獲得高產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的骨髓瘤細(xì)胞株的方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種獲得適用于灌流發(fā)酵生產(chǎn)工藝的高產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的方法。本發(fā)明的方法由五個(gè)階段組成：高產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得、工業(yè)規(guī)模細(xì)胞株生產(chǎn)力的評(píng)價(jià)、純化的單克隆抗體的特性分析、不同工業(yè)規(guī)模的產(chǎn)品特性評(píng)價(jià)、不同發(fā)酵時(shí)期的產(chǎn)品特性評(píng)價(jià)。這種方法的細(xì)胞株是從重組NS0骨髓瘤細(xì)胞系中獲得的，該重組NS0骨髓瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)治療癌癥的抗EGFR單克隆抗體。這種方法獲得的細(xì)胞株在不同的發(fā)酵規(guī)模、不同發(fā)酵運(yùn)行時(shí)間的條件下保持了本身的生長(zhǎng)特性、高表達(dá)特性和表達(dá)產(chǎn)物特征的一致性，適用于不同的工業(yè)規(guī)模下商業(yè)化生產(chǎn)治療性抗體。本發(fā)明的方法克服了哺乳動(dòng)物細(xì)胞系在灌流發(fā)酵工藝中產(chǎn)量降低的問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】獲得高產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的骨髓瘤細(xì)胞株的方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種獲得高產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的方法，該方 法獲得的細(xì)胞株在灌流發(fā)酵工藝中具有優(yōu)越生產(chǎn)性能，可在不同的工業(yè)規(guī)模中生產(chǎn)治療性 抗體。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前治療性抗體藥物是生物制藥的一個(gè)重要類別，一些治療性抗體已經(jīng)被批準(zhǔn) 注冊(cè)用于治療癌癥、自身免疫性疾病和其他慢性疾病，幾十種重組抗體正處于臨床開(kāi)發(fā)的 不同階段（Reichert JM, MAbs 2012，May-June, 4(3) :413_5; Reichert JM, Dhimolea E, Drug Discovery Today 2012, Sept, 17(17-18): 954-63; Biologic Medicines in Development, Phrma Report 2013, www.phrma.com)。通常患者每次劑量需要數(shù)百毫克的 治療性抗體，因此目前的產(chǎn)能需求巨大。
[0003] 重組治療性抗體是一種復(fù)雜的糖蛋白，不得不通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生 產(chǎn)（Wurm FM. Nat Biotechnology 2004， 22:1393-1398; Barnes L， Dickson A， CurrOpinBiotechnol 2006，17:381-386)。對(duì)生物制藥行業(yè)來(lái)說(shuō)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大 規(guī)模培養(yǎng)遭遇了諸多挑戰(zhàn)，雖然重組抗體在理化特性方面已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步， 但是治療性抗體分子的特性由工藝過(guò)程決定的觀念仍然被普遍接受。生產(chǎn)工藝的 任何變化，例如發(fā)酵規(guī)模、細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞傳代次數(shù)等，都可能會(huì)影響產(chǎn)品的性能 (Demonstration of comparability of human biological products, including therapeutic biotechnology-derived products, Center for Biologies Evaluation and Research (CBER), Center for Drug Evaluation and Research (CDER) April 1996. www. fda.gov ; EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substances: Quality issues (CPMP December 2003) www. emea. europa. eu ; ICH Q5E: Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process. EU: Adopted by CMPM, December 1, 2004, CPMP/ICH/5721/03, date for coming into operation: June 2005; MHLff: Adopted 26 April 2005, PFSB/ELD Notification No. 0426001; FDA: Published in the Federal Register, Vol. 70, No. 125，June 30，2005; 37861-2. www.ich.org)。
[0004] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)治療性抗體必須在無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。無(wú)蛋白培 養(yǎng)基已經(jīng)用于生物制品的生產(chǎn)，例如生產(chǎn)重組抗體的NS0細(xì)胞株已成功地在無(wú)蛋白培養(yǎng)基 PFHMII中生長(zhǎng)（W0 2004/038010 A1)。然而，適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基和在無(wú)血清培養(yǎng)基中長(zhǎng)時(shí) 間發(fā)酵通常伴隨著細(xì)胞系生產(chǎn)力的損失（Barnes L, et al·，Biotechnol Bioeng 2004， 81: 631-639)。灌流發(fā)酵生產(chǎn)工藝具有高密度培養(yǎng)及獲得高濃度抗體收獲液的潛能，然而 這種長(zhǎng)時(shí)間的高密度細(xì)胞培養(yǎng)需要穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞株來(lái)真正地優(yōu)化抗體的生產(chǎn)。
[0005] 專利ZL95118826. 7描述了一種獲得針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)的嵌合抗體和 人源化抗體的方法，及其在診斷和治療由這些受體表達(dá)的腫瘤疾病中的應(yīng)用。在本發(fā)明中， 我們?cè)趯＠鸝L95118826. 7中小鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染克隆基礎(chǔ)上，建立了一種獲得適用 于灌流發(fā)酵生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的方法。這種方法得到的細(xì)胞株是從重組NSO骨 髓瘤細(xì)胞系中獲得的，該重組NSO骨髓瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)治療癌癥的抗EGFR單克隆抗體。 這種穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞株在不同的工業(yè)規(guī)模、不同發(fā)酵時(shí)間的條件下保持了本身的生長(zhǎng)性 能、高表達(dá)特性和表達(dá)產(chǎn)物特征的一致性，適用于不同工業(yè)規(guī)模下化生產(chǎn)治療性抗體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的生產(chǎn)過(guò)程彌補(bǔ)了灌流發(fā)酵工藝中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)量降低的缺陷。本發(fā) 明的方法由以下五個(gè)階段組成： 1、 穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的重新篩選； 2、 工業(yè)規(guī)模細(xì)胞株生產(chǎn)力的評(píng)價(jià)； 3、 純化的單克隆抗體的特性分析； 4、 不同工業(yè)規(guī)模的產(chǎn)品特性評(píng)價(jià)； 5、 不同發(fā)酵時(shí)期的產(chǎn)物產(chǎn)品特性評(píng)價(jià)。
[0007] 第一步是采用有限稀釋方法獲得細(xì)胞克隆后（Freshney，R. Ian (2010). Culture of animal cells: (6th ed. ). Hoboken, N. J. : ffiley-Blackwell. pp. 208 - 211. ISBN 9780470528129 ; Davis, edited by John M (2011). Oxford: Wiley-Blackwell. pp. 239 - 240. ISBN 978047066658-6)，采用抗人 IgG 抗體偶聯(lián) FITC 進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)免疫球蛋白的染色并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)（Pluschke et al.，BMC Proceedings 2011，5 (Suppl 8) :P97)，分別在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)10天和90天后測(cè)定每個(gè)克隆的平均熒 光強(qiáng)度（MFI)和陽(yáng)性細(xì)胞百分比。在轉(zhuǎn)瓶中利用動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步特性分析，條件為 100rpm，37° C，5% 0)2細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞克隆顯示出均一的表達(dá)抗體的細(xì)胞群，平均熒光強(qiáng) 度高于1〇3,目標(biāo)產(chǎn)品比生產(chǎn)速率值（QP)高于3Χ1(Τ μ g/cell/h，選擇較好性能的細(xì)胞克 隆在工業(yè)生產(chǎn)中進(jìn)行了生產(chǎn)率評(píng)價(jià)。
[0008] 在1000L和2500L發(fā)酵罐中，采用預(yù)先選好的細(xì)胞克隆進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。灌流發(fā)酵 工藝中采用90%以上活力的細(xì)胞接種。運(yùn)行參數(shù)為37°C，5% C02，恒定的氧分壓和葡萄糖 濃度，細(xì)胞灌流濃度保持在（10-20) X 106cell/mL，灌流速率升高到0. 8WD，細(xì)胞培養(yǎng)90天 后終止灌流工藝。發(fā)酵運(yùn)行過(guò)程中監(jiān)測(cè)存活細(xì)胞數(shù)和抗體濃度。目標(biāo)抗體濃度為200 μ g/ ml以上。
[0009] 發(fā)酵的下游工藝是通過(guò)基于兩個(gè)主要分離色譜步驟的標(biāo)準(zhǔn)純化步驟來(lái)進(jìn)行的：蛋 白A親和層析與離子交換色譜?？贵w純化工藝的目標(biāo)平均產(chǎn)量大約為200 mg/L -300mg/L， 純度大于95%。
[0010] 采用的參考品來(lái)自于純化的抗體，經(jīng)如下的分析技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的特性分析：

【權(quán)利要求】
1. 一種獲得高產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)重組抗體的骨髓瘤細(xì)胞的方法，所述方法用于工業(yè)規(guī)模中生 產(chǎn)治療抗體，其特征在于，所述的方法包括五個(gè)階段： (1) 1?廣穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得； (2) 工業(yè)規(guī)模上細(xì)胞克隆產(chǎn)量的評(píng)價(jià)； (3) 純化的單克隆抗體的特性分析； (4) 不同工業(yè)規(guī)模上產(chǎn)品特性的評(píng)價(jià)； (5) 不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)物產(chǎn)品特性的評(píng)價(jià)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（1)中包括以下步驟： (1) 選擇細(xì)胞內(nèi)免疫球蛋白染色呈現(xiàn)單峰的細(xì)胞克隆，且平均熒光強(qiáng)度大于1〇3 ; (2) 轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)進(jìn)一步動(dòng)力學(xué)研究，選擇比生產(chǎn)率高于3X 1(Γ7μ g /cell/h細(xì)胞克隆。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（2)包括以下步驟： (1) 在1000L工業(yè)規(guī)模灌流發(fā)酵運(yùn)行90天，通過(guò)測(cè)量90 %以上活力的活細(xì)胞濃度和最 大值高于200 μ g /ml時(shí)免疫球蛋白濃度評(píng)價(jià)所選克隆的生產(chǎn)能力； (2) 在2500L工業(yè)規(guī)模灌流發(fā)酵運(yùn)行90天，通過(guò)測(cè)量90%以上活力的活細(xì)胞濃度和最 大值高于200 μ g /ml時(shí)免疫球蛋白濃度評(píng)價(jià)所選克隆的生產(chǎn)能力。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（3)包括以下步驟： (1) 采用蛋白A-親和層析和離子交換層析從發(fā)酵收獲液中純化抗體，所述抗體的平均 產(chǎn)量為200 mg/L - 300mg/L，純度大于95% ; (2) 使用下列分析技術(shù)對(duì)參考品進(jìn)行特性分析：質(zhì)譜法測(cè)定氨基酸序列及翻譯后修飾， 質(zhì)譜法檢測(cè)分子量，高壓液相法分析肽圖圖譜及糖基化組成，弱陽(yáng)離子交換色譜法測(cè)定電 荷異質(zhì)性，表面等離子體共振法測(cè)定親和性，分析超速離心法分析沉降系數(shù)及分子量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（4)包括以下步驟： (1) 評(píng)價(jià)1000L和2500L發(fā)酵規(guī)模的產(chǎn)品樣品的肽圖圖譜、電荷異質(zhì)性和糖基化修飾； (2) 與參考品進(jìn)行可比性分析，顯示無(wú)顯著差異。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（5)包括以下步驟： (1) 隨著發(fā)酵的運(yùn)行，評(píng)價(jià)不同細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)期產(chǎn)物的分子量質(zhì)譜數(shù)據(jù)、肽圖譜、弱陽(yáng)離 子交換色譜法測(cè)定的電荷異質(zhì)性、糖基化組成、分析超速離心法分析的沉降系數(shù)和分子量、 表面等離子體共振法測(cè)定的親和性； (2) 與參考品進(jìn)行可比性分析，顯示無(wú)顯著差異。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，所述的骨髓瘤細(xì)胞系為NS0細(xì)胞系。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述NS0細(xì)胞系生產(chǎn)抗EGFR hR3抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，選擇使用NSO細(xì)胞系中穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞克隆，命名 為2025/M031212,所述細(xì)胞克隆2025/M031212可制備以治療為目的的人源化單克隆抗體 hR3。
10. -種人源化單克隆抗體hR3的制備方法，所述方法包括使用權(quán)利要求9所述的細(xì)胞 克隆2025/M031212在不同工業(yè)規(guī)模進(jìn)行灌流發(fā)酵工藝。
11. 一種包含人源化單克隆抗體hR3的藥物活性成分，所述藥物活性成分利用權(quán)利要 求10所述的方法制備。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104152415SQ201410395389
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】路明, 喻志愛(ài), 何偉, 蔡楊柳, 米蓋爾, 林峰, 美林, 胡里奧, 羅蘭多 申請(qǐng)人:百泰生物藥業(yè)有限公司, 分子免疫中心