸或精氨酸衍生的至少一種洗滌溶液通過培養(yǎng)基從含有產(chǎn)物，諸如抗體，及一 種或更多雜質(zhì)的裝載液分離產(chǎn)物，及收集產(chǎn)物的方法。
[0019] W0 2007/117490涉及自包含抗體和至少一種HCP的混合物產(chǎn)生宿主細胞多 肽-(HCP)減少的抗體制備物的方法，包括離子交換分離步驟，其中通過應用多于30g的抗 體/1的基質(zhì)使混合物經(jīng)歷第1離子交換材料。
[0020] W0 2007/108955涉及通過使用不包括親和層析步驟或過程中緩沖劑交換步驟 (例如，TFF或HPTFF)的2-步驟純化過程，從含有混雜物諸如宿主細胞多肽和介質(zhì)組分的 混雜的混合物純化多肽和多肽，尤其是重組多肽諸如單克隆抗體。而且，自第1步驟到第2 步驟必需僅pH操作和/或稀釋。
[0021] W0 2007/071768涉及自組合物純化多肽的方法，方法包括將所述組合物的溶液裝 載到逆相液相層析柱，及用含有緩沖劑和鹽的溶劑從柱洗脫所述多肽，其中所述鹽在使用 的緩沖劑的pH不具有緩沖能力。方法還提供以工業(yè)規(guī)模純化多肽的輕度方式，即方法，其 中裝載的多肽的實質(zhì)量維持操作條件，及保留其生物活性。
[0022] W0 2006/110277涉及通過使用不包括親和層析步驟或過程中緩沖劑交換步驟 (例如，TFF或HPTFF)的2-步驟純化過程，自至少一種混雜物諸如宿主細胞多肽和其他物 質(zhì)諸如介質(zhì)組分純化目的分子。而且，是自第1步驟?第2步驟必需僅pH操作。HCP CHOP 水平減少到小于20ppm。
[0023] W0 2006/067230涉及減少或甚至消除在包含維生素 K-依賴性目的多肽的組合物 中的多肽混雜物的含量的各種方法。在優(yōu)選的實施方式中，去除來源于宿主細胞的蛋白S。
[0024] W0 2003/102132涉及非-親和性層析純化過程與高-性能切向流過濾（HPTFF)的 組合能從含有宿主細胞多肽的混合物純化靶多肽，諸如抗體或抗體-樣分子，使得宿主細 胞多肽雜質(zhì)以小于百萬分之（ppm) 100的量存在于最終純化的靶多肽中。
[0025] 根據(jù)發(fā)明人的知識，現(xiàn)有技術(shù)中尚未描述在IEX中使用具有與選擇的離子交換基 質(zhì)相反的多個電荷的化合物減少雜質(zhì)如宿主細胞蛋白，宿主細胞核酸，內(nèi)毒素，病毒而純化 目的多肽。
[0026] AEX已描述自重組體治療性蛋白減少內(nèi)毒素的方法（Chen等人，2009, Protein Expression and Purification, pp 76-81)，但未提及使用帶正電的化合物來增強內(nèi)毒素的 減小。
[0027] 已顯示當以2mM的濃度應用EGTA時，其結(jié)合于陰離子交換樹脂（Yingst et al, 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1189, ppll3_118)〇
[0028] EDTA已以ImM和lOmM之間的濃度使用而作為抑制蛋白酶的手段（Charlton A, Methods in Molecular Biology, vol. 241Affinity Chromatography:Methods and Protocols, Second Edition, Humana Press, pp 211-227)，而以 lOmM 的濃度用于溶解細菌 包含體（Ledung et al·，2009, J. Biotechnology, 141，pp 64-72)，并減少目的多肽的聚集。
[0029] 在IEX中在陰離子交換Mono-Q柱中純化血小板反應蛋白中以ImM的濃度 使用EDTA，發(fā)現(xiàn)無層析譜的變化，或在Zhu中未給理由以5mM濃度使用EDTA(Zhu et al. , 2009, Process Biochemistry 44pp 875-879), Chen(Chen et al. 2009, J. Chromatorgr. 1216, pp 4877-4886)推薦使用ImM EDTA用于陰離子交換材料上細菌性表 達的目的多肽的再折疊。Haganika(Haganika et al·, 2001, J. Chromatography B, 751, pp 161-167)自陰離子交換基質(zhì)在洗脫緩沖劑中使用ImM的EDTA,也未合理解釋這么做的 原因 。Pittalis 等人（Pittalis et al·, 1992, J. Chromatography, 573pp 29-34)使 用1.25mM EDTA濃度來平衡陰離子交換基質(zhì)。||聶|^1^|1|([以1：^丨.^.11，1991，工 Chromatography, 587, pp 109-115)使用陰離子交換基質(zhì)Mono-Q的硫氧還蛋白純化中使用 2mM 的 EDTA。Basta(Basta et al·，1991，J. Immunological Methods, 142, pp39_44)使用含 有6. 5mM EDTA的緩沖劑用于自Mono-Q柱洗脫補體蛋白。
[0030] 無以上使用提及對基于離子交換的目的多肽純化性能的正面效應。
[0031] 自 Nielsen et al 的文章 （Nielsen et al·，1985, Veterinary Immunology and Immunopathology，9，pp 349-359)提及添加 ImM EDTA在一些基質(zhì)（但并非所有）上改善 IgGl，IgG2, IgM和白蛋白之間的分離的有益效應。作者推薦EDTA防止蛋白結(jié)合的作用，由 此改善柱配體結(jié)合。
[0032] 由此總結(jié)本發(fā)明的發(fā)明人的最佳知識，至今在IEX中使用的除了目的多肽之外最 高水平的多電荷化合物是AEX中6. 5mM EDTA。
[0033] 【發(fā)明概述】
[0034] 本發(fā)明涉及改善的通過相對于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一種或更多雜質(zhì)的量，增加 結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的量的自復雜混合物純化目的多肽的方法。此效應通過在 方法中添加化合物來達到，其通過也結(jié)合于離子交換基質(zhì)減少雜質(zhì)的結(jié)合多于目的多肽的 結(jié)合。以上復雜混合物可來自重組產(chǎn)生方案或是例如人或動物體液，優(yōu)選血或血漿溶液。
[0035] 本發(fā)明的一實施方式是使用化合物減少IEX中目的多肽中的雜質(zhì)，其中在選擇的 純化條件，化合物由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)，由此通 過減少結(jié)合于離子交換基質(zhì)的雜質(zhì)量多于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的量來增加目 的多肽的結(jié)合特異性。
[0036] 在一實施方式中，化合物帶負電，而在選擇的純化條件，離子交換基質(zhì)是陰離子交 換基質(zhì)。在另一實施方式中，化合物帶正電，而離子交換基質(zhì)是陽離子交換基質(zhì)。
[0037] 在再一實施方式中，本發(fā)明涉及純化方法，其中化合物減少IEX中目的多肽中的 雜質(zhì)，其中在選擇的純化條件化合物由于相反于離子交換基質(zhì)的電荷的電荷而結(jié)合于離子 交換基質(zhì)，由此通過減少結(jié)合于離子交換基質(zhì)的雜質(zhì)量多于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多 肽的量來增加目的多肽的結(jié)合特異性，且其中化合物以至少7mM的濃度使用。在一實施方 式中，在所述方法中使用的化合物帶負電，而在選擇的純化條件，離子交換基質(zhì)是陰離子交 換基質(zhì)。在優(yōu)選的實施方式中，化合物是EDTA或EGTA。
[0038] 【發(fā)明詳述】
[0039] 現(xiàn)在會參照本發(fā)明的特定實施方式的細節(jié)。而會關(guān)聯(lián)于編號的實施方式描述本發(fā) 明，會明白，它們不旨在限制本發(fā)明到那些實施方式。相反，本發(fā)明旨在覆蓋可包括在由權(quán) 利要求定義的本發(fā)明的范圍之內(nèi)的全部替代體，修飾和相當體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識類 似或相當于本文所述的那些的可在本發(fā)明的實踐中使用的許多方法和材料。本發(fā)明不以任 何方式限于描述的方法和材料。
[0040] 除非另外定義，本文所用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具有與本領(lǐng)域（例如在細胞生物 學，化學和分子生物學）普通技術(shù)人員通常明白的相同的含義。
[0041] 貫穿此說明書詞匯〃包含（comprise) 〃，或變異諸如〃包含（comprises) 〃或〃包 含（comprising) 〃，會理解為暗示包括陳述的元件，整體或步驟,或元件，整體或步驟的組， 但不排除任何其他元件、整體或步驟，或元件，整體或步驟的組。
[0042] 貫穿此說明書，參照數(shù)值，除非另外陳述，需考慮〃約〃的數(shù)值。術(shù)語〃約〃用于 指示，值包括用于測定值的裝置和方法的誤差的固有變異，或研究客體之中存在的變異。
[0043] 溫度值是在標準壓力條件（latm)下給出的。
[0044] 本發(fā)明基于驚人發(fā)現(xiàn)，在IEX期間，可將化合物加入平衡液和/或樣品液和/或洗 滌液，其和目的多肽與離子交換基質(zhì)的結(jié)合及雜質(zhì)與離子交換基質(zhì)的結(jié)合競爭。意外地發(fā) 現(xiàn)，由此在IEX期間，更少雜質(zhì)結(jié)合于離子交換基質(zhì)，且與基質(zhì)結(jié)合的目的多肽和一種或更 多雜質(zhì)的比增加，由此也在洗脫液中，目的多肽與一種或更多雜質(zhì)的比增加。
[0045] 在一實施方式中，本發(fā)明涉及通過離子-交換層析純化目的多肽的方法，其中將 化合物以至少7mM的濃度加入：
[0046] (a)離子交換基質(zhì)的平衡液，其中調(diào)整平衡液，使得平衡液中的至少部分化合物由 于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)；
[0047] 和 / 或
[0048] (b)應用于離子交換基質(zhì)、且包含目的多肽的裝載液，其中調(diào)整裝載液，使得裝載 液中的至少部分化合物和至少部分目的多肽由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié) 合于離子交換基質(zhì)；
[0049] 和 / 或
[0050] (c) -旦目的多肽由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而已結(jié)合于離子交換基 質(zhì)時，用于洗滌離子交換基質(zhì)的洗滌液，其中調(diào)整洗滌液，使得洗滌液中的至少部分化合物 由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)，且使得至少部分目的多肽 和至少部分已結(jié)合的化合物，如果是在步驟（a)或（b)添加的，由于與離子交換基質(zhì)的電荷 相反的電荷而繼續(xù)結(jié)合于離子交換基質(zhì)，
[0051] 由此在洗脫離子交換基質(zhì)之前，相對于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一種或更多雜質(zhì)的 量，增加結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的量，且由此導致相比以7mM以下的濃度添加化 合物的同一方法，洗出液中增加的目的多肽與一種或更多雜質(zhì)的比。
[0052] 優(yōu)選的化合物濃度是至少7mM或至少10mM，或至少15mM，或至少20mM或至少25mM 或至少30mM或至少32mM或至少40mM或至少50mM。
[0053] 在一實施方式中，離子交換基質(zhì)是陰離子交換基質(zhì)。
[0054] 在一實施方式中，離子交換基質(zhì)是陽離子交換基質(zhì)。
[0055] 在優(yōu)選的實施方式中，化合物上的負電荷或正電荷聚集。
[0056] 在本發(fā)明的更多優(yōu)選的實施方式中，帶負電荷的化合物具有結(jié)合金屬陽離子的能 力，且甚至更優(yōu)選是包含五-乙酸基和它們的各種鹽的化合物或包含四-乙酸基和它們的 各種鹽的化合物或包含三-乙酸基和它們的各種鹽的化合物或包含二-乙酸基和它們的各 種鹽的化合物或包含多個胺基和它們的各種鹽的化合物或包含多個氫硫基和它們的各種 鹽的化合物或膦酸和其衍生物及它們的各種鹽。
[0057] 本發(fā)明的方法減少雜質(zhì)，其中雜質(zhì)包含宿主細胞蛋白和/或宿主細胞核酸和/或 產(chǎn)物-相關(guān)的混雜物和/或病毒和/或朊病毒和/或內(nèi)毒素和/或方法-相關(guān)的混雜物。
[0058] 在本發(fā)明的另一實施方式中，目的多肽在IEX期間具有聚集的電荷。在優(yōu)選的實 施方式中，目的多肽能結(jié)合金屬離子。在本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的實施方式中，目的多肽是維 生素 K-依賴性多肽。
[0059] 本發(fā)明也涉及化合物用于減少通過離子-交換層析的目的多肽純化中的雜質(zhì)的 用途，其中將化合物添加于：
[0060] (a)離子交換基質(zhì)的平衡液，其中調(diào)整平衡液，使得平衡液中的至少部分化合物由 于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)；
[0061] 和/或
[0062] (b)應用于離子交換基質(zhì)、且包含目的多肽的裝載液，其中調(diào)整裝載液，使得裝載 液中的至少部分化合物和至少部分目的多肽由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié) 合于離子交換基質(zhì)；
[0063] 和 / 或
[0064] (c) 一旦目的多肽由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而已結(jié)合于離子交換 基質(zhì)時，用于洗滌離子交換基質(zhì)的洗滌液，其中調(diào)整洗滌液，使得洗滌液中的至少部分化合 物由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)，且使得至少部分目的多 肽和至少部分已結(jié)合的化合物，如果是在步驟（a)或（b)添加的，繼續(xù)結(jié)合于離子交換基 質(zhì)，
[0065] 由此在洗脫離子交換基質(zhì)之前，相對于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一種或更多雜質(zhì)的 量，增加結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的量，由此相比不添加化合物而進行目的多肽的 純化，導致洗出液中增加的目的多肽與一種或更多雜質(zhì)的比。
[0066] 本文所用的術(shù)語〃多肽〃是指由通過肽鍵連接在一起的5個或更多氨基酸組成的 聚合物。
[0067] 本文所述的術(shù)語〃重組多肽〃指稱通過重組方法產(chǎn)生的多肽。
[0068] 本文所用的術(shù)語〃氨基酸〃包括天然的和非-天然存在的氨基酸，后者通常能在 重組多肽合成期間摻入或由翻譯后修飾得到。
[0069] 術(shù)語〃純化的〃或〃分離物〃是指，目的多肽已從其天然的環(huán)境或宿主除去，及關(guān) 聯(lián)的雜質(zhì)減少或去除，使得目標分子是存在的主要物質(zhì)（例如，基于摩爾，在組合物/溶液 中其相比任何其他個體物質(zhì)更豐富）。一般而言，包含純化的重組目的多肽的組合物是這樣 的組合物，其中目的肽代表存在的全部大分子物質(zhì)的至少30% w/w，優(yōu)選至少50,60, 70或 75% w/w?；旧霞兊慕M合物會包含多于80?90% w/w的目的重組肽。
[0070] 〃目的多肽〃在本發(fā)明的意義中指稱期望根據(jù)本發(fā)明的方法從混合物純化的多 肽。通常，該目的多肽可為商業(yè)上售的及需要特定程度的純度。優(yōu)選的類型的目的多肽是治 療性多肽，其可為，例如，分泌的多肽。治療性多肽包括抗體，抗體的抗原-結(jié)合片段，可溶 性受體，受體融合體，細胞因子，生長因子，酶或凝血因子，其中一些更詳細描述于下文。優(yōu) 選的目的多肽是維生素 K-依賴性多肽。以上多肽列表僅旨在例示，及未旨在限制性描述。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會明白，可根據(jù)本發(fā)明使用任何多肽，且能選擇待根據(jù)需要產(chǎn)生的特 定多肽。
[0071] 術(shù)語〃層析〃指稱在混合物中的目的多肽通過經(jīng)過吸附劑的混合物滲濾從在混合 物中的其他溶質(zhì)分離的過程，所述吸附劑在過程的特定緩沖條件下，由于溶質(zhì)性質(zhì)更或欠 強烈吸附或保留溶質(zhì)，諸如pi，疏水性，尺寸和結(jié)構(gòu)。術(shù)語"層析"的使用包括柱和膜類型。
[0072] 術(shù)語〃離子交換〃和〃離子-交換層析（IEX) 〃指稱層析過程，其中可離子化的目 的溶質(zhì)（例如，混合物中的目的多肽）與連接（例如，通過共價連接）到固相離子交換材 料的帶反電荷的配體，在適當?shù)膒H和導電率條件下相互作用，使得目的溶質(zhì)與大或小于混 合物中的溶質(zhì)雜質(zhì)或混雜物的帶電的化合物非特異性相互作用。在混合物中的混雜溶質(zhì)可 相比目的溶質(zhì)更快或更慢自離子交換材料柱洗滌或結(jié)合到基質(zhì)或自基質(zhì)排除。"離子-交 換層析"特別包括陰離子-交換層析（AEX)，陽離子交換層析（CEX)，及混合的模式層析，其 中混合的模式的部分是AEX或CEX。
[0073] 短語"離子交換材料"或"離子交換基質(zhì)"指稱帶負電的（即陽離子交換基質(zhì)） 或帶正電的（即陰離子交換基質(zhì)）的固相。在一實施方式中，電荷可通過將一種或更多帶 電的配體（或吸附劑），例如通過共價連接附接到固相來提供?；蛘?，或此外，電荷可為固相 的固有性質(zhì)（例如作為氧化硅的情況，其具有總體負電荷）。許多離子交換基質(zhì)的電荷是 pH依賴性的，而本領(lǐng)域技術(shù)人員可調(diào)整純化過程，使得相應離子交換基質(zhì)負荷。
[0074] 在本發(fā)明中使用的〃緩沖劑〃是通過通過其酸-堿綴合組分的作用添加酸或堿來 抵抗pH變化的溶液。在本發(fā)明的方法中采用的各種緩沖劑可依賴于期望的緩沖劑pH和純 化方法中的特定步驟[見 Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D.，ed. Calbiochem Corporation (1975)]?？捎糜诳刂?本發(fā)明的方法期望的pH范圍的緩沖劑組分的非限制性例包括乙酸鹽，檸檬酸鹽，組氨酸， 磷酸鹽，銨緩沖劑諸如乙酸銨，琥珀酸鹽，MES，CHAPS，MOPS，MOPSO, HEPES，Tris，等，以及這 些的組合。TRIS-蘋果酸-NaOH，馬來酸鹽，氯代乙酸鹽，甲酸鹽，苯甲酸鹽，丙酸鹽，吡啶， 哌嗪，ADA，PIPES，ACES，BES，TES，N-[三（羥甲基）甲基]甘氨酸，N-二（羥乙基）甘氨 酸，TAPS，乙醇胺，CHES，CAPS，甲胺，哌啶，0-硼酸，碳酸，乳酸，丁二酸，二乙基丙二酸，甘氨 酰甘氨酸，HEPPS，HEPPS0,咪唑，苯酚，P0PS0,琥珀酸鹽，TAPS，基于胺的，芐胺，三甲基或二 甲基或乙基或苯基胺，乙二胺或嗎啉。額外的組分（添加劑）可根據(jù)需要存在于緩沖劑中， 例如，鹽可用于調(diào)整緩沖劑離子強度，諸如氯化鈉，硫酸鈉和氯化鉀；及其他添加劑諸如氨 基酸（諸如甘氨酸和組氨酸），離液劑（諸如脲），醇（諸如乙醇，甘露糖醇，甘油和芐基 醇），去污劑（見上），及糖（諸如蔗糖，甘露糖醇，麥芽糖，海藻糖，葡萄糖和果糖）。使 用的緩沖劑組分和添加劑，及濃度，可根據(jù)在本發(fā)明中實施的層析類型而改變。
[0075] 在本發(fā)明中使用的緩沖劑，包括衛(wèi)生，平衡，裝載，裝載后洗滌，洗脫或脫離緩沖 齊U。在特定實施方式中，將去污劑加入洗滌緩沖劑?？稍诒景l(fā)明中使用的去污劑的例包括， 但不限于聚山梨酯（例如聚山梨酯20或80);泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188) ;Trit〇nTM; 十二烷基硫酸鈉（SDS);月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-，肉豆蘧基-，亞油基-或硬 脂基-磺基甜菜堿；月桂基_，肉豆蘧基_，亞油基肌氨酸或硬脂基肌氨酸；亞油基_，肉豆 蘧基-或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰胺丙基_，椰油酰胺丙基_，亞油酰胺丙基_，肉豆蘧酰胺 丙基_，棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-甜菜堿（例如月桂酰胺丙基）；肉豆蘧酰胺 丙基_，棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-二甲基胺；鈉甲基椰油酰_，或二鈉甲基油基 牛橫酸鹽；M0NAQUAT? 系列（Mona Industries, Inc.，Paterson, N.J.) ;Igepal CA-630?， Pluronic?,Triton?,BRIJ,Atlas G2127?,Genapol?, HECAMEG?,LUBR0L PX?,MEGATm, NP?, THESIT?，T0PPStm，CHAPS，CHAPS0，DDMAU，EMPIGEN BBtm，ZWITTERGENT? 和 C12E8??？蓪⑷ノ?劑加入任何工作緩沖劑，和也可包括在含有目的分子的補料中。去污劑可以適合于在多肽 純化方法中使用的任何量存在，例如，約0. 001 %?約20%和一般約0. 01 %?約1 %。緩沖 劑的pH和導電率可依賴于在純化方法中的哪個步驟使用緩沖劑而改變?？墒褂迷谂c選擇 的配體和基質(zhì)/膜相容的pH下的任何適合的緩沖劑用于純化目的多肽，諸如上述緩沖劑。 在CEX中，緩沖劑的pH可為約3和10之間，更優(yōu)選約pH4. 0?9. 0 ;導電率可為約0. 1? 40mS/cm，更優(yōu)選約導電率0. 5?15mS/cm，依賴于采用的純化步驟和緩沖劑。在AEX中，緩 沖劑pH可為約4?10,更優(yōu)選約pH6. 0?9. 0 ;導電率可為約0. 1?10. 0mS/cm，更優(yōu)選約 0. 5?5mS/cm，依賴于采用的純化步驟和緩沖劑。
[0076] 術(shù)語"平衡液"指稱在應用含有目的多肽的液體之前應用于離子交換基質(zhì)的液體。 "平衡液"用于在用含有要純化的目的多肽的混合物裝載基質(zhì)之前調(diào)整離子交換基質(zhì)的pH 和導電率?？捎糜诖四康牡倪m合的緩沖劑是本領(lǐng)域熟知的，例如，諸如上述緩沖劑，及包括 與用于純化目的多肽的層析步驟中使用的選擇的基質(zhì)相容的pH的任何緩沖劑。在特定實 施方式中，用于AEX或CEX的平衡緩沖劑物質(zhì)是基于MES或TRIS的磷酸鹽，碳酸鹽。用于 AEX的一種優(yōu)選的緩沖劑是MES。
[0077] 平衡緩沖劑具有導電率和/或pH，使得目的多肽結(jié)合到基質(zhì)或，使得目的多肽流 經(jīng)柱而一種或更多雜質(zhì)結(jié)合于柱，依賴于是否使用AEX或CEX。在特定實施方式中，當層析 培養(yǎng)基的pH和導電率分別在平衡緩沖劑的±0. 2和±0. 4mS/cm之內(nèi)，更優(yōu)選分別在平衡 緩沖劑的±0. 1和±0. 2mS/cm之內(nèi)時達到平衡。在CEX中，平衡緩沖劑的pH為約3?約9， 更優(yōu)選pH約4. 0?約8. 0,導電率約0. 1?約40mS/cm，更優(yōu)選約0. 5?約10. OmS/cm。在 AEX中，平衡緩沖劑的pH為約4?約10,更優(yōu)選pH約6?9,導電率約0. 1 (WFI)?約10mS/ cm，更優(yōu)選導電率約0. 5?約5mS/cm。當使用P()R()S? HQ 50陰離子交換基質(zhì)時，在分 別約10?20mS/cm或更優(yōu)選約15?18mS/cm的導電率下，優(yōu)選的pH范圍為約pH 4. 5? 5. 5〇
[0078] 術(shù)語〃裝載液〃指稱含有待分離的目的多肽及一種或更多雜質(zhì)的液體。裝載液在 本發(fā)明的操作條件下經(jīng)過離子交換基質(zhì)。"裝載液"用于將含有目的多肽的混合物裝載到 柱。需知，如果將膜用作層析介質(zhì)，則根據(jù)本領(lǐng)域中使用的常規(guī)方法使裝載液與膜簡單接 觸?？蓪⑷魏芜m當?shù)木彌_溶液用作裝載液。在特定實施方式中，用于裝載液的緩沖劑是碳酸 鹽，磷酸鹽，MES或TRIS緩沖劑。對于AEX的裝載液優(yōu)選的緩沖劑基于碳酸鹽或TRIS。對 于AEX或CEX，選擇裝載液的導電率和pH，使得目的多肽結(jié)合到層析介質(zhì)而多數(shù)混雜物能流 過。用作裝載液的適合的緩沖劑是本領(lǐng)域熟知的，例如，諸如上述那些。本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員應同意，AEX或CEX的裝載液可使用與上述AEX或CEX的平衡緩沖劑相當?shù)模ㄈ绻幌嗤?的）pH和導電率。當使用P()丨U)S? (R)HQ 50陰離子交換基質(zhì)時，分別在10?20mS/ cm或更優(yōu)選15?19mS/cm和更優(yōu)選17?19mS/cm的導電率下，優(yōu)選的pH范圍是pH7. 0? 8. 0。
[0079] 本文所用的術(shù)語"洗滌液"，指稱用來在洗脫目的多肽之前自層析基質(zhì)去除雜質(zhì) 的液體（例如，當使用柱時）。術(shù)語"洗滌"，及其語法變異，用于描述適當?shù)南礈煲和ㄟ^ 層析基質(zhì)或在層析基質(zhì)上經(jīng)過。如果期望，洗滌，平衡和裝載液可為相同的。AEX或CEX中 使用的洗滌液的pH和導電率是，使得一種或更多雜質(zhì)從基質(zhì)洗脫而基質(zhì)保留目的多肽。如 果期望，洗滌液可含有以上描述的去污劑，諸如聚山梨酯。選擇洗滌液的pH和導電率對于 去除HCP和其他混雜物而不顯著洗脫目的多肽是重要的。選擇洗滌液的pH和導電率，使得 目的多肽保留在方法中使用的AEX或CEX基質(zhì)中。以上描述了適合于用于洗滌液的緩沖劑 的例。在特定實施方式中，洗滌緩沖劑基于磷酸鹽，碳酸鹽，MES或TRIS。AEX中優(yōu)選的洗 滌緩沖劑是MES。
[0080] AEX或CEX中使用的洗滌液pH可為約3?約10,更優(yōu)選pH約4?約9 ;及導電率 約0. 1?約40mS/cm，更優(yōu)選約3?約30mS/cm。使用POROS? HQ 50陰離子交換基質(zhì)， pH優(yōu)選是4. 5?5. 5之間和導電率是優(yōu)先約15?25mS/cm和更優(yōu)選的21?23mS/cm和甚 至更優(yōu)選約22mS/cm。
[0081] 術(shù)語〃洗脫液"，如本文所用，指稱用來自AEX或CEX基質(zhì)洗脫目的多肽的緩沖劑。 術(shù)語〃洗脫〃和其語法變異，指稱分子，例如，目的多肽，自層析物質(zhì)通過使用適當?shù)臈l件 移出，所述條件例如，改變周圍層析材料的緩沖劑的離子強度或PH，通過添加配體的競爭性 分子，通過改變分子疏水性或通過變化配體的化學性質(zhì)（例如電荷），使得目的多肽不能結(jié) 合基質(zhì)，且因此自層析柱洗脫。選擇洗脫緩沖劑的pH和導電率，使得目的多肽從方法中使 用的AEX或CEX基質(zhì)洗脫。以上描述了適合于用作洗脫緩沖劑的緩沖劑例。在特定實施方 式中，洗脫緩沖劑基于磷酸鹽或TRIS。
[0082] 術(shù)語"洗出液"指稱包含目的多肽的液體，其在目的多肽結(jié)合于層析材料和添加 洗脫液之后洗脫目的多肽而獲得。
[0083] AEX或CEX中使用的洗脫緩沖劑的pH可為約3?約10,更優(yōu)選pH約4?約9 ;及 導電率約0. 1?約40mS/cm，更優(yōu)選導電率約5?約30mS/cm。使用丨*〇K〇S⑧（R)HQ 50 陰離子交換基質(zhì)，優(yōu)選的pH在8. 0和9. 0之間及優(yōu)選的導電率是約17?27mS/cm和更優(yōu) 選的約22?24mS/cm和甚至更優(yōu)選約22. 5?23mS/cm之間。
[0084] 常常是，在洗滌及洗脫之間或之后必需變化pH，洗滌緩沖劑或洗脫緩沖劑可導入 不與在前洗滌緩沖劑或平衡緩沖劑相容的化合物。在該環(huán)境中，可有利地導入"再平衡步 驟"，其目的是變化移動相的pH而維持目的蛋白的結(jié)合的狀態(tài)，或在導入其不相容的對應物 之前洗滌出一種化合物。
[0085] 如果需要，額外的溶液可用于制備用于再使用的柱。例如，〃再生溶液〃可用于自 純化方法中使用的柱"脫離"或去除緊密結(jié)合的混雜物。一般而言，再生溶液具有足以基 本上自基質(zhì)去除任何余下雜質(zhì)和目的多肽的導電率和pH。
[0086] 在本發(fā)明的意義中"調(diào)整"是指設(shè)置在IEX的特定步驟的操作參數(shù)。此包括調(diào)整特 定pH，特定導電率，特定溫度，特定流速和調(diào)節(jié)本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的IEX的其他參數(shù)。設(shè) 置參數(shù)，使得平衡液和/或裝載液和/或洗滌液中的至少部分化合物結(jié)合于離子交換基質(zhì)。
[0087] 在本發(fā)明的意義中，術(shù)語"雜質(zhì)"指稱存在于溶液諸如裝載液中的任何外源或不 期望的分子。雜質(zhì)可為生物學大分子，諸如核酸如DNA或RNA，或除了要純化的目的多肽之 外的多肽，其也存在于要純化的目的多肽樣品中。雜質(zhì)包括，例如，不期望的多肽變體，諸如 聚集的多肽，錯折疊的多肽，錯二硫鍵鍵合的多肽，高分子量物質(zhì)，低分子量物質(zhì)和片段，及 脫酰氨基化的物質(zhì)；自分泌要純化的多肽的宿主細胞的其他多肽，宿主細胞DNA，自細胞培 養(yǎng)基的組分，病毒，朊病毒，內(nèi)毒素，方法相關(guān)的混雜物，其可為是在當前純化步驟期間浸出 到樣品的用于親和層析的部分吸收劑的分子，例如，多肽A ;核酸；或前述之任何片段。
[0088] "相對于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一種或更多雜質(zhì)，增加結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目 的多肽的量"是指，結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的分子數(shù)與結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一 種或更多雜質(zhì)的分子數(shù)的比對比裝載液中目的多肽的分子數(shù)與一種或更多雜質(zhì)的分子數(shù) 的比增加。
[0089] "洗出液中增加的目的多肽與一種或更多雜質(zhì)的比"是指，洗出液中目的多肽的分 子數(shù)與一種或更多雜質(zhì)的分子數(shù)的比對比裝載液中目的多肽的分子數(shù)與一種或更多雜質(zhì) 的分子數(shù)的比增加。
[0090] "CHOP減縮因數(shù)"是指一方面在洗脫液中目的蛋白的質(zhì)量與CHOP (中國倉鼠卵巢 細胞蛋白）的質(zhì)量的比除以另一方面在裝載液中目的蛋白的質(zhì)量與CHOP的質(zhì)量的比。換 言之CHOP減縮因數(shù)是：
[0091] (洗脫液中質(zhì)量目的蛋白/質(zhì)量CHQP)八裝載液中質(zhì)量目的蛋白/質(zhì)量〇")。
[0092] "CHOP減縮因數(shù)的升高"是指相比當在相同的純化方法中，在與使用化合物的相同 的條件下，不加入化合物時的CHOP減縮因數(shù)，根據(jù)本發(fā)明使用化合物時CHOP減縮因數(shù)的百 分率的增加。例如，當用不同離子交換基質(zhì)或用不同目的蛋白根據(jù)本發(fā)明使用不同化合物 時，CHOP減縮因數(shù)的升高可為11%或16%或38%或52%或60%或89%或150%或165% 或 223%或 265%或 563%或 1200%或 1325%或 1663%。
[0093] "CHOP清除因數(shù)"是裝載液中CHOP的質(zhì)量與洗脫液中CHOP的質(zhì)量的比。
[0094] 本文使用的"至少部分"指稱存在于相應液體或流體或結(jié)合到離子交換基質(zhì)的 化合物或目的多肽的總量的特定百分率。此特定百分率是至少5%，或至少10%，或至少 20 %，或至少30 %，或至少50 %，或至少60 %，或至少70 %，或至少80 %，或至少90 %，或至 少95 %，或至少96 %，或至少97 %或至少98 %，或至少99 %。其指稱例如，當添加到平衡液 中時，結(jié)合于離子交換基質(zhì)的化合物量，或當添加到裝載液中的離子交換基質(zhì)時，結(jié)合于離 子交換基質(zhì)的化合物量或目的多肽量。
[0095] 在本發(fā)明的意義中〃陰離子交換基質(zhì)〃指稱在蛋白結(jié)合時帶正電，由此具有附著 于其的一種或更多帶正電的配體的固相?？墒褂眠m合形成陰離子交換基質(zhì)的附著于固相的 任何帶正電的配體，諸如季氨基。例如，在AEC中使用的配體可為季銨，諸如季烷胺和季烷 醇胺，或胺，二乙胺，二乙基氨基丙基，氨基，三甲基銨乙基，三甲基芐基銨，二甲基乙醇芐基 銨，及聚胺?；蛘撸瑢τ贏EC而言，可使用具有帶正電的配體，諸如上述配體的膜來代替陰離 子交換基質(zhì)。
[0096] 可商購的陰離子交換基質(zhì)包括，但不限于，自Applied Biosystems的DEAE纖 維素，自 GE HEALTHCARE 的 POROS? PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 ; M〇UO〇?， MiniQ, Source?15Q 和 30Q, Q, DEAE 和 ANX J京月旨#￠:) Fast Flow, Q 瓊||糖? 高性能，QAE SEPHADEX? 和 FAST Q 瓊月旨糖?;自 J.T.Baker 的 WP PEI, WP DEAM，WP QUAT;自 Biochrom Labs Inc.的 Hydrocell DEAE 和 Hydrocell QA;自 Biorad 的 UN0sphere?Q，Macr〇-Pl*ep? DEAE和 MaOO-Prep? High Q ;自 Pall Technologies 的 Ceramic HyperD? q，陶瓷HyperD⑩ deae，Q Hy丨)ei，Z?, Trisacryl? M 和 LS DEAE，Spherodex? LS DEAE，QMA Sphenbil·:? LS，QMASpherosil? M ;自 Dow Liquid S印arations的DOWEX?·細網(wǎng)孔強堿I型和II型陰離子基質(zhì)和DOWEX? M0N0SPHER E 77,弱堿陰離子；自 Millipore 的 Matrex Cellufine A200, A500, Q500 和 Q8〇o ;自 emd 的 Fraetogel? emd TMAE3 Frartogel⑩ emd deae 和 Fractogel? emd DMAE ;自Sigma-Aldrich的Amberlite?弱和強陰離子交換物I和II型，DO\￥EX? 弱和強陰離子交換物I和π型，Diaion弱和強陰離子交換物I和π型，Duoiite?;自 Tosoh 的 TSK 凝膠? Q 和 DEAE 5PW 和 5PW-HR，Toyopearl⑩ SuperQ-650S，650M 和 650C3QAE-550C 和 650S，DEAE-650M 和 650C ;及自 Whatman 的 QA52，DE23，DE32，DE51，DE52， DE53, Express_IonTMD 和 Express_IonTMQ〇
[0097] 如果期望，可使用陰離子交換膜來代替陰離子交換基質(zhì)。可商購的陰離子交換膜 包括，但不限于，自 Sartorius 的SartoMlld? Q ;自 Pall Technologies 的M_tong⑩ Q 和自 Millipore 的 Intercept?Q 膜。
[0098] 術(shù)語"化合物"指稱這樣的化合物，其通常是具有l(wèi)OOODa以下的分子量的小分子， 其當在IEX中于特定pH使用時是帶電的，且在特定pH與目的多肽和與雜質(zhì)競爭結(jié)合于離 子交換基質(zhì)。具有結(jié)合金屬離子的能力的優(yōu)選的化合物如下文所列。
[0099] 在本發(fā)明的意義中，術(shù)語"聚集的"是指負電荷的非平均分布，意指在化合物中有 負電荷的局部濃度。
[0100] 〃陽離子交換基質(zhì)〃指稱是在蛋白結(jié)合時帶負電，且具有用于與經(jīng)過或通過固相 的水溶液中的陽離子交換的游離的陽離子的固相?？墒褂眠m合于形成陽離子交換基質(zhì)的 附接于固相的任何帶負電的配體，例如，羧酸酯，磺酸酯和下文描述的其他?？缮藤彽年栯x 子交換基質(zhì)包括，但不限于，例如，具有基于磺酸酯的基團的那些（例如，自GE HEALTHCARE 的 M〇n〇S?, MiniS, Source?15S 和 30S, SP 瓊脂糖? Fast Flow?, SP 瓊脂糖? 高性能；自 Tosoh 的Toyopearl? sp-65〇s 和 sp-65〇m ;自 BioRad 的 Macro-Prep? High S ;自 Pall Technologies 的 Ceramic HyperD? S, 11'isacryMi. V[和 LS SP 和iSpherodex'? ls sp);基于磺乙基的基團（例如，自emd的Fraetogel? se ;自 Applied Biosystems 的 P()R()S? S-10 和 S-20);基于磺丙基的基團（例如，自 Tosoh 的 TSK Gel? SP 5PW 和 SP-5PW-HR ;自 Applied Biosystems 的 P0R0S? HS-20 和hs 50);基于磺基異丁基的基團（例如，自emd的Fractogd? EMD S03);基于 磺氧基乙基的基團（例如，自Whatman的SE52, SE53和Express-離子?S)，基于羧甲 基的基團（例如，自GE HEALTHCARE的CM瓊脂糖? Fast Flow ;自 Biochrom Labs Inc.的 Hydrocell CM;自 BioRad 的 Macn)-Prep? CM;自 Pall Technologies 的 Ceramic HypcrDUi·1 CM, Trisacryl M CM, Trisacryl LS CM ；自 Millipore 的 Matrex Cellufine C500 和 C200 ;自 Whatman 的 CM52, CM32, CM23 和 Express-離子 ?C ;自 Tosoh 的Toyopearl·? CM-650S，CM-650M和CM-650C);基于磺酸和羧酸的基團（例如自 J. T. Baker的BAKERBOND?-羧基-Sulfon);基于羧酸的基團（例如，自J. T Baker 的 WP CBX ;自 Dow Liquid Separations 的 DOWEX? MAC-3 ;自 Sigma-Aldrich 的 Amberlite?弱陽離子交換物，DO胃EX⑩弱陽離子交換物，及Diaion弱陽離子交 換物和自EMD的Fraetogel? EMD C00-);基于磺酸的基團（例如，自Dow Liquid Separations 的Hydrocell SP 自 Biochrom Labs Inc.，DOWEX?:細網(wǎng)孔強酸陽離子基 質(zhì)；自 j. τ· Baker 的UNOsphere? s，wp Sulfonic;自 Sartorius 的 Sartobind?. s 膜；自Sigma-Aldrich的Amberlite?強陽離子交換物，DOWEX?強陽離子和Diaion 強陽離子交換物）；及基于正磷酸的基團（例如，自Whatman的PI 1)。如果期望，可使用 陽離子交換膜來代替陽離子交換基質(zhì)，例如，Sart_()丨)ind⑧S(Sartorius ;Edgewood，NY)。 [0101] 在本發(fā)明的意義中，術(shù)語"絡(luò)合金屬離子的能力"是指在化合物或目的多肽和 金屬離子之間形成絡(luò)合物的能力。絡(luò)合物形成包括多齒配體，即化合物或目的多肽和單 中心原子之間2或更多分離的結(jié)合的形成。通常該化合物是有機化合物，及稱之為螯合 劑（chelant)，螯合劑（chelator)，螯合劑（chelating agent)，或螯合劑（sequestering agent)?；衔锱c單中心原子（可為金屬離子）形成螯合絡(luò)合物。螯合絡(luò)合物與具有單齒 配體的配位絡(luò)合物成對比，其與中心原子形式僅一個鍵。說到非限制性例，以下劑是根據(jù)本 發(fā)明具有絡(luò)合金屬離子的能力的化合物：
[0102] (a)包含五-乙酸基和它們的各種鹽的化合物，如二亞乙基三胺五乙酸（DTPA或噴 替酸），Pentetide，Ino-1 和 Fura-2 ;
[0103] (b)包含四-乙酸基和它們的各種鹽的化合物，如1，2-雙（ο-乙 烷-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四-乙酸（ΒΑΡΤΑ)，乙二胺四-乙酸（EDTA)及其各種鹽（如EDTA二銨，EDTA 二鉀二水合物；EDTA二鈉；EDTA三鈉；EDTA四鈉和四銨EDTA)和乙二醇四-乙酸（EGTA);
[0104] (c)包含三-乙酸基和它們的各種鹽的化合物，如Ν-(羥乙基）乙二胺三-乙酸 (HEDTA)及次氮基三乙酸（ΝΤΑ);
[0105] (c)包含三-乙酸基和它們的各種鹽的化合物，如Ν-(羥乙基）乙二胺三-乙酸 (HEDTA)和（ΝΤΑ);
[0106] (d)包含二-乙酸基和它們的各種鹽的化合物如亞氨基二乙酸（IDA)，亞氨基二琥 珀酸四鈉，檸檬酸三鈉及
[0107] (e)包含多個胺基的化合物，如氨基乙基-乙醇胺（AEEA)，2, 3-二苯基乙二胺，亞 乙基-二胺，乙二胺-N，Ν' -雙（2-羥基苯基乙酸）亞乙基-二胺-N，Ν' -二琥珀酸，四羥丙 基乙二胺，三乙四胺及聚氨基羧酸
[0108] (f)包含多個氫硫基的化合物，如二巰丙醇，二巰基琥珀酸（DMSA)，二巰基-1-丙 磺酸（DMPS)，二乙基二硫代氨基甲酸鈉
[0109] (g)膦酸和其衍生物及它們的各種鹽，如氨基三（亞甲基膦酸）（ATMP)，二亞乙基 三胺五（亞甲基膦酸），乙二胺四（亞甲基膦酸（EDTMP)，依替膦酸或1-羥基乙烷1，1_二 膦酸（HEDP)。
[0110] 需知，將特定化合物列為離子或特定鹽也包括不同鹽中的離子。
[0111] 在本發(fā)明的意義中，以下絡(luò)合劑也是具有絡(luò)合金屬離子的能力的化合物。乙酰丙 酮酸，乙酰丙酮，苯并三唑，2, 2'-二吡啶，4, 4'-二吡啶，1，2-雙（二甲基-胂基）苯1，2 雙（二甲基-膦基）乙烷，1，2-雙（二苯基膦基）-乙烷，苯并三唑，籠形螯合物，2. 2. 2-穴 狀配體，兒茶酚，Corrole，冠醚，18-冠-6,穴狀配體，環(huán)楞胺，環(huán)糊精，地拉羅司，去鐵酮，去 鐵胺，右雷佐生，二乙醇二甲醚，二甲基乙二肟，二硫雜環(huán)戊烯，乙烷二醇，依替膦酸，鐵絡(luò)環(huán) 肽，葡萄糖酸，金屬冠醚，水解的酪蛋白，六氟乙酰丙酮，青霉胺，鄰菲羅啉，膦酸，植物螯合 素，卟吩，卟啉，焦磷酸，蝎合物配體，鈉聚（天冬氨酸），三聯(lián)吡陡，四苯基-卟啉，1，4, 7-三 氮雜環(huán)壬烷，三偏磷酸三磷，及1，4, 7-三硫雜環(huán)壬烷。
[0112] 在本發(fā)明的意義中，本發(fā)明的尤其優(yōu)選的實施方式是使用乙二胺四乙酸（EDTA) 作為化合物的方法。EDTA是具有式[CH2N(CH2C02H)2]2的聚氨基羧酸。因為其作為螯合 劑的作用，即其〃隔絕〃金屬離子諸如Ca2+和Fe3+的能力，其變得有用。在被EDTA結(jié)合之 后，金屬離子保持在溶液中，但呈現(xiàn)減小的反應性。EDTA作為幾種鹽產(chǎn)生，顯著地，EDTA二 鈉和EDTA鈣二鈉。分子量是292. 24Da。在配位化學中，EDTA4-是聚氨基羧酸配體家族的成 員。EDTA4-通常通過其2個胺和4個羧酸結(jié)合于金屬陽離子。得到的配位化合物之許多采 用八面體幾何形狀。EDTA也能結(jié)合于AEX基質(zhì)的陽離子電荷。
[0113] 本發(fā)明的方法以7mM和化合物導入平衡液或樣品液或洗滌液的導電率高得目的 多肽的結(jié)合不再發(fā)生的濃度之間的濃度使用化合物如EDTA。對于給定化合物及給定目的多 肽的各個體組合，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易確定此化合物量的最大濃度。對于EDTA而言，本 發(fā)明的方法的優(yōu)選的濃度是至少7mM或至少10mM，或至少15mM，或至少20mM或至少25mM 或至少30mM或至少32mM或至少40mM或至少50mM。對于EDTA而言，平衡液或樣品液或洗 滌液的導電率對于有效目的多肽的結(jié)合變得太高的范圍起始于約200mM。因此，優(yōu)選的本 發(fā)明的方法使用達200mM EDTA，或達190mM，或達180mM或達170mM或達160mM或達150mM 或達140mM或達130mM。需知，公開的EDTA的濃度的下限范圍可與公開的上限濃度組合而 形成優(yōu)選的濃度范圍，如7mM?200mM，7mM?190mM，7mM?180mM. . ·或10mM?200mM，或 10mM ?190mM,或 10mM ?180mM.....，或 15mM ?200mM 或 15mM ?190mM 或 15mM ?180mM。
[0114] 本發(fā)明的也尤其優(yōu)選的實施方式是使用乙二醇四-乙酸（EGTA)作為化合物的方 法。
[0115] 可根據(jù)本發(fā)明在通過CEX純化目的多肽中使用的陰離子化合物的例是伯胺和陽 離子氨基酸聚合物，諸如四亞乙基五胺（ΤΕΡΑ)，二甲基吡啶胺（DPA)，聚-賴氨酸，聚-精氨 酸和聚-組氨酸。
[0116] 待通過本發(fā)明的方法純化的優(yōu)選的多肽帶電，且具有優(yōu)先聚集的電荷或包含以上 所列的化合物的官能團，如胺或氫硫基，其能貢獻于強結(jié)合于離子交換基質(zhì)。優(yōu)先這些官能 團也聚集。
[0117] 術(shù)語〃宿主細胞多肽〃，或"HCP"，指稱源于表達靶多肽（包括任何自宿主細胞的 基因組表達的多肽或重組表達的多肽，且不被認為是靶多肽）的宿主細胞的代謝（細胞內(nèi) 和細胞外）的任何多肽。宿主細胞可為能表達靶多肽的任何細胞，特別是哺乳動物（例 如，CHO和鼠骨髓瘤細胞系諸如NSO)，昆蟲細菌，植物和酵母細胞系。在本發(fā)明的特定實施 方式中，HCP是〃中國倉鼠卵巢細胞多肽"，或"CHOP"，其指稱源于中國倉鼠卵巢（"CHO") 細胞培養(yǎng)的任何宿主細胞多肽（"HCP")。HCP通常在含有目的多肽的細胞培養(yǎng)基或裂解產(chǎn) 物[(例如，收獲的細胞培養(yǎng)液（"HCCF")]中作為雜質(zhì)存在。在包含目的多肽的混合物中存 在的HCP的量提供目的多肽的純度的程度的量度。一般而言，在多肽混合物中HCP的量以 相對于在混合物中目的多肽量的百萬分之幾表達。因此，在一些實施方式中，含有產(chǎn)物的洗 出液具有小于lOOppm，或小于90ppm，或小于80ppm，或小于70ppm，或小于60ppm，或以小于 50ppm，或小于40ppm，或小于30ppm，或小于20ppm，或小于lOppm或小于5ppm的HCP。
[0118] HCP組成極其異源和依賴于使用的多肽產(chǎn)物和純化方法。在任何治療性用途的生 物學產(chǎn)品的銷售批準之前，產(chǎn)品中混雜多肽（諸如HCP)的水平必需根據(jù)ICH和FDA指南定 量測量。
[0119] 以上討論的宿主細胞多肽，如果使用人細胞系來產(chǎn)生目的多肽，則可為人多肽，或 如果使用非-人細胞系來產(chǎn)生目的多肽，則可為非-人多肽。在本發(fā)明中的一方面，多肽混 雜物是宿主細胞多肽，諸如維生素 K-依賴性多肽。宿主細胞多肽的特別關(guān)聯(lián)類別是含有 Gla-結(jié)構(gòu)域的多肽，諸如GAS-6,多肽S，因子II (凝血酶原），凝血酶，因子X/Xa，因子IX/ IXa，多肽C，因子VII/VIIa，多肽Z，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽1，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽 2,跨膜Y羧基谷氨酸多肽3,跨膜γ-羧基谷氨酸多肽4,基質(zhì)Gla多肽，及骨鈣素。
[0120] 如上所述，維生素 K-依賴性目的多肽是選自因子VII多肽，因子IX多肽，因子X 多肽及活化的多肽C的一般維生素 K-依賴性凝血因子。在一個更特定實施方式中，維生素 K-依賴性目的多肽是因子IX多肽。在另一更特定實施方式中，維生素 K-依賴性目的多肽 是因子VII多肽。在另一特定實施方式中，維生素 K-依賴性目的多肽是因子X多肽。
[0121] 在另一實施方式中，本發(fā)明提供由人維生素 K-依賴性多肽分離非-人多肽混雜物 的方法。在本發(fā)明中的一方面，非-人多肽混雜物也是維生素 K-依賴性多肽。在再一方面， 非-人多肽混雜物是倉鼠多肽。
[0122] 術(shù)語〃百萬分之〃或〃ppm〃互換使用，以指稱通過本發(fā)明的方法純化的目的多肽 純度的量度。單位ppm指稱以ng/ml的HCP/以mg/ml的目的多肽的量，其中多肽在溶液中 (即，上例中描述的，HCP ppm = (CHOP ng/ml)/(目的多肽mg/ml))。當多肽經(jīng)干燥時，諸 如通過冷凍干燥，ppm指稱（HCP ng) / (目的多肽mg)。
[0123] 有測定宿主細胞蛋白（HCP)水平的不同方法。自目的多肽鑒定失敗及足夠去除 HCP可導致減少的功效和/或不利的患者反應。一種方法是涉及ELISA的"HCP ELISA"，其 中在測定中使用的第2抗體特異于由用來產(chǎn)生抗體的細胞，例如，CH0細胞所產(chǎn)生的HCP。 第2抗體可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的常規(guī)方法產(chǎn)生。例如，第2抗體可使用通過假產(chǎn)生 和純化運行獲得的HCP產(chǎn)生，S卩，使用用來產(chǎn)生目的抗體的相同的細胞系，但細胞系未經(jīng)抗 體DNA轉(zhuǎn)染。在例示實施方式中，第2抗體使用類似于在選擇的細胞表達系統(tǒng)，S卩，用來產(chǎn) 生靶抗體的細胞表達系統(tǒng)中表達的那些的HCP來產(chǎn)生。
[0124] 一般而言，HCP ELISA包括將將包含HCP的液體樣品夾在抗體，S卩，第1抗體和第 2抗體的2層之間。樣品經(jīng)溫育，期間樣品中的HCP被第1抗體，例如，親和性純化的山羊 抗-CHO(Cygnus)捕獲。添加特異于自用來產(chǎn)生抗體，例如，生物素化的抗-CH0 HCP的細胞 產(chǎn)生的HCP的標記的第2抗體，并結(jié)合于樣品之中的HCP。樣品中含有的HCP量使用基于第 2抗體的標記物的適當?shù)臏y試來測定?？墒褂肏CP ELISA來測定在抗體組合物，諸如使用 以上部分III描述的方法獲得的洗出液或流通中HCP的水平。本發(fā)明也提供包含抗體的組 合物，其中組合物無通過HCP酶聯(lián)免疫吸附測定（"ELISA")測定的可檢測的水平的HCP。
[0125] 術(shù)語"宿主細胞核酸"是指存在于表達目的多肽的宿主細胞中的任何多核苷酸例 如RNA或DNA。核酸分子可為單鏈或雙鏈。
[0126] 術(shù)語"產(chǎn)物相關(guān)的混雜物"涉及降解產(chǎn)物，聚集物或錯折疊的或另外變性的形式的 目的多肽，其不是期望的和應從最終純目的多肽除去?？蓽p少的一種特定目的降解產(chǎn)物是 FIX純化中的FIX α。
[0127] 術(shù)語"病毒"包括DNA或RNA病毒。這些病毒可被磷脂膜包裹或非-包裹。
[0128] 術(shù)語"朊病毒"涉及傳染性錯折疊的蛋白。這些錯折疊的蛋白可導致正確地折疊 的版本的蛋白本身成為錯折疊的。
[0129] 術(shù)語"內(nèi)毒素"是指源于細胞膜的脂多糖。
[0130] 術(shù)語"方法相關(guān)的雜質(zhì)"涉及任何分子尤其在方法中添加的蛋白。通過非限制性 例的方式，該方法相關(guān)的雜質(zhì)可為例如自來自上游免疫親和性純化的單克隆抗體的蛋白A， 聚山梨酯-80,三-η-磷酸丁酯或浸出的配體。
[0131] 術(shù)語〃收獲的細胞培養(yǎng)液"，是指已通過包括離心或過濾的手段去除細胞的原核 生物或真核細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)是原核生物或真核細胞在受控條件下生長的方法。
[0132] 術(shù)語"細胞培養(yǎng)"指稱源于多細胞真核生物的細胞，包括動物細胞或單細胞原核 生物，包括細菌和酵母的培養(yǎng)。真核細胞培養(yǎng)包括哺乳動物細胞諸如中國倉鼠卵巢細胞，雜 交瘤和昆蟲細胞。用適當?shù)募毎囵B(yǎng)容器，分泌的多肽可從固著依賴性細胞或懸浮液細胞 系得到。哺乳動物細胞培養(yǎng)物包括中國倉鼠卵巢（CH0)細胞。
[0133] 術(shù)語"減少的"指稱物質(zhì)的減少或漸小的量。減少的制備物包括具有相對于初始 量少的物質(zhì)，諸如HCP的制備物。在一實施方式中，物質(zhì)是雜質(zhì)或混雜物。在一實施方式 中，術(shù)語"減少的"是指實質(zhì)上少物質(zhì)。在另一實施方式中，術(shù)語"減少的"是指無物質(zhì) 的量。在一實施方式中，無物質(zhì)的量包括使用本文所述的測定"無可檢測的量"。
[0134] 術(shù)語〃基本上無〃包括無物質(zhì)量，但也可包括物質(zhì)的最小量。在一實施方式中，無 物質(zhì)的量包括使用本文所述的測定"無可檢測的量"。
[0135] 術(shù)語〃去污劑〃指稱對于防止多肽聚集及防止混雜物與目的多肽的非特異性相互 作用或結(jié)合有用，且可以各種濃度存在的離子，兩性離子和非離子表面活性劑。
[0136] 〃清潔〃溶液一般用來在純化方法之前，通過去除任何結(jié)合的混雜物，例如，生物 學來源的那些來清潔柱層析中使用的基質(zhì)。可使用任何期望緩沖劑用于此目的，只要其與 根據(jù)本發(fā)明的方法選擇的特定柱和基質(zhì)相容。優(yōu)選地，清潔溶液的pH高，例如，pHIO或更 大，更優(yōu)選pHll或更大，且仍更優(yōu)選pH12或更大；替代性地，清潔溶液的pH可低，例如pH 4或更小，更優(yōu)選pH3或更小。在特定實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的基質(zhì)使用包括 IN NaOH，pH大于12的清潔溶液清潔。
[0137] 如本文所用，術(shù)語"導電率"指稱水溶液在特定溫度下在2個電極之間導電流的 能力。電流經(jīng)溶液中的離子運輸流動。因此，隨著存在于水溶液中的離子的增加量，溶液會 具有更高導電率。在本發(fā)明的方法中，純化一般進行的溫度，在特定的pH范圍之內(nèi)，可為約 4?約37°C，更優(yōu)選約15?約25°C。
[0138] 導電率的測量單位是milliSiemens/cm(mS/cm)，且可使用標準導電率計測量。溶 液的導電率可通過改變其中的離子濃度來改變。例如，可改變?nèi)芤褐械木彌_劑濃度和/或 鹽（例如NaCl或KC1)濃度，以便達到期望的導電率。優(yōu)選地，如下例中描述，將鹽濃度修 飾為達到期望的導電率。相應流體的導電率不是本發(fā)明的必要的特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員可 用允許目的多肽和化合物結(jié)合于離子交換基質(zhì)的平衡液，裝載液或洗脫液中的標準實驗導 電率測定。
[0139] 多肽的"ρΓ或〃等電點〃指稱多肽的正電荷平衡其負電荷的pH。pi可根據(jù)各種 常規(guī)方法，例如，由多肽上的氨基酸和/或唾液酸殘基上的凈電荷或通過使用等電聚焦來 計算。
[0140]【維生素 K-依賴性目的多肽】
[0141] 本發(fā)明在廣方面涉及維生素 K-依賴性目的多肽的純化及包含該多肽的特定純化 的組合物。本文應用術(shù)語〃目的〃作為與以最純形式獲得關(guān)聯(lián)的特定物質(zhì)（維生素 K-依 賴性多肽）的指標，例如在治療性情景中使用維生素 K-依賴性多肽的目的。
[0142] 本文所述的方法可原理上可應用于任何維生素 K-依賴性多肽的純化，包含但不 限于GAS-6,多肽S，因子II (凝血酶原），凝血酶，因子X/Xa，因子IX/IXa，多肽C，因子VII/ Vila，多肽Z，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽1，跨膜γ-羧基谷氨酸多肽2,跨膜γ羧基谷氨酸 多肽3,跨膜γ -羧基谷氨酸多肽4,基質(zhì)Gla多肽，及骨鈣素），尤其是選自因子VII多肽， 因子IX多肽，因子X多肽及活化的多肽C的維生素 K-依賴性凝血因子。在一個特定實施 方式中，方法用于在細胞培養(yǎng)，尤其是非-人細胞培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的重組維生素 K-依賴性 目的多肽的純化。
[0143] 在一特定實施方式中，維生素 K-依賴性目的多肽是因子IX多肽，諸如FIX或 FIXa。
[0144] 如本文所用，術(shù)語〃因子IX多肽〃和"FIX多肽〃是指包含野生型人因子IX的氨 基酸序列的任何多肽（即，具有美國專利No. 4, 994, 37或歐洲專利No. EP 0107278中公開 的氨基酸序列的多肽），其變體，以及因子IX-相關(guān)的多肽，因子VII衍生物和因子VII綴合 物。此包括相對野生型人因子IX呈現(xiàn)基本上相同的或改善的生物學活性的因子IX變體， 因子IX-相關(guān)的多肽，因子IX衍生物和因子IX綴合物。
[0145] 人FIX，維生素 K-依賴性多肽的組的成員是具有57kDa的分子量的單鏈糖蛋白，其 作為415個氨基酸的無活性酶原由肝細胞分泌到血流。其含有定位于多肽的N-端Gla-結(jié) 構(gòu)域的12個羧基-谷氨酸殘基。Gla殘基對于它們的生物合成需要維生素 K。在Gla 結(jié)構(gòu)域之后，有2個表皮生長因子結(jié)構(gòu)域，活化肽，及胰蛋白酶-型絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。 FIX的進一步翻譯后修飾包括羥化（Asp 64)，N-(Asnl57和Asnl67)以及0-型糖基化 (Ser53, Ser61, Thrl59, Thrl69 和 Thrl72)，硫酸化（Tyrl55)，及磷酸化（Serl58)。
[0146] FIX將轉(zhuǎn)化為其有活性的形式，因子IXa，通過在Argl45-Alal46和Argl80-Vall81 的活化肽的蛋白水解導致形成2個多肽鏈，N-端輕鏈（18kDa)和C-端重鏈（28kDa)，它 們通過一個二硫橋連接在一起。因子IX的活化切割可例如通過因子XIa或因子VIIa/TF 體外達到。因子IX以5?10 μ g/ml的濃度存在于人血漿中。人中因子IX的末端血漿 半衰期發(fā)現(xiàn)是約 15 ?18 小時（White GC et al. 1997. Recombinant factor IX. Thromb Haemost. 78:261-265 ；Ewenstein BM et al.2002.Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant F IX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B. Transfusion 42:190-197)。
[0147] 在另一實施方式中，本發(fā)明涉及自FIX α分離全長FIX的方法。FIX α是一種由在 僅Argl45-Alal46活化位點FIX的切割得到的特異性蛋白水解破斷產(chǎn)物。此形式的蛋白不 可通過SEC分離，由于其經(jīng)二硫鍵保持一起，且由此是FIX純化中的特定問題。在本發(fā)明的 一實施方式中，通過使用本發(fā)明的方法，F(xiàn)IX α量對比完整FIX量減少。
[0148] 在另一特定實施方式中，維生素 K-依賴性目的多肽是因子VII多肽，諸如因子 VII-相關(guān)的多肽，或因子VII衍生物，或因子VII綴合物，尤其是人因子VII多肽，尤其是人 野生型因子VII或野生型人因子Vila。
[0149] 如本文所用，術(shù)語〃因子VII多肽〃和"FVII多肽〃是指任何包含野生型人因子 Vila的氨基酸序列1?406的多肽（即，具有美國專利No. 4, 784, 950中公開的氨基酸序 列的多肽），其變體以及因子VII-相關(guān)的多肽，因子VII衍生物和因子VII綴合物。此包 括相對于野生型人因子Vila呈現(xiàn)基本上相同的或改善的生物學活性的因子VII變體，因子 VII-相關(guān)的多肽，因子VII衍生物和因子VII綴合物。
[0150] FVII是具有約50kDa的分子量的單鏈糖蛋白，其作為406個氨基酸的無活性酶原 由肝細胞分泌到血流。其含有定位于蛋白的N-端Gla-結(jié)構(gòu)域的10個γ-羧基-谷氨酸 殘基（第6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29和35位）。Gla殘基需要維生素 K用于它們的生物 合成。位于Gla結(jié)構(gòu)域的C-端的是2個表皮生長因子結(jié)構(gòu)域，之后是胰蛋白酶-型絲氨酸 蛋白酶結(jié)構(gòu)域。FVII的進一步翻譯后修飾包括羥化（Asp 63)，N-(Asnl45和Asn322)以及 〇-型糖基化（Ser52和Ser60)。
[0151] FVII通過在Argl52-Ilel53的單肽鍵的蛋白水解轉(zhuǎn)化為其有活性的形式因子 Vila，導致形成2個多肽鏈，N-端輕鏈（24kDa)和C-端重鏈（28kDa)，它們通過一個二硫橋 連接在一起。與其他維生素 K-依賴性凝血因子相反，對FVII未描述在這些其他維生素 -K 依賴性凝血因子的活化期間切割下的活化肽。Argl52-Ilel53切割位點和一些氨基酸下游 顯示與其他維生素 K-依賴性多肽的活化切割位點的同源性。
[0152] 【重組表達】
[0153] 多肽的重組產(chǎn)生可使用各種技術(shù)達到。一般將目的多核苷酸序列克隆進〃表達載 體"。載體可為質(zhì)粒載體，病毒載體，或任何其他適應于插入外源序列的適合的媒質(zhì)，根據(jù)需 要將它們的導入真核或原核生物細胞和表達導入的序列。一般載體包括宿主細胞中融合多 肽表達需要的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制序列，諸如啟動子，核糖體結(jié)合位點，起始密碼子，終止密碼 子，任選地操作子序列和可能的其他調(diào)控序列諸如增強子。
[0154] 適合于產(chǎn)生本發(fā)明的重組多肽的重組表達載體一般包括一種或更多調(diào)控序列，基 于用于表達的宿主細胞選擇，可操作地連接到編碼待表達的融合多肽的核酸序列。本領(lǐng)域 技術(shù)人員會同意，表達載體的設(shè)計可依賴于因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇及期望的肽 表達水平。載體DNA可經(jīng)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導入原核生物或真核細胞。用于制備重組載 體，使用復制載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，及以生物學方式表達有活性的外源多肽的方法和材料是 本領(lǐng)域通常熟知的。本發(fā)明的重組多肽也可在無細胞的系統(tǒng)中產(chǎn)生。
[0155] 也可設(shè)計重組目的多肽，從而它們是細胞外分泌的和/或運輸?shù)郊毎麅?nèi)的特定 位置。例如，重組肽可設(shè)計為運輸?shù)郊毎鳎T如植物細胞的質(zhì)體或液泡或其他類型的 非-膜細胞器或包含諸如存在于原核生物的那些。本領(lǐng)域通常知道用于靶向肽到細胞外或 細胞位置的方法。例如，重組肽和/或載體構(gòu)建體可設(shè)計為包括致使細胞運輸?shù)陌邢蛐蛄?和/或翻譯后修飾。該運輸可為翻譯后或共翻譯。
[0156] 重組目的多肽也可在特定細胞器或細胞位置，諸如質(zhì)體產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知用于達到在期望的位置的表達的適當?shù)姆椒?，且包括，例如具有適合的啟動子和其他根 據(jù)需要具有的5'和3'控制序列的重組肽和/或載體的設(shè)計。
[0157] 除了原核生物之外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是對于編碼多肽的載體適 合的克隆或表達宿主。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或常見的面包酵母，是其 中最常使用的低等真核宿主微生物。但是，許多其他屬，物種和株是通常可利用的和有用 的，諸如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe);克魯維酵母屬（Kluyveromyces) 宿主諸如，例如，乳克魯維酵母（K. lactis)，脆壁克魯維酵母（K. fragilis) (ATCC 12, 424)，保加利亞克魯維酵母（K. bulgaricus) (ATCC 16, 045)，威克曼氏克魯維酵母 (K. wickeramii) (ATCC 24, 178)，瓦爾提克魯維酵母（K. waltii) (ATCC56, 500)，果蠅克魯 維酵母（K. drosophilarum) (ATCC 36, 906)，耐熱克魯維酵母（K. thermotolerans)及馬克 思克魯維酵母（K.marxianus);耶氏酵母屬（Yarrowia)(EP 402,226);巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris) (EP 183,070);念珠菌屬（Candida);瑞氏木霉（Trichoderma reesei) (EP 244, 234);粗糖鏈抱霉（Neurospora crassa);許旺氏酵母屬（Schwanniomyces) 諸如西方許旺氏酵母（Schwanniomyces occidentalis);及絲狀真菌諸如，例如，鏈 抱霉屬（Neurospora),青霉屬（PeniciIlium),彎頸霉屬（Tolypocladium)和曲霉屬 (Aspergillus)宿主，諸如溝巢曲霉（A.nidulans)及黑曲霉（A.niger)。表達糖基化的 抗體的適合的宿主細胞源于多細胞生物。無脊椎動物細胞的例包括植物和昆蟲細胞。 已鑒定多種桿狀病毒株和變體及對應允許的自宿主的昆蟲宿主細胞，諸如草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)，埃及伊蚊（Aedes aegypti)，白條伊蚊（Aedes albopictus)，黑 腹果蠅（Drosophila melanogaster)，及家蠶蛾（Bombyx mori)。轉(zhuǎn)染的各種病毒株是以公 共渠道可利用的，例如，苜蓿銀紋夜蛾（Autographa californica) NPV的L-I變體和家蠶蛾 (Bombyx mori)NPV的Bm-5株，且可將該病毒根據(jù)本發(fā)明用作病毒，特別用于轉(zhuǎn)染草地貪夜 蛾（Spodoptera frugiperda)細胞。也可將棉花，玉米，馬鈴薯，大豆，牽?；ǎ瑺敽蜔煵?的植物細胞培養(yǎng)物用作宿主。
[0158] 用于表達本發(fā)明的重組抗體的優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括：中國倉鼠卵 巢（CH0 細胞）（包括 dhfr-CHO 細胞，描述于 Urlaub 和 Chasin，（1980)PNAS USA 77:4216-4220，以DHFR可選擇的標記物使用，例如，描述于Kaufman和Sharp(1982) Mol. biol. 159:601-621)，NS0骨髓瘤細胞，COS細胞和SP2細胞。當將編碼抗體基因的 重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞時，通過以足以允許宿主細胞中抗體表達或，更優(yōu) 選地，抗體分泌到宿主細胞生長的培養(yǎng)基中的時間培養(yǎng)宿主細胞來產(chǎn)生抗體。有用的 哺乳動物宿主細胞系的其他例是：由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系（C0S-7，ATCC CRL 1651); 人胚胎腎系（用于在懸浮液培養(yǎng)中生長而亞克隆的293或293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977));幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞 /-DHFR(CH0, Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:4216(1980));小鼠 Sertoli 細胞（TM4, Mather, Biol. R印rod. 23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1ATCC CCL 70);非洲 綠猴腎細胞（VER0-76，ATCC CRL-1587);人子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);狗腎細胞 (MDCK, ATCC CCL 34);水牛鼠肝細胞（BRL 3A, ATCC CRL 1442);人肺細胞（W138, ATCC CCL 75);人肝細胞 〇fep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51) ;TRI 細胞 (Mather et al·，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ;MRC 5 細胞；FS4 細胞；及人肝 細胞瘤系〇fep G2)。
[0159] 將宿主細胞用上述用于產(chǎn)生的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化，且在對于誘導啟動子，選擇 轉(zhuǎn)化體，或擴增編碼期望的序列的基因適當修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0160] 【藥物組合物】
[0161] 可將使用本發(fā)明的方法獲得的多肽摻入適合于施用給受試者的藥物組合物。一般 而言，藥物組合物包含抗體，或其抗原-結(jié)合部分，及藥學可接受的載體。
[0162] 如本文所用，〃藥學可接受的載體〃包括任何和全部生理相容的溶劑，分散介質(zhì)， 包衣，抗細菌劑和抗真菌劑，等滲劑和吸收延遲劑等。藥學可接受的載體的例包括下列一種 或更多：水，鹽水，磷酸鹽緩沖液，右旋糖，甘油，乙醇等，以及其組合。在許多情況中，可優(yōu)選 在組合物中包括等滲劑，例如，糖，多元醇諸如甘露糖醇，山梨糖醇或氯化鈉。藥學可接受的 載體可還包含少量的輔助物質(zhì)，諸如潤濕或乳化劑，防腐劑或緩沖劑，其增強抗體，或其抗 原-結(jié)合部分的貨價期或有效性。
[0163] 可將使用本發(fā)明的方法獲得的目的多肽摻入適合于施用給受試者的藥物組合物。 如本文所用，〃藥學可接受的載體〃包括生理相容的任何和全部溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗細 菌劑和抗真菌劑，等滲劑和吸收延遲劑等。藥學可接受的載體的例包括下列一種或更多： 水，鹽水，磷酸鹽緩沖液，右旋糖，甘油，乙醇等，以及其組合。在許多情況中，可優(yōu)選在組合 物中包括等滲劑，例如，糖，多元醇諸如甘露糖醇，山梨糖醇或氯化鈉。藥學可接受的載體可 還包含少量的輔助物質(zhì)，諸如潤濕或乳化劑，防腐劑或緩沖劑，其增強抗體，或其抗原-結(jié) 合部分的貨價期或有效性。
[0164] 可處理溶液，以例如通過冷凍干燥，噴霧干燥，冷凍干燥去除一些或全部溶劑或另 外自溶液回收重組肽。然后可存儲重組肽，例如，作為液體制劑或固體制劑。終產(chǎn)物的期望 的制劑通過肽的需要的下游應用來確定。
[0165] 包含本發(fā)明的多肽的藥物組合物可見于各種形式。這些包括，例如，液體，半-固 體和固體劑型，諸如液體溶液（例如，可注射的和可輸注的溶液），分散或懸浮液，片劑，丸 齊IJ，粉劑，脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式依賴于旨在的施用模式和治療性應用。典型優(yōu)選的組 合物為可注射的或可輸注的溶液形式。優(yōu)選的施用模式是腸胃外（例如，靜脈內(nèi)，皮下， 腹膜內(nèi)，肌內(nèi)）。在優(yōu)選的實施方式中，抗體由靜脈內(nèi)輸注或注射施用。在另一優(yōu)選的實施 方式中，抗體由肌內(nèi)或皮下注射施用。
[0166] 治療組合物一般必需是無菌的和在制備和存儲條件下穩(wěn)定。組合物可制成溶液， 微乳劑，分散，脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。無菌可注射溶液可通過將活性 化合物（即，抗體或其抗原-結(jié)合部分）根據(jù)需要以需要的量合并進適當?shù)暮陨狭信e的 成分之一或組合的溶劑，之后是過濾的滅菌來制備。一般而言，分散劑通過將活性化合物合 并進含有堿性分散介質(zhì)及自以上列舉的那些的需要的其他成分的無菌媒質(zhì)來制備。在用于 制備無菌可注射溶液的無菌粉的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥及冷凍干燥，這從其 之前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分加任何其他所需成分的粉?？删S持溶液的適當?shù)牧鲃?性，例如，通過使用包衣諸如卵磷脂，在分散劑的情況中通過維持需要的粒徑，及通過使用 表面活性劑?？赏ㄟ^在組合物中包括延遲吸收的劑，例如，單硬脂酸鹽和明膠來導致可注射 的組合物的延長的吸收。
[0167] 使用本發(fā)明的方法獲得的多肽可由各種本領(lǐng)域知道的方法施用，盡管對于許多治 療性應用，優(yōu)選的施用途徑/模式是皮下注射。在另一實施方式中，施用是經(jīng)靜脈內(nèi)注射或 輸注。本領(lǐng)域技術(shù)人員會同意，施用途徑和/或模式會依賴于期望的結(jié)果而改變。在特定實 施方式中，活性化合物可用會保護化合物免于快速釋放的載體制備，諸如受控釋放制劑，包 括植入物，經(jīng)皮貼劑及微膠囊包裹的遞送系統(tǒng)。可使用可生物降解的，生物相容性聚合物， 諸如亞乙基乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，膠原，多正酯和聚乳酸。制備該制劑的許多方法已 被授予專利權(quán)或本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知道。
[0168] 本發(fā)明的藥物組合物可包括〃治療有效量〃或〃預防性有效量〃的使用本發(fā)明 的方法純化的目的多肽。"治療有效量"指稱對于達到期望的治療結(jié)果在劑量及必需的時 間上有效的量。治療有效量的抗體，或其抗原-結(jié)合部分，可根據(jù)下列因素改變諸如：個體 疾病狀態(tài)，齡，性別和重量，及多肽在個體中引發(fā)所需應答的能力。治療有效量也是抗體，或 其抗原-結(jié)合部分的治療有益效應大于任何毒性或有害效應的量。"預防性有效量"指稱 在劑量及必需時間上，對于達到期望的預防結(jié)果有效的量。一般而言，由于預防性劑量用于 疾病之前或早先階段的受試者，預防性有效量會小于治療有效量。可將劑量方案調(diào)至提供 最佳所需應答（例如，治療或預防應答）。例如，可施用單次推注，可經(jīng)時施用幾分次的劑 量或劑量可根據(jù)治療狀況的急迫程度按比例減少或增加。以為了容易施用和劑量均一性的 劑量單元形式配制腸胃外組合物尤其有利。本文所用的劑量單元形式指稱適合作為用于待 治療的哺乳動物受試者的單元劑型的物理學獨立單元；各單元包含預定量的活性化合物， 計算為與需要的藥學載體關(guān)聯(lián)產(chǎn)生期望的治療效果。本發(fā)明的劑量單元形式的規(guī)格取決于 和直接依賴于（a)要達到的活性化合物和特定治療或預防效應的獨特性質(zhì)，及（b)配合該 用于治療個體敏感度的活性化合物的領(lǐng)域固有的限制。
[0169] 本發(fā)明也屬于包含使用本發(fā)明的方法獲得的抗體，或其抗原-結(jié)合部分的包裝的 藥物組合物，制備物品，或試劑盒。制備物品可包含使用本發(fā)明的方法獲得的抗體，或其抗 原-結(jié)合部分，及包裝物質(zhì)。制備物品也可包含指示具有減少的水平的HCP的包含抗體，或 其抗原-結(jié)合部分的制劑或組合物的標簽或包裝單。
[0170] 本發(fā)明參照下列實施例進一步描述，這些實施例僅是例證性的和非限制性的。實 施例涉及下列圖： 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0171] 圖1 :在各種EDTA濃度的CHOP清除
[0172] 圖2 :來自含有對照和含EDTA的方法的洗出液的分析SEC
[0173] 12. 849:聚集物，15. 171:單體 rIX-FP，17. 270:rIX-FP 的降解形式
[0174] 19. 625 :rIX_FP 的降解形式
[0175] 圖3 :含有對照和EDTA的方法的洗出液中的因子IX α水平
[0176] 圖4 :大規(guī)模生產(chǎn)中的CHOP清除
[0177] 圖5 : POROS? 50HQ上不同化合物的CHOP減縮因數(shù)。
[0178] 圖6 :使用EDTA的不同陰離子交換基質(zhì)的CHOP減縮因數(shù)。
[0179] 圖7 :在裝載后洗滌緩沖劑中僅POROS? 50HQ和EDTA的CHOP減縮因數(shù)。
[0180] 圖8 :使用EDTA的陰離子交換基質(zhì)Fractogel? EMD TMAE(M)上單克隆抗體的 CHOP減縮因數(shù)。 圖9 :使用DPA的陽離子交換基質(zhì)丨? EMD S03(M)上單克隆抗體的CHOP 減縮因數(shù)。 圖10 :使用不同濃度的EDTA對比不添加 EDTA的對照的 P〇 R()S? 50HQ上 rVIIa-FP的CHOP減小因素 【實施例】
[0181] 【實施例1 :丨DROS# -HQ上rIX-FP的EDTA-介導的純化的方法】
[0182] rIX-FP在CH0細胞中作為白蛋白融合蛋白表達，F(xiàn)IX在C-端融合到描述于 W02007/144173的人白蛋白。發(fā)酵培養(yǎng)之后使通過Cun〇4 60SP之后是10SP來經(jīng)歷過濾。 澄清的細胞培養(yǎng)液然后經(jīng)"含有EDTA的"本發(fā)明的陰離子交換方法或經(jīng)"對照"方法處理。
[0183] 【實施例la:對照方法】
[0184] 將澄清的細胞培養(yǎng)液（裝載液）以380cm/hr應用于裝有P〇R()S?. HQ 50 (Applied Biosystems)的陰離子交換柱。此柱之前通過以380cm/hr應用3個柱體積的平 衡液（50mM MES，150mM NaCl，pH5. 0)來平衡。導電率的范圍是16?18mS/cm。應用澄清的細 胞培養(yǎng)液之后，通過以380cm/hr應用3個柱體積洗滌液（50mM MES，150mM NaCl，pH5. 0)來 從柱洗滌任何未結(jié)合的物質(zhì)。然后將相比rlX-FP欠強烈結(jié)合的其他混雜物通過以380cm/ hr應用5個柱體積的洗滌液（50mM MES，195mM NaCl，2mM CaCl2，pH5. 0)來從柱洗滌，之后 是用 2 個柱體積的 50mM Tris-HCl，lOOmM NaCl，ρΗ8· 5 以 380cm/hr 再平衡，防止 rlX-FP 蛋白損失，所述損失會源自CaCl2的導入而存在于柱的高導電率的洗滌緩沖劑或有該效應 的某物，和最終以 380cm/hr 應用 5 個柱體積的 50mM Tris-HCl，lOOmM NaCl，10mMCaCl2， pH8. 5。然后通過以190cm/hr應用5個柱體積的洗脫液具有50mM Tris-HCl，150mM NaCl， 30mM CaCl2, pH8. 5來從柱洗脫純化的rlX-FP。
[0185] 純化的rIX-FP的洗脫和收集之后，通過以380cm/hr應用3個柱體積的50mM Tris-HC1，2M NaCl，ρΗ8· 5 來再生柱。
[0186] 【實施例lb :本發(fā)明的含有EDTA的方法】
[0187] 向澄清的細胞培養(yǎng)液在觀察下加入EDTA水平（見表1)或到5?150mM范圍的值。 然后將導電率調(diào)整到彡18mS/cm，以用由20mM Tris，pH7. 0,以與加入細胞培養(yǎng)液的相同的 濃度加 EDTA組成的稀釋緩沖劑給關(guān)于與對照樣品等價的導電率。
[0188] 當以35mM EDTA進行大規(guī)模制備（見實施例If)時，澄清的細胞培養(yǎng)液首先通過 用20mM Tris-HCl，pH7. 0稀釋來調(diào)整到彡13. 5mS/cm的導電率。然后將二鈉-EDTA添加到 此溶液到35mM的水平，使導電率回到達與未調(diào)整的對照原料可比較的水平（彡18mS/cm)。
[0189] 無論兩種方式中的任何方式，將最終溶液（裝載液）以380cm/hr應用于裝有 l*(..)R()S⑧HQ 50 (Applied Biosystems)的陰離子交換柱。此柱已之前通過以380cm/hr 應用3個柱體積的平衡液（50mM MES, lOOmM NaCl, 50mM二鈉-EDTA, ρΗ5· 0)來平衡。此平 衡緩沖劑的導電率類似于通過降低NaCl濃度的對照方法中的對應緩沖劑的導電率。
[0190] 應用調(diào)整的，含有EDTA的澄清的細胞培養(yǎng)液（裝載液）之后，通過以380cm/hr應 用3個柱體積的洗滌液（50mM MES，100mM NaCl, 50mM二鈉-EDTA, pH5. 0)來從柱洗滌任何 未結(jié)合的物質(zhì)。然后將相比rlX-FP欠強烈結(jié)合的其他混雜物通過以380cm/hr應用5個 柱體積的洗滌液（50mM MES，195mM NaCl, 2mM CaCl2, pH5. 0)之后是用2個柱體積的50mM Tris-HCl，lOOmM NaCl，pH8. 5以380cm/hr再平衡，最終是以380cm/hr應用5個柱體積的 50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM CaCl2，pH8.5 來從柱洗滌。然后通過以 190cm/hr 應用 5個柱體積的洗脫液（50mM Tris-HCl，150mM NaCl，30mM CaCl2，pH8. 5)來從柱洗脫純化的 rIX-FP。
[0191] 洗脫和收集純化的rlX-FP之后，通過以380cm/hr應用3個柱體積的50mM Tris-HC1，2M NaCl，ρΗ8· 5 來將柱再生。
[0192] 【實施例lc :CH0P清除】
[0193] 重復的對照實驗和在裝載液中以不同水平的EDTA的含有EDTA的實驗的結(jié)果顯示 于表1。此清除以圖像顯示于圖1。隨著EDTA濃度達約35mM的峰（允許一些實驗變異） CHOP清除線性地增加，過了此點未觀察到增益。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA) (Cygnus Technologies catalog#F015)定量 CHOP 水平。
[0194] 【實施例Id :聚集的或降解的形式的rIX-FP的去除】
[0195] 經(jīng)分析大小排阻層析（SEC)在高效液相層析上觀察的主要蛋白物質(zhì)顯示于表2。 含有EDTA的方法的使用顯著減少洗脫中聚集物和片段（破斷產(chǎn)物）的水平。此也可見于 圖2,其呈現(xiàn)來自對照和含有EDTA的方法的洗脫的產(chǎn)物的SEC跡。
[0196] 【實施例le :因子ΙΧα的去除】
[0197] 因子IX α是一種由在僅Argl45_Alal46活化位點切割得到的特異性蛋白水解破 斷產(chǎn)物。此形式的蛋白不可通過SEC分離，由于其經(jīng)二硫鍵連接在一起，且由此是FIX純化 中的特定問題。如顯示于圖3,通過在還原及變性條件下操作的分析毛細管電泳測量，使用 含有EDTA的方法改善此物質(zhì)的清除。
[0198] 【實施例If :rIX_FP的大規(guī)模純化】
[0199] 將500L的澄清的細胞培養(yǎng)液通過用20mM Tris-HCl，ρΗ7· 0稀釋來調(diào)整到 彡13. 5mS/cm的導電率。然后將二鈉-EDTA添加到此溶液到35mM的水平，導致導電率回到 達與未調(diào)整的原料可比較的水平（彡18mS/cm)。然后基本上如實施例lb中所述將此物質(zhì) 應用于POR()S?HQ 50。在此規(guī)模達到的宿主-細胞清除顯示于表3和圖4,將其與對 照（實施例la)方法的大規(guī)模應用中達到的進行比較。
[0200] 表1 :自對照（無添加的EDTA)和含有EDTA的實驗的實驗數(shù)據(jù)。將EDTA以各種 濃度加入澄清的細胞培養(yǎng)液。在全部含有EDTA的實驗中，平衡和裝載后洗滌緩沖劑是相同 的（50mM MES，100mM NaCl，50mM EDTA，ρΗ5· 0)。
[0201]
【權(quán)利要求】
1. 通過離子-交換層析純化目的多肽的方法，其中化合物以至少7mM的濃度加入 (a) 離子交換基質(zhì)的平衡液，其中調(diào)整平衡液，使得平衡液中的至少部分化合物由于與 離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)， 和/或 (b) 應用于離子交換基質(zhì)、且包含目的多肽的裝載液，其中調(diào)整裝載液，使得裝載液中 的至少部分化合物和至少部分目的多肽由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于 離子交換基質(zhì)， 和/或 (c) 一旦目的多肽由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而已結(jié)合于離子交換基質(zhì) 時，用于洗滌離子交換基質(zhì)的洗滌液，其中調(diào)整洗滌液，使得洗滌液中的至少部分化合物由 于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)，且使得至少部分目的多肽和 至少部分已結(jié)合的化合物，如果是在步驟（a)或（b)添加的，由于與離子交換基質(zhì)的電荷相 反的電荷而繼續(xù)結(jié)合于離子交換基質(zhì)， 由此在洗脫離子交換基質(zhì)之前，相對于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一種或更多雜質(zhì)的量， 增加結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的量，且由此導致相比以7mM以下的濃度添加化合物 的同一方法，洗出液中增加的目的多肽與一種或更多雜質(zhì)的比。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中離子交換基質(zhì)是陰離子交換基質(zhì)，而化合物具有負電荷。
3. 權(quán)利要求1和2的方法，其中化合物上的負電荷聚集。
4. 權(quán)利要求1?3的方法，其中化合物具有絡(luò)合一種或更多金屬離子的能力。
5. 權(quán)利要求1?4的方法，其中化合物選自： (a) 包含五-乙酸基和它們的各種鹽的化合物 (b) 包含四-乙酸基和它們的各種鹽的化合物 (c) 包含三-乙酸基和它們的各種鹽的化合物 (d) 包含二-乙酸基和它們的各種鹽的化合物 (e) 包含多個胺基和它們的各種鹽的化合物 (f) 包含多個氫硫基和它們的各種鹽的化合物 (g) 膦酸和其衍生物及它們的各種鹽。
6. 權(quán)利要求1?5的方法，其中雜質(zhì)包含宿主細胞蛋白和/或宿主細胞核酸和/或產(chǎn) 物-相關(guān)的混雜物和/或病毒和/或朊病毒和/或內(nèi)毒素和/或方法-相關(guān)的混雜物。
7. 權(quán)利要求1?6的方法，其中化合物是EDTA和其相應鹽或EGTA和其相應鹽。
8. 權(quán)利要求1?7的方法，其中目的多肽帶電，且其中電荷聚集。
9. 根據(jù)1?8的方法，其中目的多肽能絡(luò)合一種或更多金屬離子。
10. 權(quán)利要求1?9的方法，其中目的多肽是維生素 K-依賴性多肽。
11. 權(quán)利要求1?10的方法，其中目的多肽是FIX或FVII。
12. 權(quán)利要求1?11的方法，其中目的多肽是FIX，而雜質(zhì)包含F(xiàn)IX α。
13. 權(quán)利要求1?12的方法，其中雜質(zhì)包含宿主細胞蛋白。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中與在另外同一方法參數(shù)下不使用化合物相比，當使用化 合物時，宿主細胞蛋白的減少高于至少2倍。
15. 權(quán)利要求1的方法，其中離子交換基質(zhì)是陽離子交換基質(zhì)，而化合物帶正電。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中化合物上的正電荷聚集。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中化合物選自：具有氨基的化學結(jié)構(gòu)和/或陽離子氨基酸 聚合物，諸如四亞乙基五胺（TEPA)，二甲基吡啶胺（DPA)，聚-賴氨酸，聚-精氨酸和聚-組 氨酸。
18. 權(quán)利要求15?17的方法，其中雜質(zhì)包含宿主細胞蛋白和/或宿主細胞核酸和/或 產(chǎn)物-相關(guān)的混雜物和/或病毒和/或朊病毒和/或內(nèi)毒素和/或方法-相關(guān)的混雜物。
19. 化合物用于減少通過離子-交換層析的目的多肽純化中的雜質(zhì)的用途，其中將化 合物添加于： (a) 離子交換基質(zhì)的平衡液，其中調(diào)整平衡液，使得平衡液中的至少部分化合物由于與 離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)， 和/或 (b) 應用于離子交換基質(zhì)、且包含目的多肽的裝載液，其中調(diào)整裝載液，使得裝載液中 的至少部分化合物和至少部分目的多肽由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于 離子交換基質(zhì)， 和/或 (c) 一旦目的多肽由于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而已結(jié)合于離子交換基質(zhì) 時，用于洗滌離子交換基質(zhì)的洗滌液，其中調(diào)整洗滌液，使得洗滌液中的至少部分化合物由 于與離子交換基質(zhì)的電荷相反的電荷而結(jié)合于離子交換基質(zhì)，且使得至少部分目的多肽和 至少部分已結(jié)合的化合物，如果是在步驟（a)或（b)添加的，由于與離子交換基質(zhì)的電荷相 反的電荷而繼續(xù)結(jié)合于離子交換基質(zhì)， 由此在洗脫離子交換基質(zhì)之前，相對于結(jié)合于離子交換基質(zhì)的一種或更多雜質(zhì)的量， 增加結(jié)合于離子交換基質(zhì)的目的多肽的量，由此相比不添加化合物而進行目的多肽的純 化，導致洗出液中增加的目的多肽與一種或更多雜質(zhì)的比。
20. 權(quán)利要求19的用途，其中離子交換基質(zhì)是陰離子交換基質(zhì)，而化合物具有負電荷。
21. 權(quán)利要求19的用途，其中離子交換基質(zhì)是陽離子交換基質(zhì)，而化合物具有正電荷。
22. 權(quán)利要求19?21的用途，其中化合物上的電荷聚集。
23. 權(quán)利要求20的用途，其中化合物具有結(jié)合金屬陽離子的能力。
24. 權(quán)利要求19?24的用途，其中雜質(zhì)包含宿主細胞蛋白和/或宿主細胞核酸和/或 產(chǎn)物-相關(guān)的混雜物和/或病毒和/或朊病毒和/或內(nèi)毒素和/或方法-相關(guān)的混雜物。
25. 權(quán)利要求19?24的用途，其中化合物濃度是至少7mM。
26. 權(quán)利要求19?24的方法，其中化合物選自： (a) 包含五-乙酸基和它們的各種鹽的化合物 (b) 包含四-乙酸基和它們的各種鹽的化合物 (c) 包含三-乙酸基和它們的各種鹽的化合物 (d) 包含二-乙酸基和它們的各種鹽的化合物 (e) 包含多個胺基和它們的各種鹽的化合物 (f) 包含多個氫硫基和它們的各種鹽的化合物 (g) 膦酸和其衍生物及它們的各種鹽。
27. 權(quán)利要求19?26的用途，其中化合物是EDTA和其相應鹽或EGTA和其相應鹽。
28. 權(quán)利要求19?27的用途，其中目的多肽是能絡(luò)合金屬離子的多肽。
29. 權(quán)利要求28的用途，其中目的多肽是維生素 K-依賴性蛋白。
【文檔編號】C12N9/64GK104193798SQ201410391341
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2009年12月18日
【發(fā)明者】A·查爾頓, M·納波利, P·斯姆爾戴爾吉, A·斯托爾斯, V·皮爾扎斯, M·施羅德, I·沃克 申請人:Csl有限公司