利用碳納米管穩(wěn)定酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了酶活性、嗜熱穩(wěn)定性以及嗜冷穩(wěn)定性增強(qiáng)的酶組合物。另外，本發(fā)明提供了制備和使用的方法和試劑盒。
【專利說明】利用碳納米管穩(wěn)定酶
[0001] 本申請(qǐng)要求于2013年8月9日提交的印度專利申請(qǐng)第941/K0L/2013號(hào)的優(yōu)先權(quán)， 其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及酶活性增強(qiáng)的酶組合物以及制備和使用所述酶組合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 為了幫助讀者理解本發(fā)明，提供了下述描述。不應(yīng)將所提供的信息或引用的參考 文獻(xiàn)都視為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0004] 近年來，酶的生物催化用途急劇增長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈冊(cè)谏鷳B(tài)上是適當(dāng)?shù)模哂懈咛禺?性，表現(xiàn)出化學(xué)-部位-互變選擇性，并且具有廣泛多樣的反應(yīng)。而且，就養(yǎng)分、pH、溫度以 及通風(fēng)而言，很容易地在生物反應(yīng)器中控制獲得酶和優(yōu)化酶生產(chǎn)的條件。
[0005] 在過去的十年中，能夠經(jīng)受嚴(yán)厲條件的酶的工業(yè)應(yīng)用，已經(jīng)極大地增加。這主要是 由于從嗜極端微生物發(fā)現(xiàn)了新酶的緣故。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明通常涉及將酶截留于脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化 碳納米管中，以增強(qiáng)酶的活性。在一些實(shí)施方案中，將納米顆粒與酶截留于脂質(zhì)功能化石墨 烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管中。
[0008] -方面，本發(fā)明提供了具有一種或多種脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或 脂質(zhì)功能化碳納米管和至少一種被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳 納米管截留但不與之連接的酶的酶組合物，其中，與對(duì)照酶相比，組合物中的截留酶的活性 增強(qiáng)。
[0009] -方面，本發(fā)明提供了截留酶的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使脂質(zhì) 功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管和至少一種酶在混合物中、在適 合將酶截留于脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管中的條件下接 觸，并對(duì)混合物進(jìn)行聲波處理。
[0010] 一方面，本發(fā)明提供了處理底物的方法，所述方法包括使第一底物與酶組合物接 觸，所述酶組合物包括脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管和至 少一種截留酶，其中所述酶被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米 管截留，但不與其連接，且其中，與對(duì)照酶相比，所述酶組合物中的截留酶的活性增強(qiáng)。
[0011] 一方面，本發(fā)明提供了試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括具有脂質(zhì)功能 化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管的第一容器盒具有至少一種酶的第二 容器。
[0012] 一方面，本發(fā)明提供了具有酶組合物的試劑盒，其中所述酶組合物包括脂質(zhì)功能 化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管和至少一種被脂質(zhì)功能化石墨烯、月旨 質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管截留但不與其連接的酶，其中與對(duì)照酶相比，所述 組合物中的截留酶的活性增強(qiáng)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1A和1B是分別說明在4°C和80°C下以下酶活性的圖：作為無NP或SWCNT的純 酶的果膠酶（對(duì)照），未截留的果膠酶和SWCNT(nanorope)，截留的果膠酶和SWCNT(SWCNT)， 果膠酶和NP、無SWCNT(NP)，未截留的果膠酶和NP以及SWCNT(NP+NR)，以及截留的果膠酶 和NP以及SWCNT(NP+SWCNT)。
[0014] 圖2A和2B是分別在4°C和80°C下比較以下酶活性的圖：作為無NP或SWCNT的 純酶的漆酶（對(duì)照），未截留的漆酶和SWCNT(nanorope)，截留的漆酶和SWCNT(SWCNT)，漆 酶和NP、無SWCNT(NP)，未截留的漆酶和NP以及SWCNT(NP+NR)，以及截留的漆酶和NP以及 SWCNT(NP+SWCNT) 〇
[0015] 圖3A和3B是分別在4°C和80°C下比較以下酶活性的圖：作為無NP或SWCNT的純 酶的蛋白酶（對(duì)照），未截留的蛋白酶和SWCNT(nanorope)，截留的蛋白酶和SWCNT(SWCNT)， 蛋白酶和NP、無SWCNT(NP)，未截留的蛋白酶和NP以及SWCNT(NP+NR)，以及截留的蛋白酶和 NP以及SWCNT(NP+SWCNT)。
[0016] 圖4A和4B是分別在4°C和80°C下比較以下酶活性的圖：作為無NP或SWCNT 的純酶的纖維素酶（對(duì)照），未截留的纖維素酶和SWCNT(nanorope)，截留的纖維素酶和 SWCNT(SWCNT)，纖維素酶和NP、無SWCNT(NP)，未截留的纖維素酶和NP以及SWCNT(NP+NR)， 以及截留的纖維素酶和NP以及SWCNT(NP+SWCNT)。
[0017] 圖5A和5B是分別在4°C和80°C下比較以下酶活性的圖：作為無NP或SWCNT 的純酶的木聚糖酶（對(duì)照），未截留的木聚糖酶和SWCNT(nanorope)，截留的木聚糖酶和 SWCNT(SWCNT)，木聚糖酶和NP無SWCNT(NP)，未截留的木聚糖酶和NP以及SWCNT(NP+NR)， 以及截留的木聚糖酶和NP以及SWCNT(NP+SWCNT)。
[0018] 圖6A和6B是分別在4°C和80°C下比較SWCNT截留或未截留的果膠酶酶活性的圖。
[0019] 圖7A和7B是分別在4°C和80°C下比較多輪使用后SWCNT截留或未截留的漆酶酶 活性的圖。
[0020] 圖8A和8B是分別在4°C和80°C下比較多輪使用后SWCNT截留或未截留的蛋白酶 酶活性的圖。
[0021] 圖9A和9B是分別在4°C和80°C下比較多輪使用后SWCNT截留或未截留的纖維素 酶酶酶活性的圖。
[0022] 圖10A和10B是分別在4°C和80°C下比較多輪使用后SWCNT截留或未截留的木聚 糖酶酶活性的圖。
[0023] 圖11A和11B分別在4°C和80°C下比較SWCNT中截留或未截留的果膠酶酶活性的 時(shí)間動(dòng)力學(xué)的圖。
[0024] 圖12A和12B是分別在4°C和80°C下比較SWCNT中截留或未截留的漆酶酶活性的 時(shí)間動(dòng)力學(xué)的圖。
[0025] 圖13A和13B是分別在4°C和80°C下比較SWCNT中截留或未截留的蛋白酶酶活性 的時(shí)間動(dòng)力學(xué)的圖。
[0026] 圖14A和14B是分別在4°C和80°C下比較SWCNT中截留或未截留的纖維素酶酶活 性的時(shí)間動(dòng)力學(xué)的圖。
[0027] 圖15A和15B是分別在4°C和80°C下比較SWCNT中截留或未截留的木聚糖酶酶活 性的時(shí)間動(dòng)力學(xué)的圖。
[0028] 圖16 (A-E)是比較酶凍融周期后SWCNT截留或未截留酶的酶活性的圖。酶表示如 下：(A)果膠酶；(B)漆酶；(C)蛋白酶；(D)纖維素酶；以及（E)木聚糖酶。
[0029] 圖17是SWCNT截留酶的示意圖。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 在下面的詳細(xì)描述中，參考附圖，附圖形成了描述的一部分。在附圖中，相似的符 號(hào)通常標(biāo)示相似的組分，除非上下文另有說明。詳細(xì)描述、附圖以及權(quán)利要求書中的示例性 實(shí)施方案，并非表示限制性的。在不背離本發(fā)明主題實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可以利用其他實(shí) 施方案，并且可以進(jìn)行其他改變。
[0032] 本文公開了與穩(wěn)定的嗜冷或嗜溫酶的制造和使用相關(guān)的組合物和方法。在一些 實(shí)施方案中，本文公開的酶組合物和方法包括（1)至少一種嗜冷酶、嗜溫酶或其組合；以及 (2)多種脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管，其中嗜冷酶或嗜 溫酶被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管截留，但不與脂質(zhì)功 能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管連接。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè) 納米顆粒與酶被截留于脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管中， 酶與納米顆粒接觸但不與其連接。
[0033] 本說明書和后附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式"一個(gè)/種（a) "、"一個(gè)/種（an) "和 "所述的/該（the)"包括指代物的復(fù)數(shù)形式，除非上下文另一明確說明。例如提到"細(xì)胞（a cell) "包括兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的組合物等。
[0034] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本文所用的"約"，并且取決于其所用的上下文，其 會(huì)在一定程度上發(fā)生改變。如果使用了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不清楚的術(shù)語，考慮到其所用 的上下文，"約"應(yīng)表示該特定術(shù)語加或減10%。
[0035] 在嗜冷酶或嗜溫酶語境中，本文所用的"底物"指酶所作用的分子或一組分子。酶 催化涉及底物的化學(xué)反應(yīng)。底物結(jié)合嗜冷酶或嗜溫酶的活性位點(diǎn)，并形成酶-底物復(fù)合物。 底物轉(zhuǎn)化成一種或多種產(chǎn)物，隨后所述產(chǎn)物可以從活性位點(diǎn)釋放。
[0036] 在酶的語境下，本文所用的術(shù)語"活性增強(qiáng)"或"活性提高"，指與合適的對(duì)照酶相 t匕，每單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物的數(shù)量提高或增加。在一些實(shí)施方案中，與相同標(biāo)準(zhǔn)條 件下的對(duì)照酶相比，對(duì)于特定類型的酶而言，可以在"最佳"或"標(biāo)準(zhǔn)條件"（例如標(biāo)準(zhǔn)pH、 標(biāo)準(zhǔn)溫度、標(biāo)準(zhǔn)底物等）下，表現(xiàn)出酶活性的增強(qiáng)。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，與相 同條件下的對(duì)照酶相比或與標(biāo)準(zhǔn)條件下的對(duì)照酶下相比，對(duì)于特定類型的酶而言，可以在 非標(biāo)準(zhǔn)條件（例如在較高或較低的溫度下、在較高或較低的pH下、非最佳底物等n)下，表 現(xiàn)出活性增強(qiáng)。作為實(shí)例但并非限制，本文公開了與至少一個(gè)納米顆粒接觸但不與其連接 的嗜冷酶，其中酶和納米顆粒兩者被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化 碳納米管截留但不與其連接，其中與對(duì)照嗜冷酶（例如不與至少一個(gè)納米顆粒接觸且不被 碳納米管截留的相同類型的嗜冷酶，其中在與和納米顆粒接觸且被碳納米管截留的嗜冷 酶相同的溫度、緩沖液、pH、底物等條件下，評(píng)估對(duì)照酶的活性），嗜冷酶的活性增強(qiáng)。
[0037] 在嗜冷酶或嗜溫酶的語境中，本文所用的"半壽期提高"或"半壽期增加"指，與對(duì) 照酶相比，嗜冷酶或嗜溫酶可以保留其50%活性的時(shí)間量的提高或增加。
[0038] 在酶的語境中本文所用的"嗜冷穩(wěn)定性增強(qiáng)"或"嗜冷穩(wěn)定性提高"指，與合適的 對(duì)照酶相比，在"正常"或"標(biāo)準(zhǔn)"溫度或溫度范圍外的低溫或低溫范圍下，給定酶的結(jié)構(gòu)和 /或功能完整性和/或酶活性的增強(qiáng)或提高。作為實(shí)例而非限制，在本文公開的組合物和 方法的一些實(shí)施方案中，與至少一個(gè)納米顆粒接觸但不與其連接的嗜冷酶，其中酶和納米 顆粒兩者都被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管截留但不與其 連接，與對(duì)照嗜冷酶（例如不與至少一個(gè)納米顆粒接觸且不被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功 能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管截留的嗜冷酶）相比，在約2°C-15°C，或在約2°C、3°C、 41：、51：、61：、71：、81：、91：、101：、111：、121：或131：、141：或151：下，表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性 和/或活性。
[0039] 在酶的語境下，本文所用的"熱穩(wěn)定性增強(qiáng)"或"熱穩(wěn)定性提高"或"耐溫性增強(qiáng)" 指與合適的對(duì)照酶相比，在"正常"或"標(biāo)準(zhǔn)"溫度或溫度范圍外的高溫或高溫范圍下，給定 酶的結(jié)構(gòu)和/或功能完整性和/或酶活性的增強(qiáng)或提高。作為實(shí)例而非限制，在本文公開的 組合物和方法一些實(shí)施方案中，與至少一個(gè)納米顆粒接觸的嗜冷酶，其中酶和納米顆粒兩 者被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管截留，但不與其連接，與 對(duì)照嗜冷酶（例如不與至少一個(gè)納米顆粒接觸且不被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒 烯或脂質(zhì)功能化碳納米管截留的嗜冷酶）相比，在約35°C至80°C或在約35°C、37°C、40°C、 42°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C或約80°下，表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性和/或活 性。
[0040] 本文所用的術(shù)語"處理酶"、"截留酶"、"處理酶組合物"和"酶組合物"指本發(fā)明的 組合物，包括被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管截留但不與 其連接的酶。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語處理酶、截留酶以及酶組合物指本發(fā)明的組合物，包 括與至少一個(gè)納米顆粒接觸但不與其連接的酶，其中酶和納米顆粒兩者都被脂質(zhì)功能化石 墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管截留，但不與其連接。
[0041] 本文所用的"對(duì)照嗜冷酶"、"對(duì)照嗜溫酶"或"對(duì)照酶"具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所知 的含義，并且其必定依賴于例如待評(píng)估的酶活性或條件方面。通常將對(duì)照或?qū)φ彰副茸鳒y(cè) 試酶（例如已經(jīng)以某些方式修飾或處理的酶）。對(duì)照和測(cè)試酶通常是相同類型的酶，并且來 源于相同的來源。對(duì)照酶不會(huì)經(jīng)歷"修飾"或"處理"（例如不會(huì)與納米顆粒接觸，或不會(huì)位 于包含納米顆粒的組合物中，或不會(huì)位于被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì) 功能化碳納米管截留的組合物中），但會(huì)評(píng)價(jià)其在與"修飾"酶或"處理"酶相同的條件下的 酶活性、pH耐受性、耐溫性、半壽期等。因此，可以確定"修飾"或"處理"的效果。在一些實(shí) 施方案中，"修飾"或"處理"用脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米 管截留酶，其中酶不與脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管連接。 在一些實(shí)施方案中，截留酶與至少一個(gè)納米顆粒接觸，但不與其連接。
[0042]本文所用的短語"但不與......連接"指分子之間的相互作用，所述相互作用不 會(huì)導(dǎo)致一個(gè)連接伴侶與另一連接伴侶固定的固定，和/或不會(huì)產(chǎn)生一個(gè)連接伴侶與另一連 接伴侶的永久性附著，和/或不會(huì)使一個(gè)連接伴侶與另一連接伴侶結(jié)合。作為實(shí)例而非限 制，"被脂質(zhì)功能化碳納米管截留但不與脂質(zhì)功能化碳納米管連接的酶"指缺少或缺乏分子 間鍵，所述分子間鍵導(dǎo)致酶固定于脂質(zhì)功能化碳納米管上，使酶永久性附著于脂質(zhì)功能化 碳納米管，或使酶與脂質(zhì)功能化碳納米管結(jié)合。另外，參考"酶與納米顆粒接觸但不與納米 顆粒連接"，'不與......連接"表示缺少或缺乏分子間鍵，所述分子間鍵導(dǎo)致納米顆粒固 定于酶上或使納米顆粒永久性附著于酶。
[0043] 本文所用術(shù)語"納米顆粒"指最大尺寸位于納米范圍內(nèi)的任何顆粒，和/或其中 顆粒的平均大小在納米范圍內(nèi)。例如，在一些實(shí)施方案中，納米顆粒的最大尺寸，或包含于 組合物中的多個(gè)納米顆粒的平均尺寸，小于l〇〇〇nm，例如約999nm、約900nm、約800nm、約 700nm、約 600nm、約 500nm、約 400nm、約 350nm、約 300nm、約 200nm、約 100nm，或?yàn)檫@些數(shù)值 中任意兩個(gè)之間的范圍。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，納米顆粒的最大尺寸或多個(gè)納 米顆粒的平均大小為例如約100nm、約90nm、約80nm、約70nm、約60nm、約50nm、約25nm、約 20nm、約10nm、約5nm、約3nm、約2nm、約lnm或更小，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍。
[0044] 本文所用的術(shù)語"蛋白酶（protease) "（也稱為肽酶或蛋白酶（proteinase))指 執(zhí)行蛋白水解即通過水解將氨基酸在多肽鏈中連接在一起形成蛋白的肽鍵開始蛋白分解 代謝的酶。
[0045] 本文所用的"嗜冷酶"指在約0°C至約30°C具有最佳功能或活性的酶。在一些實(shí) 施方案中，嗜冷酶在約10°c的溫度下具有最佳功能或活性。
[0046] 本文所用的"嗜溫酶"指在約20°C制約45°C具有最佳功能或活性的酶。
[0047]I?酶組合物
[0048] 本文公開了包含被脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管 截留但不與其連接的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶包含至少一種嗜冷酶、 嗜溫酶或其組合。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)納米顆粒與酶被截留于脂質(zhì)功能化石墨烯、 脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米管中，但不與其連接。在一些實(shí)施方案中，與合適的 對(duì)照酶相比，組合物中的酶可以表現(xiàn)出活性增強(qiáng)、耐溫性增強(qiáng)、半壽期提高中的一種或多種 特性。
[0049]A.嗜冷酶
[0050] 本發(fā)明不受嗜冷酶的類型或酶的來源的限制。在一些實(shí)施方案中，嗜冷酶可以分 離自天然來源（例如分離自嗜冷原核或真核生物，如細(xì)菌或霉菌），或可以重組制備。在一 些實(shí)施方案中，嗜冷酶可以是"野生型"，或可以是突變體，或與野生型酶相比可以包括一個(gè) 或多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失。
[0051] 可以用于本文公開的組合物和方法中的嗜冷酶的非限制性實(shí)例包括果膠酶、漆 酶、木聚糖酶、纖維素酶以及其組合。
[0052] B.嗜溫或嗜熱酶
[0053] 本文公開的蛋白酶可以是嗜溫或嗜熱的，或可以分離自天然來源（例如分離自原 核或真核生物，如細(xì)菌、酵母、霉菌等），或可以重組制備。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶可以 是"野生型"，或可以是突變體，或與野生型酶相比，可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、添加 或缺失。
[0054] C.碳納米管和其他碳結(jié)構(gòu)
[0055] 本發(fā)明的基于納米管和碳結(jié)構(gòu)的截留方法，相對(duì)于常規(guī)的酶固定方法具有許多優(yōu) 勢(shì)。作為實(shí)例而非限制，以膠體樣狀態(tài)懸浮本發(fā)明的酶，并且有效活性表面積高。另外，本 文公開的基于納米管的截留方法允許常規(guī)固定技術(shù)并不能提供的通用（交叉酶）復(fù)用性。 在酶使用后，易于收獲酶，對(duì)于所選的生物加工活性而言，這使得本文公開的方法和組合物 經(jīng)濟(jì)。
[0056] 在一些實(shí)施方案中，熒光素酶組合物包括至少一種被脂質(zhì)功能化石墨烯或脂質(zhì)功 能化富勒烯截留但不與其連接的熒光素酶。石墨烯和富勒烯是碳同素異形體。同素異形體 是一些化學(xué)元素以兩種或多種形式存在的特性。石墨烯可以堆積，其包含以規(guī)則的六邊形 模式排列的碳原子。富勒烯是完全有碳原子構(gòu)成的、中空球形或管狀的任何分子。富勒烯 的實(shí)例包括但不限于巴基球（buckyball)(球形富勒烯）和碳納米管（圓柱形富勒烯）。
[0057] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，熒光素酶被脂質(zhì)功能化碳納米管截留但不與其連 接。碳納米管的實(shí)例包括但不限于單壁碳納米管（SWCNT)、雙壁碳納米管或多壁碳納米管。 在一些實(shí)施方案中，碳納米管是用脂質(zhì)功能化的固態(tài)。
[0058] 用于功能化石墨烯、富勒烯以及碳納米管的脂質(zhì)包括但不限于磷脂、鞘脂、鞘磷脂 以及類固醇。通常，在本發(fā)明所用的脂質(zhì)上存在兩個(gè)脂肪酸部分：長(zhǎng)鏈部分和短鏈部分。
[0059] 在一些實(shí)施方案中，短鏈脂質(zhì)的鏈長(zhǎng)為2個(gè)碳（"C"）至10個(gè)碳（"C")。在一些 實(shí)施方案中，短鏈的長(zhǎng)度為2C至8C。在一些實(shí)施方案中，短鏈的長(zhǎng)度為2C、3C、4C、5C、6C、 7C、8C、9C或10。在一些實(shí)施方案中，長(zhǎng)鏈脂質(zhì)的長(zhǎng)度為14-22C。在一些實(shí)施方案中，長(zhǎng)鏈 的長(zhǎng)度為 14C、15C、16C、17C、18C、19C、20C、21C或 22C。
[0060] 在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)長(zhǎng)鏈脂質(zhì)（例如22C)允許碳納米管截留較大的酶。 例如，至少一個(gè)鏈更長(zhǎng)的脂質(zhì)導(dǎo)致更大的納米籠（nano-cage)。相反，例如，鏈長(zhǎng)較短的脂質(zhì) (例如14C)導(dǎo)致更緊的納米籠，其可以截留較小的復(fù)合體，但是不能截留大復(fù)合體。
[0061] 在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)與碳納米管的比例（wt/wt)為約6 : 1或約5 : 1或月 4 : 1或約3 : 1或約2 : 1。
[0062] 在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)功能化碳納米管在管的一末端具有極性頭部。在另一實(shí) 施方案中，脂質(zhì)功能化碳納米管在管的兩個(gè)末端具有極性頭部。
[0063]功能化納米管的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如Bhattacharyya et al.， Nanotechnology，23(2012) ;385304 (8pp)。
[0064] D?納米顆粒
[0065] 在本文描述的幾個(gè)示例性實(shí)施方案中提供的納米顆粒指最大尺寸在納米范圍內(nèi) 的任何顆粒，和/或在組合物含有多個(gè)納米顆粒的情況下，本文所述的尺寸可以指多個(gè)納 米顆粒個(gè)體尺寸的平均值。例如，在一些實(shí)施方案中，納米顆粒的最大尺寸小于lOOOnm，例 如約 999nm、約 900nm、約 800nm、約 700nm、約 600nm、約 500nm、約 400nm、約 350nm、約 300nm、 約200nm、約100nm，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍。另外或可選地，在一些實(shí)施方案 中，納米顆粒的最大尺寸為例如約l〇〇nm，例如約90nm、約80nm、約70nm、約60nm、約50nm、 約25nm、約20nm、約10nm、約5nm、約3nm、約2nm、約lnm或更小，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè) 之間的范圍。
[0066] 如上文所指出的，尺寸可以指例如顆粒的最大尺寸。另外或可選地，尺寸可以指顆 粒的最小尺寸。顆?？梢跃哂腥魏涡螤?。例如，一些實(shí)施方案的納米顆?？梢灾钢辽倩旧?是球形的顆粒。另外或可選地，納米顆?？梢詾闄E圓形、管狀或不規(guī)則形狀。取決于形狀， 本文所述的尺寸可以指直徑、半徑、寬度、長(zhǎng)度、高度、對(duì)角線等中的任一種。同樣，在組合物 含有多個(gè)納米顆粒的情況中，本文所述的尺寸可以指多個(gè)納米顆粒個(gè)體尺寸的平均值。例 如，在一些實(shí)施方案中，多個(gè)納米顆粒個(gè)體尺寸的平均值為約lOOOnm、約999nm、約900nm、 約 800nm、約 700nm、約 600nm、約 500nm、約 400nm、約 300nm、約 200nm、約lOOnm，或?yàn)檫@些數(shù) 值中任意兩個(gè)之間的范圍。另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，多個(gè)納米顆粒個(gè)體尺寸的平 均值為例如約l〇〇nm、約 90nm、約 80nm、約 70nm、約 60nm、約 50nm、約 25nm、約 20nm、約 10nm、 約5nm、約3nm、約2nm、約lnm，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍 [0067] 在一些實(shí)施方案中，納米顆粒的形狀至少基本上是球形，并且其直徑為約2nm至 約 500nm、約 10nm至約 500nm、約 25nm至約 500nm、約 50nm至約 400nm、約 100nm至約 400nm、 約 80nm至約 100nm。
[0068] 在一些實(shí)施方案中，截留酶組合物含有納米顆粒。納米顆粒與酶接觸，但是納米顆 粒不與酶連接。納米顆粒的實(shí)例包括但不限于氧化亞銅、羥磷灰石（HAp)、氯化鎂、氯化錳、 氯化鈣、鋅、鎂、錳或其組合。
[0069] II?酶組合物的特征
[0070] 本文公開的方法對(duì)嗜冷酶或嗜溫酶的截留導(dǎo)致酶活性增強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中， 酶（例如嗜冷酶或嗜溫酶）的截留導(dǎo)致下述中的一種或多種：酶活性增強(qiáng)、pH耐受性增強(qiáng)、 耐溫性增強(qiáng)、半壽期提高，和/或經(jīng)受多輪凍融循環(huán)并維持給定水平的活性的能力。在一些 實(shí)施方案中，至少一個(gè)納米顆粒與酶一起也被截留于脂質(zhì)功能化碳納米管中，但是納米顆 粒不與酶或脂質(zhì)功能化碳納米管連接。
[0071] 1.嗜熱或嗜冷穩(wěn)定性增強(qiáng)
[0072] 在一些實(shí)施方案中，利用嗜熱穩(wěn)定性或嗜冷穩(wěn)定性測(cè)定酶活性增強(qiáng)。嗜冷酶適于 在約0°C至約30°C的低溫下具有高活性。另外，嗜冷酶通常比嗜溫副本（counterpart)具 有更高的特異性。然而，嗜冷酶在較高的溫度下變性并喪失其酶活性。與對(duì)照嗜冷酶相比， 在較高的溫度下，本發(fā)明的截留嗜冷酶的嗜熱穩(wěn)定性提高且酶活性更高。
[0073] 嗜溫酶在高溫（例如高于約60°C)下也變性，這會(huì)導(dǎo)致嗜溫酶活性降低。與對(duì)照 嗜溫酶相比，在較高的溫度下，本發(fā)明的截留嗜溫酶的嗜熱穩(wěn)定性提高且酶活性更高。
[0074] 在一些實(shí)施方案中，截留嗜冷酶或嗜溫酶的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)或提高指在約35°C至約 80°C、約45°C至約70°C或約55°C至約60°C的溫度范圍下的酶活性。在一些實(shí)施方案中， 在截留嗜冷或嗜溫酶熱穩(wěn)定性語境下，參照溫度為約35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、 55°C、60°C、65°C、70°C、75°C或80°C，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍。
[0075] 本發(fā)明還增強(qiáng)了嗜冷酶和嗜溫酶的嗜冷穩(wěn)定性。盡管嗜冷酶在較低的溫度例如低 于l〇°C具有酶促活性，然而，與對(duì)照嗜冷酶相比，用納米顆粒將嗜冷酶截留于脂質(zhì)功能化碳 納米管中，增強(qiáng)了嗜冷酶的酶活性。
[0076] 通常，嗜溫酶的最佳酶活性溫度為約25°C至約45°C。如上文所指出的，許多嗜溫 酶在高溫（例如高于約60°C)下變性，這導(dǎo)致嗜溫酶活性降低。當(dāng)溫度變得太低，例如低于 約25°C，嗜溫酶也喪失酶活性。與對(duì)照嗜溫酶相比，用納米顆粒將嗜溫酶截留于脂質(zhì)功能 化碳納米管中增強(qiáng)了嗜溫酶的嗜冷穩(wěn)定性。
[0077] 在一些實(shí)施方案中，嗜冷或嗜溫酶嗜冷穩(wěn)定性的增強(qiáng)指在約4°C至約30°C或約 8°C至約20°C、約12°C至約16°C溫度下的酶活性。在一些實(shí)施方案中，在截留嗜冷酶或嗜溫 酶嗜冷穩(wěn)定性語境中，參照溫度為約4°C、8°C、12°C、16°C、20°C、24°C、28°C或30°C，或?yàn)檫@ 些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍。
[0078] 2?增強(qiáng)的酶活性和半壽期
[0079] 另外或可選地，在一些實(shí)施方案中，通過以下方式測(cè)定嗜冷或嗜溫酶的活性增強(qiáng) 或提高：最大反應(yīng)速度（Vmax)的增加、轉(zhuǎn)換數(shù)即每單位時(shí)間內(nèi)每一酶位點(diǎn)將底物轉(zhuǎn)換為產(chǎn) 物的數(shù)量的增加，和/或底物親和性增加，例如米歇利斯常數(shù)（Km)的降低，活化能（Ea)的 降低，或其組合。
[0080] 在一些實(shí)施方案中，與對(duì)照嗜冷或嗜溫酶相比，截留嗜冷酶或嗜溫酶的半壽期更 長(zhǎng)和/或衰變常數(shù)更低。在一些實(shí)施方案中，更長(zhǎng)的半壽期和/或較低的衰變常數(shù)提高截 留酶的生產(chǎn)力，因?yàn)樵诼L(zhǎng)的反應(yīng)過程中，酶將活性保持更長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間。
[0081] 在一些實(shí)施方案中，與對(duì)照酶酶活性的長(zhǎng)度相比，本發(fā)明的截留嗜冷酶或嗜溫酶 將酶活性保持更長(zhǎng)的時(shí)期。在一些實(shí)施方案中，截留酶組合物將酶活性保持約1. 5小時(shí)至 約7小時(shí)，或約2小時(shí)至約6.5小時(shí)，或約3小時(shí)至約6小時(shí)，或約3. 5小時(shí)至約5. 5小時(shí)， 或約4小時(shí)至約5小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，截留酶酶活性的持續(xù)時(shí)間為約1. 5小時(shí)、2小 時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)，或7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)，或?yàn)?這些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，截留酶酶活性的持續(xù)時(shí)間為約12小 時(shí)、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍
[0082] 在一些實(shí)施方案中，在約4°C至約30°C或約8°C至約20°C、約12°C至約16°C的溫 度下，觀察到，與對(duì)照酶相比，截留酶酶活性持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，在延長(zhǎng)的 嗜冷穩(wěn)定性語境中的溫度為約4°C、8°C、12°C、16°C、20°C、24°C、28°C或30°C，或?yàn)檫@些數(shù) 值中任意兩個(gè)之間的范圍。
[0083] 在一些實(shí)施方案中，在約35°C至約80°C、約45°C至約70°C或約55°C至約60°C的 溫度下，觀察到與對(duì)照酶相比，截留酶酶活性持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，在延 長(zhǎng)的熱穩(wěn)定性的語境中的溫度為約35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、 70°C、75°C或80°C，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍。
[0084] 3.凍融循環(huán)后酶的穩(wěn)定化
[0085] 在一些實(shí)施方案中，與對(duì)照酶相比，在三個(gè)或更多個(gè)凍融循環(huán)后，截留酶酶活性增 強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，截留酶維持酶活性高達(dá)4個(gè)凍融循環(huán)或5個(gè)凍融循環(huán)或6個(gè)凍融 循環(huán)或7個(gè)凍融循環(huán)或8個(gè)凍融循環(huán)或9個(gè)凍融循環(huán)。在一些實(shí)施方案中，截留酶維持酶 活性約9個(gè)凍融循環(huán)至約30個(gè)凍融循環(huán)，或約12個(gè)凍融循環(huán)至約27個(gè)凍融循環(huán)，或約15 個(gè)凍融循環(huán)至約24個(gè)凍融循環(huán)，或約18個(gè)凍融循環(huán)至約21個(gè)凍融循環(huán)。
[0086]III?截留酶和納米顆粒的方法
[0087] 在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)型酶組合物的形成包括，將脂質(zhì)功能化碳納米管、富勒烯 和/或石墨烯例如脂質(zhì)功能化SWCNT與至少一種嗜冷酶、嗜溫酶或其組合相組合，并聲波處 理該組合（combination)。脂質(zhì)功能化碳納米管（或石墨烯或富勒烯）在聲波處理后會(huì)自 我組裝成"納米籠"。在一些實(shí)施方案中，納米籠的形成截留酶。在一些實(shí)施方案中，至少一 個(gè)納米顆粒也與酶一起被截留于納米籠中。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒與酶被截留于納 米籠中，但是不與酶或納米籠連接。
[0088] 在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯或脂質(zhì)功能化碳納米 管與酶的比例（wt/wt)為6 : 1，或約5 : 1，或約4 : 1，或約3 : 1，或約2 : 1。
[0089] 作為實(shí)例而非限制，在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)功能化SWCNT(0. 5mg/ml)、果膠裂解 酶（0.18mg/ml)、漆酶（0.25mg/ml)、纖維素酶（O.llmg/ml)、木聚糖酶（0.2mg/ml)以及 蛋白酶（〇? 22mg/ml)的量分別為 5x10 3mg、18x10 3mg、25xl0 3mg、11x10 3mg、20xl03mg和 22xl0_3mg。在一些實(shí)施方案中，SWCNT的量為0. 1-l.Omg/ml。在一些實(shí)施方案中，果膠裂解 酶為0. 1-0. 25mg/ml。在一些實(shí)施方案中，漆酶為約0. 15-0. 50mg/ml。在一些實(shí)施方案中， 纖維素酶為.005-0. 4mg/ml。在一些實(shí)施方案中，木聚糖酶為0.lmg/ml至0. 5mg/ml。在一 些實(shí)施方案中，蛋白酶為〇.lmg/ml至0. 5mg/ml。
[0090]IV.使用酶組合物的方法-概述
[0091] 在一些實(shí)施方案中，使至少一種截留酶與至少一種底物接觸。在一些實(shí)施方案中， 接觸在約4°C至約30°C或約8°C至約26°C或約12°C至約22°C或約16°C至約18°C的溫度下 進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸在約4°C、8°C、12°C、16°C、20°C、24°C、28°C或30°C的溫度 下，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸在約〇°C至約4°C 的溫度下進(jìn)行。
[0092] 在一些實(shí)施方案中，接觸在約35°C至約80°C，或約45°C至約70°C，或約55°C至約 60°C的溫度下進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，接觸在約35°C、37°C、40°C、42°C、45°C、50°C、55°C、 60°C、65°C、70°C、75°C或80°C的溫度，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍進(jìn)行。
[0093] 在一些實(shí)施方案中，接觸進(jìn)行約1. 5小時(shí)至約7小時(shí)，或約2小時(shí)至約6. 5小時(shí)， 或約3小時(shí)至約6小時(shí)，或約3. 5小時(shí)至約5. 5小時(shí)，或約4小時(shí)至約5小時(shí)。在一些實(shí)施 方案中，接觸的持續(xù)時(shí)間為約1. 5小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)或7小時(shí)，或?yàn)?這些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍。在一些實(shí)施方案中，截留酶酶活性的持續(xù)時(shí)間為約12 小時(shí)、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天，或?yàn)檫@些數(shù)值中任意兩個(gè)之間的范圍。
[0094] 在一些實(shí)施方案中，與對(duì)照酶相比，當(dāng)用于多重反應(yīng)時(shí)，截留酶維持高酶活性。使 用截留酶的多重反應(yīng)的實(shí)例如下：1)使至少一種截留酶與多于一種底物接觸第一反應(yīng)過 程的持續(xù)時(shí)間；2)在第一反應(yīng)過程完成后，收集截留酶；以及3)隨后將收集的截留酶用于 第二反應(yīng)過程。在第二反應(yīng)過程中，截留酶維持高水平的酶活性，這可以通過百分比相對(duì)活 性來測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，將截留酶用于一個(gè)反應(yīng)，或兩個(gè)反應(yīng)，或三個(gè)反應(yīng)，或四個(gè)反 應(yīng)，或五個(gè)反應(yīng)，或六個(gè)反應(yīng)中。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)運(yùn)行反應(yīng)。
[0095] 在一些實(shí)施方案中，當(dāng)再用于第二反應(yīng)中時(shí)，截留酶保留其約85%至約99%的酶 活性。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)再用于第三反應(yīng)中時(shí)，截留酶保留其約80%至約99%，或約 80%至約95%酶活性。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)再用于第四反應(yīng)中時(shí)，截留酶保留其約60% 至約99%，或約60%至約85%的酶活性。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)再用于第五反應(yīng)中時(shí)，截留 酶保留其約60%至約99%，或約60%至約75%酶活性。
[0096]V.試劑盒
[0097] 在一些實(shí)施方案中，將截留酶組合物提供于試劑盒中。在一些實(shí)施方案中，試劑盒 包括具有至少一種截留酶組合物的容器，其中截留酶組合物包括至少一種截留于脂質(zhì)功能 化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒烯、脂質(zhì)功能化碳納米管或其組合但不與其連接的酶。在一些實(shí) 施方案中，截留酶組合物包括納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒與酶接觸，但不與酶 連接。在一些實(shí)施方案中，納米顆粒與納米籠接觸，但不與納米籠連接。在一些實(shí)施方案中， 試劑盒還包括應(yīng)用酶組合物處理廣泛多種有機(jī)和無機(jī)底物的說明書。
[0098] 在可選的實(shí)施方案中，試劑盒包括具有多種脂質(zhì)功能化石墨烯、脂質(zhì)功能化富勒 烯、脂質(zhì)功能化碳納米管或其組合的第一容器和具有至少一種酶的第二容器。在一些實(shí)施 方案中，試劑盒包括至少一個(gè)納米顆粒的第三容器。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括制 備截留酶組合物的說明書。
[0099] 在一些實(shí)施方案中，酶是嗜冷酶、嗜溫酶或其組合中的一種或多種。嗜冷酶包括但 不限于果膠酶、漆酶、纖維素酶以及木聚糖酶。嗜溫酶包括但不限于蛋白酶。
[0100] 在一些實(shí)施方案中，碳納米管包括但不限于單壁碳納米管、雙壁碳納米管或多壁 碳納米管。在一些實(shí)施方案中，碳納米管為用脂質(zhì)功能化的固態(tài)。
[0101]納米顆粒包括但不限于氧化亞銅、羥磷灰石（HAp)、氯化鎂、氯化錳、氯化鈣或其組 合。
[0102] IV.本文公開的酶組合物的示例性用途
[0103] A.微生物熱穩(wěn)定酶的示例性用途-概述
[0104] 在升高的溫度下運(yùn)行生物技術(shù)過程具有許多優(yōu)勢(shì)。在一些過程中，溫度的增加能 夠?qū)τ袡C(jī)化合物的生物有效度和溶解度有顯著影響。例如，溫度的升高可以伴隨有機(jī)化合 物伴隨粘度的降低和擴(kuò)散系數(shù)的增加。因此，本公開的熱穩(wěn)定酶組合物可以用于這類過程。 作為實(shí)例而非限制，化學(xué)煮漂（chemicalscouring)是一個(gè)本發(fā)明的熱穩(wěn)定酶具有價(jià)值的 過程。下文討論了熱穩(wěn)定酶的許多其他示例性用途。
[0105] 用于化學(xué)煮漂過程中的強(qiáng)烈的、危險(xiǎn)化學(xué)品，如蘇打灰、草酸、苛性鈉，造成環(huán)境污 染，并弱化經(jīng)歷煮漂過程的產(chǎn)品的纖維強(qiáng)度（例如羊毛）。
[0106] 就工業(yè)規(guī)模而言，化學(xué)煮漂是常見的。所述過程通過從許多天然纖維中除去非纖 維質(zhì)物質(zhì)而改善了織物的吸水性和白度。
[0107] 不管為生物煮漂過程使用酶例如漆酶的利益如何，目前使用的酶都具有缺少煮漂 效率的弊端。缺少煮漂效率可能由酶的熱不穩(wěn)定性和低活性造成。由于熱誘導(dǎo)的酶構(gòu)象的 變化，熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致酶活性隨時(shí)間降低。較高的溫度加速活性降低。低活性限制了煮漂 發(fā)生的速率。利用本發(fā)明的組合物能夠提高煮漂效率，因?yàn)槿绫疚乃觯雒傅臒岱€(wěn)定 性和酶活性提高。
[0108] B.微生物冷穩(wěn)定酶的示例性用途-概述
[0109] 嗜冷酶在低溫和中等溫度下的高活性提供了潛在的經(jīng)濟(jì)效益，例如通過在不需要 昂貴的反應(yīng)器加熱的大規(guī)模過程中節(jié)省大量能量。嗜冷酶也可以用于家庭過程。例如，在 低溫下洗滌衣服能保護(hù)紡織品的顏色（并降低能量消耗）。在食品工業(yè)，它們的特性允許熱 敏感產(chǎn)品轉(zhuǎn)化或精煉，例如，冷活性果膠酶在低溫下能有助于降低粘度并澄清果汁。這些酶 的熱易變性也確保在復(fù)合混合物中它們快速、有效且選擇性地失活。
[0110] 已經(jīng)提出，當(dāng)內(nèi)源微生物區(qū)系的降解能力受到低溫削弱時(shí)，在溫帶國(guó)家，在冬季用 嗜冷微生物生物修復(fù)污染的突然和廢水。
[0111]除了可以在要求快速和溫和失活處理的多步驟過程中應(yīng)用的冷適應(yīng)酶的結(jié)構(gòu)易 變性外，由于其在低溫和中等溫度下增強(qiáng)的選擇性和高催化活性，冷適應(yīng)酶也是有利的。此 夕卜，冷適應(yīng)酶固有的構(gòu)象可塑性，特別適合許多精細(xì)化學(xué)品和藥用中間體生產(chǎn)過程中所用 的低水條件下的有機(jī)合成應(yīng)用。
[0112]C.本發(fā)明酶組合物的一般用途
[0113] 低溫、中等溫度和以及高溫下本發(fā)明的處理的酶組合物的高活性，提供了潛在的 經(jīng)濟(jì)效益，例如通過在不需要昂貴的反應(yīng)器加熱的大規(guī)模過程中節(jié)省大量能量。處理的酶 組合物也可以用于家庭過程。例如，在低溫下洗滌衣服可以保護(hù)紡織品的顏色（并降低能 量消耗）。在食品工業(yè)，它們的特性允許轉(zhuǎn)化或精煉熱敏感產(chǎn)品，例如冷活性果膠酶在低溫 下能有助于降低粘度并澄清果汁。
[0114] 當(dāng)內(nèi)源微生物區(qū)系的降解能力受到低溫削弱時(shí)，在溫帶國(guó)家，在冬季，也可以用本 發(fā)明的處理的酶組合物生物修復(fù)污染的土壤和廢水。
[0115] 除了可以在要求快速和溫和失活處理的多步驟過程中應(yīng)用的冷適應(yīng)酶的結(jié)構(gòu)易 變性外，由于其在低溫和中等溫度下增強(qiáng)的選擇性和高催化活性，本發(fā)明的處理的酶組合 物也是有利的。此外，冷適應(yīng)酶固有的構(gòu)象可塑性，特別適合許多精細(xì)化學(xué)品和藥用中間體 生產(chǎn)過程中所用的低水條件下的有機(jī)合成應(yīng)用。
[0116] 本發(fā)明的酶組合物能夠用于多種目的。例如，酶組合物為在工業(yè)處理溫度下木質(zhì) 纖維素物質(zhì)的分解提供了強(qiáng)健的催化可選方案。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可 以用于纖維和棉花的生物漂白。在紡織工業(yè)和造紙工業(yè)，酶組合物可以用于環(huán)境友好的方 法中。在一些實(shí)施方案中，酶組合物可以用于處理含有酚類、芳基胺、聯(lián)氨物質(zhì)以及紡織品 染料試劑的工業(yè)廢水中。在一些實(shí)施方案中，酶組合物可以用于工業(yè)廢液的脫毒。在一些 實(shí)施方案中，酶組合物可以用于天然韌皮纖維（例如大麻和亞麻）和棉花纖維的慪麻或生 物煮漂。在一些實(shí)施方案中，酶組合物可以用作生物修復(fù)的有效工具。
[0117] 例如，在一些實(shí)施方案中，通過使底物接觸組合物和/或用組合物孵育底物，酶組 合物可以用于處理所述底物，其中所述底物包括酚羥基。在一些實(shí)施方案中，底物包含偶氮 基。在一些實(shí)施方案中，底物包含syrilgaldazine、剛果紅、棉藍(lán)、溴酚藍(lán)、孔雀綠。在一些 實(shí)施方案中，底物包含鄰二苯酚和對(duì)二苯酚、氨基酚、多酚、聚胺、木質(zhì)素和/或芳基二胺。 在一些實(shí)施方案中，底物包含紡織品、羊毛、生物復(fù)合材料、廢水、紙、木漿、土壤、動(dòng)物飼料、 食品、飲料、除草劑、殺蟲劑、染料、顏料或其組合。在一些實(shí)施方案中，底物包含木漿，所述 木漿包含木質(zhì)素。
[0118] 在一些實(shí)施方案中，底物包含染料或顏料，其中酶與染料或顏料反應(yīng)，并減少底物 的顏色或使底物脫色。在一些實(shí)施方案中，底物包括包含染料的紡織品，其中酶與染料或顏 料反應(yīng)，并減少紡織品的顏色或使紡織品脫色。在一些實(shí)施方案中，底物包括包含酚類化合 物的飲料，其中酶與酚類化合物反應(yīng)，并從飲料中減少或除去褐色或煙霧。在一些實(shí)施方案 中，飲料選自果汁、啤酒或葡萄酒。
[0119] 在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含漆酶的酶組合物通過將酚類底物的酚羥基 催化為苯氧自由基，同時(shí)將分子氧（〇 2)還原為水，可以作用于底物。酶氧化技術(shù)在各種工 業(yè)領(lǐng)域中具有潛力，包括紙漿造紙工業(yè)、紡織品工業(yè)以及食品工業(yè)。
[0120] 在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含果膠酶的酶組合物具有廣泛多種用途。作為 實(shí)例而非限制，這類酶組合物可以用于食品加工和用于催化導(dǎo)致食品質(zhì)量改善的化學(xué)反 應(yīng)。本文公開的包含果膠酶的酶組合物在紙漿造紙工業(yè)、紡織品工業(yè)、果汁工業(yè)等中具有若 干用途。
[0121] 在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含纖維素酶的酶組合物可用于各種工業(yè)，包括 紙漿造紙、紡織品、洗衣店、生物燃料生產(chǎn)、食品和飼料工業(yè)、釀造以及農(nóng)業(yè)。由于酶系統(tǒng)的 復(fù)雜性和巨大工業(yè)潛力，纖維素酶已經(jīng)成為學(xué)術(shù)研究團(tuán)體和工業(yè)研究團(tuán)體進(jìn)行研究的潛在 候選對(duì)象。
[0122] 在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含木聚糖酶的酶組合物可以用于生物技術(shù)；示 例性用途包括木漿的生物漂白，處理動(dòng)物飼料以增加可消化性，處理食品以增加凈化以及 將木質(zhì)纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為原料和燃料。
[0123] 在一些實(shí)施方案中，本文公開的包含蛋白酶的酶組合物是有用的水解組合物，并 可用于去污劑、食品、藥物、皮革、診斷、廢物管理以及銀回收。在一些實(shí)施方案中，蛋白酶是 細(xì)菌蛋白酶。
[0124] 下文提供了本發(fā)明酶組合物的示例性非限制性實(shí)例。
[0125] D.去污劑和清潔產(chǎn)品
[0126] 在一些實(shí)施方案中，本文公開的酶組合物可以用作去污劑。在一些實(shí)施方案中，去 污劑在低溫下有效水解泥土和污點(diǎn)，由此降低能量消耗，這使得相關(guān)費(fèi)用和環(huán)境影響降低。 另外，在溫水-熱水洗滌循環(huán)中發(fā)生的衣服改變，例如織物降解、收縮和滲色會(huì)減少。鑒于 特別是在歐洲和日本降低洗滌溫度的趨勢(shì)，本發(fā)明的酶組合物能在低溫至中等溫度條件下 在去污劑中有效發(fā)揮作用。
[0127] 例如，在一些實(shí)施方案中，酶組合物包含纖維素酶，且酶組合物用于產(chǎn)生基于纖 維素酶的去污劑。包含本發(fā)明的嗜冷纖維素酶酶組合物的基于纖維素酶的去污劑，具有優(yōu) 異的清潔作用而不損害纖維，提高色彩亮度和污垢去除，除去棉花纖維中粗糙的突起，并提 供油墨顆粒的反再沉淀。
[0128] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白酶組合物可用于去污劑中，這是由于它們能幫 助除去蛋白質(zhì)污點(diǎn)并實(shí)現(xiàn)常規(guī)去污技術(shù)不能獲得的獨(dú)特的效果。例如，在一些實(shí)施方案中， 包含本公開的蛋白酶組合物的去污劑具有改善的性/價(jià)比、提高的活性以及改善的與其他 去污劑成分的相容性。
[0129] E.紙產(chǎn)品和造紙
[0130] 在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的酶組合物用于造紙。紙漿廠和造紙廠正使用酶來 解決它們制造過程中的問題。造紙本質(zhì)上是連續(xù)的過濾過程，其中，纖維、纖維片段（細(xì)料） 以及無機(jī)填充顆粒如粘土的稀釋懸浮液。在這些多糖中，突出的是果膠或聚半乳糖醛酸。聚 半乳糖醛酸復(fù)合陽離子多聚體的能力（陽離子需求量）強(qiáng)烈取決于它們的聚合程度，半乳 糖醛酸的單體、二聚體和三聚體不引起可測(cè)量的陽離子需求量，但是六聚體和長(zhǎng)鏈具有高 陽離子需求量。本公開的果膠酶組合物例如可以用于解聚半乳糖醛酸的多聚體，并隨后降 低果膠溶液的陽離子需求量和過氧化氫漂白的濾液。
[0131] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于生產(chǎn)日本紙（Japanesepaper)。例如 由芽孢桿菌（Bacillussp.)和胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwiniacarotovora)所產(chǎn)生的本發(fā) 明的堿性果膠酶組合物，由于其強(qiáng)浸漬活性，可用于Mitsumata韌皮的慪麻。這些慪麻的韌 皮用來制備日本紙。在一些實(shí)施方案中，來自利用本公開的組合物進(jìn)行細(xì)菌慪麻的紙漿的 強(qiáng)度，與通過常規(guī)蘇打粉蒸煮方法獲得的強(qiáng)度一樣高。由這種木漿制備的紙張非常一致并 且摸起來柔軟。
[0132] 紙的工業(yè)制備包括木漿木質(zhì)素的分離和降解。環(huán)境憂慮集中于替換污染的基于氯 的傳統(tǒng)去木質(zhì)化/漂白程序。因此，本公開的素嗜冷解木質(zhì)素（降解木質(zhì)素）酶（漆酶） 組合物可用于（預(yù)）處理木質(zhì)纖維素原材料，如制漿中的木屑；這稱為生物制漿。利用本 發(fā)明的酶組合物的生物制漿適用于機(jī)械紙漿和化學(xué)紙漿；優(yōu)點(diǎn)包括在整個(gè)機(jī)械制漿過程中 降低精煉能量或增加研磨生產(chǎn)能力，并增強(qiáng)紙強(qiáng)度特性、減輕樹脂問題、提高產(chǎn)量以及減少 機(jī)械和化學(xué)制漿以及造紙中的環(huán)境影響。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可以用于 紙的工業(yè)制備。例如，本文公開的嗜冷漆酶組合物可以用于在制造復(fù)合材料的過程中活化 纖維板木質(zhì)素，從而使得纖維板具有良好的機(jī)械特性，而無需毒性合成粘合劑。在一些實(shí)施 方案中，本發(fā)明的漆酶組合物可以用于將各種酚酸嫁接于牛皮紙漿纖維上。另外，本公開的 嗜冷木聚糖酶酶組合物可以用于除去牛皮紙漿中的殘留木質(zhì)素。來自牛皮紙漿制造法的殘 留木質(zhì)素在物理和化學(xué)上受到半纖維素的限制。木質(zhì)素可以與半纖維素連接，并且已經(jīng)從 牛皮紙漿中分離出木質(zhì)素碳水化合物復(fù)合物。半纖維素是木聚糖酶的底物。
[0133] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可應(yīng)用于生產(chǎn)紙漿和紙。例如，本文公開的 纖維素酶組合物可用作以下中的共添加劑（co-additive):紙漿漂白；生物機(jī)械制漿；改善 排水；酶法脫墨；減少能量需要；減少氯需要；改善纖維亮度、強(qiáng)度特性以及紙漿游離度和 清潔度；改善造紙廠的排水；生產(chǎn)生物可降解紙板、紙巾以及衛(wèi)生紙。
[0134] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可用于減少造紙工業(yè)環(huán)境污染。例如，在傳 統(tǒng)紙漿漂白過程中產(chǎn)生的氯化的酚類化合物以及多氯化的聯(lián)苯，有毒且對(duì)生物降解由高抗 性，并構(gòu)成環(huán)境污染主要來源之一。本公開的木聚糖酶組合物可以用于無氯木漿漂白過程。
[0135] F?廢水和廢水處理
[0136] 造紙廠和紙漿廠、基于糖蜜的酒廠、制革廠、染料生產(chǎn)單位和紡織品是一些生產(chǎn)并 排放深顏色廢液的大型工業(yè)。除了產(chǎn)生審美學(xué)上不可接受的土壤和水體的強(qiáng)烈著色外，這 些工業(yè)廢液中的每一種廢液都產(chǎn)生一些特定問題。它們阻礙光通過水生系統(tǒng)的深層，導(dǎo)致 光合作用停止，導(dǎo)致厭氧條件，這反過來導(dǎo)致水生生命死亡，從而造成惡臭的有毒水。
[0137] 近年來，工業(yè)廢液造成的污染問題已經(jīng)增加。通常，染色過程的產(chǎn)量較低，且廢 液中喪失的染料的百分比可以高達(dá)50%。例如，紡織品染料廢液是復(fù)合物，含有廣泛多種 染料、從纖維提取的天然雜質(zhì)，以及其他產(chǎn)品，如分散劑、均化劑、酸、堿、鹽，并且經(jīng)常含有 重金屬。通常，廢液著色深，同時(shí)生物需氧量（B0D)、懸浮固體（SS)、毒性以及化學(xué)需氧量 (C0D)高，它的導(dǎo)電性高，并且本質(zhì)上是堿性的。染料的降解產(chǎn)物經(jīng)常是致癌的。為了滿足 嚴(yán)格的環(huán)境規(guī)制，必須在將廢水排放到環(huán)境之前對(duì)其進(jìn)行處理。目前，處理染料廢水的大多 數(shù)現(xiàn)有方法都是無效的且不經(jīng)濟(jì)。因此，開發(fā)基于上文所述的包含漆酶的組合物的方法似 乎是有吸引力的解決方案，這是由于它們降解多種化學(xué)結(jié)構(gòu)的染料的潛力，包括目前工業(yè) 上使用的合成染料。本發(fā)明的酶組合物，例如包含漆酶的組合物，能通過自由基偶聯(lián)催化氯 酚的聚合，使含有氯酚的廢水脫毒。通過沉淀，可以從廢水中除去偶聯(lián)產(chǎn)物。氯酚也可以與 廢水中存在的其他酚交叉偶聯(lián)并沉淀，這可以提高它們的除去效率。
[0138] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于處理果膠廢水。來自柑桔加工業(yè)的廢 水含有僅在活性污泥處理過程中被微生物分解的果膠物質(zhì)。因此，本發(fā)明的含有果膠酶的 酶組合物可以用于處理果膠廢水。
[0139] G.食品、飲料、詞料工業(yè)、藥品以及化妝品
[0140] 在一些實(shí)施方案中，本文公開的酶組合物對(duì)于食品加工特別有吸引力，這是由于 它們?cè)谑沟梦兜篮蜖I(yíng)養(yǎng)價(jià)值損壞和改變最下化的溫度下的高催化活性。一旦獲得希望的產(chǎn) 品，它們固有的低結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也促進(jìn)失活。
[0141] 本發(fā)明的酶組合物在低溫和環(huán)境溫度下表現(xiàn)出高催化活性，并且還可以用于制藥 工業(yè)。光學(xué)純藥物和醫(yī)藥中間體的需求增加，已經(jīng)導(dǎo)致有機(jī)合成過程中生物催化劑使用的 快速擴(kuò)張。
[0142] 在化妝品工業(yè)中，本發(fā)明的嗜冷酶組合物能提高涉及揮發(fā)性底物的生物轉(zhuǎn)化收 率，例如經(jīng)受高溫下蒸發(fā)的風(fēng)味和香料化合物。
[0143] 作為實(shí)例而非限制，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可以用于提高或修飾 食品、動(dòng)物飼料或飲料的色表的過程中。本發(fā)明的酶組合物可用于除去不希望的酚類物質(zhì)， 酚類物質(zhì)是清澈的果汁、啤酒和葡萄酒中褐變、煙霧形成以及發(fā)生渾濁的原因。在一些實(shí)施 方案中，酶組合物用于食品工業(yè)的不同方面，例如生物修復(fù)、飲料加工、抗壞血酸測(cè)定、甜菜 果膠凝膠化、烘烤以及，用作生物傳感器。
[0144] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于咖啡和茶葉發(fā)酵。例如，果膠酶在咖啡 和茶葉發(fā)酵中發(fā)揮重要作用。利用分解果膠的微生物使咖啡發(fā)酵，以從咖啡豆中除去粘液 包被。為了除去咖啡豆的果肉層，經(jīng)常添加果膠酶，果肉層的四分之三由果膠物質(zhì)構(gòu)成。
[0145] 真菌果膠酶也用于生產(chǎn)茶。盡管必須小心調(diào)整酶量以避免損害茶葉，但是酶處理 加速茶葉發(fā)酵。果膠酶的添加通過破壞茶葉果膠還改善速溶茶粉的泡沫形成性。
[0146] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可以用于發(fā)酵。例如，纖維素酶可以用于改 善麥芽制造和打漿；改善葡萄的壓榨和取色；改善葡萄酒的香味；改善啤酒的初發(fā)酵和質(zhì) 量；改善葡萄酒的粘度和可濾性；提高葡萄酒生產(chǎn)過程中必須的凈化；提高過濾速度惡化 葡萄酒的穩(wěn)定性。
[0147] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可以應(yīng)用于食品生產(chǎn)。例如，纖維素酶在以 下方面發(fā)揮作用：從水果和蔬菜渣中是否抗氧化劑；提高淀粉和蛋白質(zhì)提取的產(chǎn)量；改善 水果和蔬菜的浸泡、壓榨以及取色；果汁凈化；改善焙烤食品的質(zhì)地和質(zhì)量；改善果泥的粘 度；改善水果和蔬菜的質(zhì)地、風(fēng)味、香味以及揮發(fā)性；控制柑橘類水果的苦味。
[0148] H?生物燃料
[0149] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于制備生物燃料，例如由織物產(chǎn)生的碳 水化合物發(fā)酵制備的乙醇。用本發(fā)明的酶組合物制備的生物燃料代表了能提供大量其他效 益的可再生能源，包括能源安全提高、溫室氣體排放減少、農(nóng)村社區(qū)的經(jīng)濟(jì)利益以及減輕 農(nóng)業(yè)-工業(yè)殘留處理相關(guān)的問題。目前，通過發(fā)酵基于淀粉作為的糖，生產(chǎn)所有染料乙醇， 工業(yè)酶公司正研發(fā)從廉價(jià)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)便宜地生產(chǎn)乙醇的方法，包括農(nóng)業(yè)廢物、林業(yè) 廢物、能源作物以及市政固體廢物。作為實(shí)例而非限制，本發(fā)明的包含冷適應(yīng)糖基水解酶如 纖維素酶、木聚糖酶以及糖苷酶的組合物能實(shí)現(xiàn)劃算的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，因此促進(jìn) 開發(fā)經(jīng)濟(jì)上可行的再生燃料源，以滿足世界增長(zhǎng)的能源需求。
[0150] I?酶納米生物技術(shù)
[0151] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于在低溫和溫和條件下合成納米結(jié)構(gòu)的 材料。這為傳統(tǒng)合成技術(shù)提供了廉價(jià)的、環(huán)境友好的可選方案。
[0152] J.使用漆酶的示例性應(yīng)用
[0153] 漆酶能作用于大范圍的底物。其能氧化酚類木質(zhì)素和非酚類木質(zhì)素相關(guān)化合物以 及高頑抗性環(huán)境污染物，這使得它們對(duì)于若干生物技術(shù)過程的應(yīng)用非常有用。這類應(yīng)用包 括使主要來自造紙工業(yè)和紙漿工業(yè)、紡織品工業(yè)以及石油化學(xué)工業(yè)的工業(yè)廢液脫毒，用作 醫(yī)療診斷工具，以及用作清理土壤中的除草劑、殺蟲劑和某些爆炸物的生物修復(fù)劑。漆酶還 用作某些水純化系統(tǒng)的清潔劑，用作生產(chǎn)抗癌藥物的催化劑，以及甚至用作化妝品的組分。 此外，它們除去生物異源物質(zhì)并產(chǎn)生聚合產(chǎn)物的能力使得它們成為用于生物修復(fù)目的的有 用工具。
[0154] 1.木質(zhì)纖維素物質(zhì)降解中的漆酶
[0155] 本發(fā)明的包含漆酶的酶組合物可用于降解木質(zhì)纖維素物質(zhì)。酶組合物可以用于例 如啟動(dòng)一系列氧化還原反應(yīng)，氧化還原反應(yīng)降解木質(zhì)素（或木質(zhì)素來源的污染物）。酶組合 物可以用于氧化芳香化合物，直到芳香環(huán)結(jié)構(gòu)被切割為止，隨后用其他酶進(jìn)行另外降解。木 質(zhì)纖維素物質(zhì)的分解具有很多工業(yè)應(yīng)用。
[0156] 木質(zhì)纖維素物質(zhì)的酶水解消化沼氣（甲烷）或發(fā)酵乙醇的第一步。就容積價(jià)和市 場(chǎng)價(jià)值而言，乙醇是重要的可再生生物燃料。乙醇的需求具有較大市場(chǎng)，因?yàn)橐掖纪ǔＳ?作化學(xué)原料或用作辛烷增強(qiáng)劑或汽油添加劑。因此，本發(fā)明的酶組合物可用于由木質(zhì)纖維 素物質(zhì)生產(chǎn)乙醇。
[0157] 沼氣是用作汽車燃料或用于產(chǎn)熱和發(fā)電的另一能源。用本發(fā)明的酶組合物預(yù)處理 木質(zhì)纖維素物質(zhì)會(huì)降解木質(zhì)纖維素物質(zhì)并有助于產(chǎn)生乙醇和沼氣。
[0158] 木質(zhì)纖維素分解廢物的生物轉(zhuǎn)化可能明顯有助于有機(jī)化學(xué)品的生產(chǎn)。
[0159] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可用于生產(chǎn)香草醛。香草醛是木質(zhì)素分解 的示例性生物產(chǎn)品。香草醛的最大用途是通常作為甜食的調(diào)味劑。其用于食品香料工業(yè)， 作為許多不同調(diào)料，特別是奶油特征調(diào)料（creamyprofile)的非常重要的基調(diào)（keynote)。 冰淇淋和巧克力工業(yè)共同占據(jù)作為調(diào)味劑的香草醛的75%的市場(chǎng)，較小量的香草醛用于糖 果和烘焙物。香草醛也用于香料工業(yè)、香水中，以屏蔽藥品、牲畜飼料以及清潔產(chǎn)品中令人 不愉快的氣味或味道。在藥物和其他精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)中，已經(jīng)使用香草醛作為化學(xué)中間 體。
[0160] 2.在有機(jī)合成中的漆酶
[0161] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含漆酶的酶組合物可以用于有機(jī)合成中的若干應(yīng) 用中，例如氧化官能團(tuán)，偶聯(lián)酚和類固醇。
[0162] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含漆酶的酶組合物可以用于將酚有氧轉(zhuǎn)化為苯鄰 二酚。苯鄰二酚是殺蟲劑、調(diào)料和香料的前體。約50%的合成苯鄰二酚被殺蟲劑生產(chǎn)消耗， 剩余的用作精細(xì)化學(xué)品如香水和藥物的前體。
[0163] 苯鄰二酚是有機(jī)合成中常用的基礎(chǔ)材料（buildingblock)。幾種工業(yè)上重要的 調(diào)料和香料的制備從苯鄰二酚開始。愈創(chuàng)木酚通過甲基化苯鄰二酚制備，然后轉(zhuǎn)化為香草 醛。苯鄰二酚的相關(guān)一乙基醚即乙基愈瘡木酚（guethol)被轉(zhuǎn)化為乙基香草醛，其是巧克 力糖果的組分。3-反式-異茨基環(huán)已醇（Isocamphylcyclohexanol)，廣泛用作檀香油的替 代品，經(jīng)由愈創(chuàng)木酚和莰酮由苯鄰二酚制備。胡椒醛，具有花香氣味，其由苯鄰二酚的亞甲 基二醚制備，隨后用乙二醛濃縮并脫羧。
[0164] 本發(fā)明的酶組合物可用于氧化酚類化合物（例如酚、多酚、間位取代的酚）、聯(lián)氨 乙基各種利用分子氧的其他組分。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于通過氧化酚 和苯鄰二酚合成醌。醌的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用是用于生產(chǎn)過氧化氫。將2-烷基蒽醌氫化成相 應(yīng)的對(duì)苯二酚（醌茜），其隨后將H2轉(zhuǎn)移給氧。
[0165] 醌的衍生物是生物相關(guān)分子的常見成分（例如維生素K1是葉綠醌）。天然或合成 醌類表現(xiàn)出生物或藥理學(xué)活性，并且其中的一些表現(xiàn)出抗腫瘤活性并具有生物特性，包括 草藥中的一些請(qǐng)求權(quán)。這些應(yīng)用包括瀉劑（sennosdes)、抗微生物劑（大黃酸-和紅根草鄰 醌）、抗腫瘤（大黃素和jugone)、抑制PGE2的生物合成（紫草醌（arnebinone)和紫草呋 喃醌（arnebifuranone))以及抗抗心血管疾?。ǖⅤ?。
[0166] 許多天然和人工著色物質(zhì)（染料和顏料）是醌衍生物。作為染料，它們的重要性 僅僅次于偶氮染料，特別強(qiáng)調(diào)的藍(lán)色。茜草色素（2, 3-二羥基-9,10-蒽醌），提取自茜草屬 植物，是由煤焦油合成的第一種天然染料。
[0167] 3.漆酶在紡織品工業(yè)中的示例性應(yīng)用
[0168] 本發(fā)明的漆酶酶組合物，在較高的溫度下活性增強(qiáng)，可用于羊毛染色、粗紗煮漂 (rove scouring)、羊毛的耐縮處理以及染料合成。
[0169] 在紡織品加工中，本發(fā)明的漆酶酶組合物可用于在漂白過程中提高織物白度，使 染色的紡織品材料和著色的廢液脫色和纖維煮漂，羊毛染色和羊毛抗氈化。本發(fā)明的漆酶 組合物可以用于給之前填充了對(duì)苯二酚的羊毛織物著色。本發(fā)明的漆酶組合物可以用于羊 毛染色。染料浴（dyebath)可以用染料前體（2, 5-苯二胺-磺酸）、染料改性劑（苯鄰二 酚和間苯二酚）以及漆酶制備，而無需任何助染劑。
[0170] 本發(fā)明的漆酶酶組合物可用于降低羊毛織物的氈縮性。提高漆酶的濃度有助于降 低織物收縮。
[0171] 本發(fā)明的漆酶酶組合物可以用于粗紗處理以改善紗線的整齊性。使用漆酶進(jìn)行粗 紗煮漂的優(yōu)點(diǎn)在于，在溫和反應(yīng)條件下進(jìn)行該過程，從而導(dǎo)致該過程在生態(tài)上是友好的。本 發(fā)明的漆酶酶組合物可用于通過3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙（MBTH)與酚的氧化偶聯(lián)形成 偶氮染料。在兩相水-有機(jī)介質(zhì)（hydro-organicmedium)中，漆酶氧化阿魏酸，這導(dǎo)致穩(wěn) 定的黃色產(chǎn)物的產(chǎn)生。
[0172] a.牛仔染整
[0173] 在紡織品染整工業(yè)中，靛藍(lán)的酶降解在石磨水洗過程和染料廢液處理中都有潛 力。在牛仔服裝的制造過程中，在染色和最后石磨水洗之間包括數(shù)個(gè)步驟，其中從織物種除 去過量靛藍(lán)，并將其與廢水一起排放。用次氯酸鈉處理，隨后中和和漂洗步驟，部分漂白織 物，所有這些步驟都引起大量環(huán)境污染。本發(fā)明的酶組合物，例如具有漆酶的酶組合物，可 用于牛仔染整。
[0174] b.棉生物漂白
[0175] 棉漂白的目的是，使天然顏料脫色并賦予纖維純白表觀。黃酮類主要負(fù)責(zé)棉的顏 色。最常見的工業(yè)漂白劑是過氧化氫。然而，漂白劑與纖維的自由基反應(yīng)能使聚合程度降 低，因而導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p害。此外，從纖維中除去過氧化氫需要大量水，這能對(duì)染色造成問題。因 此，用酶漂白系統(tǒng)替代過氧化氫不僅會(huì)由于較少的纖維損害而導(dǎo)致更好的產(chǎn)品質(zhì)量，而且 也會(huì)大量節(jié)省除去過氧化氫所需的洗滌水。
[0176] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于提高對(duì)棉纖維的漂白效果。例如，使用 低濃度的漆酶增強(qiáng)對(duì)棉纖維的漂白效果，這已有報(bào)道。同樣，本發(fā)明的包含漆酶的酶組合物 由于黃酮類的氧化而能提高棉的白度。例如，研究已經(jīng)證明，來自粗毛栓菌（T.hirsuta)的 新分離菌株的漆酶負(fù)責(zé)棉白度提高，這主要是可能是由于黃酮類的氧化所致。此外，足以提 高纖維白度的酶預(yù)處理的短時(shí)間，使得這種生物過程適合連續(xù)運(yùn)作。
[0177] K.使用纖維素酶的應(yīng)用
[0178] 1.農(nóng)業(yè)中的纖維素酶
[0179] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)。植物致病菌和疾病控制；植 物和真菌原生質(zhì)體的生成；種子萌發(fā)增強(qiáng)和根系改善；植物生長(zhǎng)和開花增強(qiáng)；土壤質(zhì)量提 高；對(duì)無機(jī)肥料的依賴性降低。
[0180] 2.生物轉(zhuǎn)化中的纖維素酶
[0181] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可以應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化。例如，將纖維素材料 轉(zhuǎn)化為乙醇、其他溶劑、有機(jī)酸和單細(xì)胞蛋白以及脂質(zhì)；廣生商能動(dòng)物詞料；提商動(dòng)物詞料 的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量；改善反芻動(dòng)物性能；提高飼料消耗和吸收；高質(zhì)量飼料的保存。
[0182] 3.紡織品工業(yè)中的纖維素酶
[0183] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可應(yīng)用于紡織品工業(yè)。例如，牛仔的生物石 磨；紡織品纖維的生物拋光；提高織物質(zhì)量；提高纖維的吸收性；軟化衣服；提高纖維織物 的穩(wěn)定性；從織物種除去過量染料；恢復(fù)顏色亮度。
[0184] 4.使用纖維素酶的其他應(yīng)用
[0185] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物，其中酶是纖維素酶，可用于下述之一： 提高類胡蘿卜素提取；改善類胡蘿卜素的氧化和顏色穩(wěn)定性；提高橄欖油提??；改善橄 欖醬的揉捏法；改善橄欖油的質(zhì)量；降低生物廢物風(fēng)險(xiǎn)；產(chǎn)生雜交分子；產(chǎn)生設(shè)計(jì)纖維體 (designercellulosomes)〇
[0186] L.使用木聚糖酶的示例性應(yīng)用
[0187] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用包含木聚糖酶的酶組合物。示例性用途包括但 不限于木漿的生物漂白、處理動(dòng)物飼料以提高可消化性、加工食品以提高凈化以及將木質(zhì) 纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為原料和染料。
[0188] 1?生物漂白（Bioleaching)
[0189] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物可應(yīng)用于生物漂白。在未完全除去木質(zhì)素 的情況下，按常規(guī)方法將化學(xué)紙漿漂白至較高的亮度，并未成功。按照慣例，漂白使用氯。因 此，本發(fā)明的包括木聚糖酶的組合物用于生物漂白。
[0190] 2.使用木聚糖酶的其他示例性應(yīng)用
[0191] 可應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)的包含木聚糖酶的其他領(lǐng)域包括但不限于用作家禽的食品添 加劑，用于小麥粉中用來改善面團(tuán)處理和烘焙產(chǎn)品的質(zhì)量，提取咖啡、植物油以及淀粉，提 高農(nóng)業(yè)青貯飼料和谷物飼料的營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)，以及與果膠酶和纖維素酶組合物組合物用于澄清 果汁和使植物纖維源如亞麻、大麻、黃麻以及苧麻脫膠。
[0192] M.使用果膠酶的示例性應(yīng)用
[0193] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的果膠酶酶組合物用于水果和紡織品工業(yè)。本發(fā)明的 果膠酶酶組合物將植物組織的復(fù)雜多糖分解為較簡(jiǎn)單的分子如半乳糖醛酸。在一些實(shí)施方 案中，本發(fā)明的酸性果膠酶酶組合物可用于降低果汁的渾濁和苦味。在一些實(shí)施方案中，本 發(fā)明的酸性果膠酶酶組合物可用于紡織品工業(yè)，用來使纖維作物慪麻和脫膠，產(chǎn)生質(zhì)量良 好的紙，使咖啡和茶葉發(fā)酵，用油提取和處理果膠廢水。
[0194]果膠裂解酶是堿性酶。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的果膠裂解酶酶組合物用于使 纖維作物脫膠和慪麻并預(yù)處理果汁工業(yè)的果膠廢水。通常，這些酶主要來自細(xì)菌來源。在 工業(yè)部門，將主要來自芽孢桿菌（Bacillussp.)的本公開的堿性果膠酶組合物應(yīng)用于下述 目的：
[0195] 1.纖維作物的慪麻和脫膠
[0196] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于纖維作物的慪麻和脫膠。例如，水解果 膠的酶涉及黃麻、亞麻、大麻、芒麻、洋麻（Hibiscussativa)以及椰子殼的椰皮纖維的慪麻 和脫膠。慪麻是發(fā)酵過程，其中某些細(xì)菌（例如梭菌（Clostridium)、芽孢桿菌（Bacillus)) 和某些真菌（例如曲霉（Aspergillus)、青霉（Penicillium))分解樹皮的果膠，并釋放纖 維。
[0197] 苧麻纖維是卓越的天然紡織品，但是去殼的苧麻纖維含有20±35%苧麻樹膠，其 主要由果膠和半纖維素構(gòu)成；因此，為了滿足紡織品的需要，必須使纖維脫膠。
[0198] 2.油提取
[0199] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶組合物用于油提取。來自油菜籽（卡諾拉 (canola))、椰子胚芽、葵花子、棕櫚、果仁以及橄欖的油，傳統(tǒng)上通過用有機(jī)溶劑提取而產(chǎn) 生。最常用的溶劑是己烷，其是潛在的致癌物質(zhì)。細(xì)胞壁降解酶，包括果膠酶，可以用于通 過液化含油作物的結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁組分，在含水過程中提取植物油。 實(shí)施例
[0200] 通過下述實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明，無論如何，不應(yīng)當(dāng)將下述實(shí)施例解釋為限 制。
[0201] 實(shí)施例1.將酶截留于碳納米管中在低淵和高淵下提高酶動(dòng)力學(xué)
[0202] 將分離的細(xì)菌酶截留于脂質(zhì)功能化SWCNT中。于4°C、30°C以及80°C下測(cè)試截留 酶的動(dòng)力學(xué)，并將其與未截留的酶的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行比較。
[0203] 方法和材料
[0204]SWCNT、Cu20以及羥磷灰石（HAp)納米顆粒購(gòu)自SIGMA-ALDRICH(登陸號(hào)分別為： 678945,702153)〇
[0205] 十壤細(xì)菌分泌的工業(yè)酶的分離
[0206] 水解果膠的細(xì)菌、分泌漆酶的細(xì)菌、水解纖維素的細(xì)菌以及分泌木聚糖酶的細(xì)菌 分離自喜馬拉雅山的森林土壤，其高于海平面3800米。水解蛋白的細(xì)菌分離自森林土壤。
[0207] 利用"釕紅"法分離了水解果膠的細(xì)菌菌株。在這種方法中，在YP瓊脂平板上形 成了數(shù)個(gè)細(xì)菌菌落。用釕紅溶液淹沒YP平板。表現(xiàn)出光環(huán)的菌落被鑒定為水解果膠的菌 株。
[0208] 用"丁香醛連氮"方法分離了分泌漆酶的細(xì)菌菌株。在LPA平板上形成了細(xì)菌菌 落，用丁香醛連氮溶液淹沒所述細(xì)菌菌落。形成紫色著色的細(xì)菌菌落被鑒定為分泌漆酶的 細(xì)菌。
[0209] 利用"酪蛋白"方法分離了水解蛋白的細(xì)菌菌株。使細(xì)菌菌落生長(zhǎng)于瓊脂偶氮酪 蛋白平板上。表現(xiàn)出白色沉淀帶的菌落被鑒定為分解蛋白的細(xì)菌菌株，白色沉淀帶表示酪 蛋白分解。
[0210] 利用"剛果紅"方法分離了分泌木聚糖酶的細(xì)菌菌株。使細(xì)菌菌落生長(zhǎng)于木聚 糖-瓊脂平板上。用剛果紅溶液淹沒在木聚糖瓊脂平板上形成的細(xì)菌菌落。形成光環(huán)的細(xì) 菌菌落被鑒定為分泌木聚糖酶的細(xì)菌。
[0211] 利用"剛果紅"方法分離了水解纖維素的細(xì)菌菌株。使細(xì)菌菌落生長(zhǎng)于CMC瓊脂 平板上。用剛果紅溶液淹沒形成于CMC瓊脂平板上的細(xì)菌菌落。形成光環(huán)的細(xì)菌菌落被鑒 定為分泌木聚糖酶的細(xì)菌。
[0212] 除了在37°C下培養(yǎng)水解蛋白的細(xì)菌外，將細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)于20°C。
[0213] 酶的部分鈍仆,
[0214] 利用兩個(gè)連續(xù)過程將果膠酶部分純化。首先利用離子交換層析（CM瓊脂糖），接著 利用凝膠過濾層析（SephadexG-75)。
[0215] 利用是三個(gè)連續(xù)過程將漆酶部分純化。首先利用30-80 %硫酸銨切割方法 (ammoniumsulphatecutmethod),隨后利用離子交換層析（CM瓊脂糖，最后利用凝膠過濾 層析（SephadexG-75).
[0216] 利用是三個(gè)連續(xù)過程將蛋白酶純化。首先利用30-80%硫酸銨切割方法，隨后利用 離子交換層析（CM瓊脂糖），最后利用凝膠過濾層析（SephadexG-50)。
[0217] 利用兩個(gè)連續(xù)過程將纖維素酶部分純化。首先利用離子交換層析（DEAE cellulose),接著利用凝膠過濾層析（SephadexG-100)。
[0218] 利用兩個(gè)連續(xù)過程將木聚糖酶部分純化。首先利用離子交換層析（CM瓊脂糖），接 著利用凝膠過濾層析（SephadexG-50)。
[0219] 酶活件測(cè)定
[0220] 利用TBA方法，將來自細(xì)菌的果膠酶與聚半乳糖醛酸（PGA)在25mMTris-HCl緩 沖液（pH-8. 5)中、在20°C下孵育2小時(shí)，孵育2小時(shí)后，于550nm測(cè)定紅色的形成。
[0221] 利用丁香醛連氮測(cè)定，測(cè)定漆酶活性，丁香醛連氮測(cè)定測(cè)定525nm下的吸光度。將 lml上清液的適當(dāng)稀釋物添加于3ml25mMTris-HCl緩沖液（pH8. 5)中，并添加2ml底物 丁香醛連氮溶液（甲醇和被二惡烷1 : 2稀釋），以使總測(cè)定系統(tǒng)達(dá)到5ml。從稻草到深粉 紅色或紫羅蘭的即時(shí)顏色變化證實(shí)漆酶活性。該測(cè)定在20°C下進(jìn)行。
[0222] 利用偶氮酪蛋白方法測(cè)定蛋白酶活性。將蛋白酶與1% (w/v)偶氮-酪蛋白于 37°C在25mMpH8. 5的Tris-HCl緩沖液中孵育10分鐘。通過添加4ml5%三氯乙酸終止反 應(yīng)。將內(nèi)容物以3000Xg離心lOmin(分鐘）。取1毫升上清液，通過添加5ml0. 4MNa2C03， 接著添加〇. 5mlFolinsCiocalteus試劑，測(cè)定產(chǎn)物。獲得660nm下樣品的光密度。
[0223] 利用二硝基水楊酸方法，進(jìn)行纖維素酶測(cè)定。取lml培養(yǎng)物濾液置于測(cè)試管中，并 用2ml蒸餾水平衡。向制備的培養(yǎng)物濾液添加3mlDNS試劑。在沸水浴中將測(cè)試管中的內(nèi) 容物加熱5min。加熱后，允許內(nèi)容物在室溫下冷卻。在冷卻時(shí)間，添加7ml新鮮制備的40% 酒石酸鉀鈉溶液。冷卻后，在U.V.分光光度計(jì)中于510nm讀取樣品。利用標(biāo)準(zhǔn)圖形測(cè)定還 原糖的量。
[0224] 1%樺木木聚糖溶液作為底物，測(cè)定木聚糖酶活性，并利用二硝基水楊酸方法測(cè)定 釋放的還原糖的量。酶活性的一個(gè)單位定義為，在給定條件下，每分鐘產(chǎn)生的ImM木糖當(dāng) 量。在U.V.分光光度計(jì)中，于410nm讀取樣品。
[0225]將酶捕獲于SWCNT中
[0226] 參考圖17,下面的內(nèi)容是將酶截留于脂質(zhì)功能化SWCNT100中的抽樣法。
[0227] 首先將多個(gè)SWCNT101與脂質(zhì)102混合。脂質(zhì)與SWCNT的比例（wt/wt)為約5 : 1。 基礎(chǔ)功能化化學(xué)是現(xiàn)有技術(shù)已知的，參見例如Bhattacharyyaetal.，Nanotechnology, 23 (2012) 385304 (8pp)或IP0592/K0L/2012 和PCT/IB2012/001509。簡(jiǎn)而言之，允許兩個(gè)納 米表面在緊密的毛細(xì)管中相互作用。根據(jù)固態(tài)相互作用，只要界面區(qū)發(fā)生反應(yīng)，則界面會(huì)擴(kuò) 散。預(yù)期在界面分子再定位。與固態(tài)化學(xué)反應(yīng)一樣，這一再定位可以視為與擴(kuò)散或易位機(jī) 制偶聯(lián)的納米規(guī)模的反應(yīng)。
[0228] 脂質(zhì)與SWCNT109的連接產(chǎn)生具有極性頭部103和尾部104的SWCNT。脂質(zhì)功能 化SWCNT105可以具有附著于SWCN的一個(gè)末端或SWCN的兩個(gè)末端或的極性頭部。
[0229] 脂質(zhì)功能化SWCNT將自組裝110為"納米籠" 106。
[0230] 將納米籠與酶107混合，并將混合用聲波111處理約2-5分鐘。用于下文實(shí)驗(yàn)的 脂質(zhì)功能化SWCNT的量：酶的量為0. 5mg/mlSWCNT:0. 18mg/ml果膠裂解酶、0. 25mg/ml漆 酶、0?llmg/ml纖維素酶、0? 2mg/ml木聚糖酶以及0? 22mg/ml蛋白酶。
[0231] 聲波處理將納米籠106分解成個(gè)體脂質(zhì)功能化SWCNT105,其位于具有酶107的溶 液中。聲波處理后，脂質(zhì)功能化SWCNT會(huì)自再組裝112。在自再組裝過程中，酶會(huì)被截留于 形成的納米籠108中。
[0232] 為了觀察納米顆粒是否能影響SWCNT捕獲的酶的活性，將酶截留于具有Cu20或 Hap或兩者的SWCNTnanorope籠中，并測(cè)定活性。對(duì)于漆酶而言，Cu20的濃度為0.ImM，對(duì) 于木聚糖酶而言，Hap濃度為13. 2iiM，for對(duì)于果膠裂解酶而言，為17. 6iiM，對(duì)于纖維素酶 而言，濃度為22iiM。
[0233] 允許脂質(zhì)與固態(tài)SWCNT從一端和兩端相互作用。分子再定位發(fā)生于SWCNT和脂質(zhì) 的界面。這些復(fù)合體在目的水或緩沖液（例如lml25mMTris-HCl緩沖液（pH8. 5))中形成 假膠束結(jié)構(gòu)。于40°C，lml25mMTris-HCl緩沖液（pH8. 5)中存在的酶被捕獲于所述結(jié)構(gòu) 的內(nèi)核內(nèi)。在測(cè)定這些SWCNT捕獲的酶的活性后，將復(fù)合體以1000RPM離心5分鐘，隨后進(jìn) 行溫和的聲波處理。離心過程用于從未功能化的SWCNT中純化功能化的SWCNT。聲波處理 后，分子組裝崩潰。聲波處理進(jìn)行2分鐘。當(dāng)在酶存在的情況下允許再組裝時(shí)，復(fù)合體與 40°C下捕獲于所述結(jié)構(gòu)內(nèi)核的酶形成相同的超分子結(jié)構(gòu)（納米籠）。通常，允許組裝再組裝 48小時(shí)。
[0234] 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0235] 酶在工業(yè)過程中的使用經(jīng)常需要高溫和低溫反應(yīng)，以便提高生產(chǎn)力。這反過來暗 示，酶在低溫下是耐受性的。為了洞察純化的果膠酶、漆酶、蛋白酶、纖維素酶以及部分純化 的木聚糖酶對(duì)高溫以及低溫的耐受性，測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)（下文給出）。為了研究酶動(dòng)力學(xué)， 緩沖液（25mMTris-HCl，pH8. 5)不含補(bǔ)充的相應(yīng)鈣離子和銅離子，僅將Hap和Cu20納米顆 粒添加于相應(yīng)測(cè)定體系中。
[0236] Km、Vmax以及活化會(huì)R(Ea)
[0237]計(jì)算Hap處理和未處理的果膠酶、蛋白酶、纖維素酶（cellulose)以及木聚糖酶， 和Cu20納米顆粒處理和未處理的純化的漆酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，即Km、Vmax以及活化能（Ea)。 計(jì)算溫度范圍4-80°C的活化能（Ea)。
[0238] Km衡量酶如何有效結(jié)合底物，即酶與底物之間的親和性。Km小表示結(jié)合緊密，而 Km大則表不結(jié)合較弱。
[0239] Vmax衡量一旦與其酶結(jié)合，底物會(huì)被以何種速率轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。
[0240] Ea是引起化學(xué)反應(yīng)所需的最低能量。
[0241] 結(jié)果
[0242] 與未捕獲的酶相比，脂質(zhì)功能化SWCNT捕獲增強(qiáng)酶-底物特異性，并且降低活化 能。參考表1-3,被納米顆粒（NP)截留于脂質(zhì)功能化SWCNT中的所有酶，與其未捕獲的副 本（無NP)相比，在所有溫度范圍（4°C、30°C和80°C)內(nèi)，都表現(xiàn)出明顯更高的Vmax以及 更低的Km和Ea。這些結(jié)果表明，脂質(zhì)功能化SWCNT截留增強(qiáng)了截留酶的活性，這允許酶在 其正常溫度范圍外高效率發(fā)揮功能。
[0243] 表1. 4°C下的酶動(dòng)力學(xué)
[0244]
【權(quán)利要求】
1. 酶組合物，包含： 一種或多種脂質(zhì)功能化石墨烯或脂質(zhì)功能化富勒烯；和 至少一種酶，所述酶被所述脂質(zhì)功能化石墨烯或脂質(zhì)功能化富勒烯截留但不與其連 接，其中與對(duì)照酶相比，所述組合物中的截留酶的活性增強(qiáng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述截留酶包括漆酶、果膠酶、蛋白酶、纖維素酶 以及木聚糖酶中的一種或多種。
3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述截留酶包括嗜冷酶、嗜溫酶和嗜熱酶中的一 種或多種。
4. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述截留酶增強(qiáng)的活性包括下述中的一種或多 種：增強(qiáng)的pH耐受:性、增強(qiáng)的耐溫性、提1?的半壽期、提1?的Vmax、提1?的Km以及提1?的活 化能（Ea)。
5. 如權(quán)利要求1所述的組合物，還包括多個(gè)納米顆粒，其中所述納米顆粒與所述酶接 觸但不與其連接。
6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述納米顆粒包括羥磷灰石、銅、氯化鎂、氯化錳、 氯化鈣、鋅、鎂以及錳中的一種或多種。
7. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)功能化富勒烯包含至少一個(gè)脂質(zhì)功能化 碳納米管。
8. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述脂質(zhì)功能化石墨烯或脂質(zhì)功能化富勒烯包含 至少一種脂質(zhì)，所述脂質(zhì)包括磷脂、鞘脂、鞘磷脂以及類固醇中的一種或多種。
9. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述一個(gè)脂質(zhì)功能化碳納米管包括單壁碳納米管 (SWCNT)、雙壁碳納米管或多壁碳納米管中的一種或多種。
10. 處理底物的方法，所述方法包括： 使第一底物與酶組合物接觸，所述酶組合物包含： 脂質(zhì)功能化石墨烯或脂質(zhì)功能化富勒烯；和 至少一種截留酶， 其中所述酶被所述脂質(zhì)功能化石墨烯或脂質(zhì)功能化富勒烯截留但不與其連接，且其中 與對(duì)照酶相比，所述酶組合物中的截留酶具有增強(qiáng)的活性。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中： 所述脂質(zhì)功能化富勒烯包含至少一種脂質(zhì)功能化碳納米管，其包括單壁碳納米管 (SWCNT)、雙壁碳納米管或多壁碳納米管中的一種或多種； 所述酶組合物包含多個(gè)納米顆粒，其中所述納米顆粒與所述酶接觸但不與其連接，其 中所述納米顆粒包括羥磷灰石、銅、氯化鎂、氯化錳、氯化鈣、鋅、鎂以及錳中的一種或多種； 以及 所述截留酶包括漆酶、果膠酶、蛋白酶、纖維素酶以及木聚糖酶中的一種或多種。
12. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述接觸在約4°C至約30°C的溫度下進(jìn)行。
13. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述接觸在約35°C至約80°C的溫度下進(jìn)行。
14. 如權(quán)利要求10所述的方法，還包括： 分離所述酶組合物與所述第一底物；和 使第二底物與所述酶組合物接觸。
15. 截留酶的方法，所述方法包括： 使一種或多種脂質(zhì)功能化石墨烯或脂質(zhì)功能化富勒烯和至少一種酶在混合物中、在適 合將所述酶截留于所述脂質(zhì)功能化石墨烯或脂質(zhì)功能化富勒烯中的條件下接觸； 和聲波處理所述混合物。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述截留酶包括嗜冷酶、嗜溫酶以及嗜熱酶中的 一種或多種。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK104342429SQ201410401014
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】A·K·達(dá)斯古普塔, N·杜塔, K·查克拉博蒂, T·巴特查里亞, A·穆霍帕德亞 申請(qǐng)人:加爾各答大學(xué)